CC BY
58
УДК: 57.017.6+612.013+612.68 Козовий Р. В., КовальчукЛ. 6.
ОЦ1НКА ЗНАЧУЩОСТ1 ВПЛИВУ ЧИННИК1В Р1ЗНОГО ^ЕНЕЗУ НА ТРИВАЛ1СТЬ ЖИТТЯ I ДОВГОЛ1ТТЯ
ДВНЗ "1вано-Франшський нацiональний медичний уыверситет"
Обстежено 486 довгожител'в (основна група) та 297 людей вком в'д 36 до 60 роюв, у родоводах яких не було довгожител'в (група порiвняння). Проведено кореля^йний аналiз м/ж бiохiмiчними, цитогенетичними, морфометричними та спектрометричними параметрами досл'джуваних груп. В 'дбрано 29 юльюсних показниюв активностi стану глутатоновоУ системи (ферменти глутатон-S-трансферази, глутатонпероксидази, глутатонредуктази), окисноУ модиф'кацИ бтюв (ОМБ) у сироватц кров¡, функцонального стану геному епiтелюцитiв слизовоУ оболонки порожнини рота, л'мфоцит'т, нейтрофльних гранулоцит'в. Анал'з кореля^й довв важливу роль ферментiв ендогенноУ антиоксидантноУ глутат'1оновоУ системи у пiдтриманнi структурно-функ^ональноУ стаб'тьност'! клтин ! органзму довгожител'в. У основнш груп встановлено прямi дуже сильнi взаемозв'язки мiж ОМБ основного та нейтрального характеру, активн'ютю ферментiв глутат'он^-трансферази, глутатонпероксидази, глутатонредуктази та денситометричними, цитогенетичними ндексами; у людей групи порiвняння виявлено бльш виражену окиснювальну деструкцю бтюв, що зумовлюе велику частоту мiкроядер, хромосомних аберацй, ядер з максимальним ступенем компактизацУУ хроматину, що може бути одною з причин ¡'нкактивацИ' ферментiв глутатоновоУ системи.
Ключов1 слова: кореляц1йний анал1з, довгожител1, глутатюнова система, окиснн модифкацп бтив, структурно-функцюнальний стан геному.
Публ^а^я е фрагментом науково-дослiдноi'роботи "Цитогенетичнi механiзми формування здоров'я населения та розробка заходiв його покращення" (номер держреестрацп 01/3и000768), яка фнансуеться МОЗ УкраУни з коштiв держаного бюджету
Вступ
Остаными роками все бшьша увага придтяеться штинним, цитогенетичним i бiохiмiчним факторам старшня. Це зумовлено тим, що з вком знижуеться стшкють оргашзму до ппоксп ^ як наслщок, розвиваеться ппоксичне порушення гомеостазу [1]. Першочергово змши про- i антиоксидантноУ систем проявляються на кл^инному рiвнi. При старшш вщбуваеться порушення балансу мiж штенсивнютю утворення вшьних радикалiв i активнiстю антиоксидантноУ системи. Оксидантний стрес веде до збтьшення продукци в тканинах активних форм кисню (АФК), що зумовлюе зниження адаптивних можливостей у лiтнiх людей [2]. Посилення перекисного окиснення лт^в (ПОЛ) i бiлкiв (ПОБ) призводить до порушення функцiУ клiтинних мембран, утворення та вщновлення органел, нуклеосомноУ природи хромосомного апарату. Отже, вищеописан процеси пов'язанi зi змiнами структури штин, УУ морфометричних характеристик, а особливо перебудови хроматину, експреси та функци генiв. Останне детермiнуе формування фенотипових ознак, зокрема синтезу полiпептидiв, фермен^в [3].
Тому оцiнка цитогенетичного статусу оргашзму е невщкладною складовою у створенн цшюноУ картини кл^инних аспектiв старiння.
Мета дослiдження
Встановлення взаемозв'язш мiж морфофункцiональними, генетичними,
бiохiмiчними характеристиками рiзних соматичних клiтин довгожителiв, порiвняно з людьми, у родоводах яких не було оаб, що
прожили бтьше 90 рокiв.
Матерiали та методи дослiдження
Об'ектом дослiдження слугували епiтелiоцити слизовоУ оболонки порожнини рота (СОРП), лiмфоцити периферiйноУ кровi (ЛПК), нейтрофiльнi гранулоцити перифершноУ кровi (НГПК), сироватка кровi 486 довгожителiв (основна група) та 297 людей вком вiд 36 до 60 рош, у родоводах яких не було довгожителiв (група порiвняння). Забiр матерiалу,
виготовлення та аналiз препара^в здiйснювали згiдно методик, описаних у наших попередых роботах [4].
Стан глутатюновоУ системи, як компоненту ендогенноУ антиоксидантноУ системи (АОС), оцшювали за активнютю ферментiв глутатюн^-трасферази (ГТ), глутатюнпероксидази (ГП), глутатiонредуктази (ГР). Продукти окисноУ модифкацп бiлкiв (ОМБ) у сироватц кровi дослiджували вiдповiдним методом [О.Ю. Дуб1н1ноУ]. Функцiональний стан геному ештелюципв СОРП, ЛПК та НГПК встановлювали за шдексами хроматизацп (1Х), ядерцевим (Я1), морфологiчно змiнених ядер (МЗЯ), гетерошкнотичноУ Х-хромосоми (СХ). Структуры змши хромосомного апарату визначали за частотою мiкроядер (МЯ) в СОПР, хромосомними абера^ями (ХА), асо^а^ями акроцентричних хромосом (ААХ) у метафазних пластинках ЛПК [5]. З морфометричних параметрiв соматичних кл^ин вибрано площу та периметр ядер, iз спектрометричних - оптичну та штегральну щiльнiсть ядер еттелюцтчв СОРП, ЛПК.
Для кореляцшного аналiзу вiдiбрано 29 ктькюних морфологiчних, генетичних, бiохiмiчних показникiв. Для проведення кореляцшного аналiзу отриманих ктькюних характеристик використано метод С. Н. Лапач i сшвавт. [6].
Результати та 1х обговорен ня
Кореляцiйним аналiзом встановлено наяв-нiсть чотирьох дуже сильних позитивних зв'язмв у довгожителiв (г=0,90). Перший з них - мiж ступенем компактизаци хроматину в ядрах ештелюцтчв СОРП i ЛПК, довiв узгодженiсть процесiв експреси гешв у рiзних клiтинах i достатнш рiвень регуляци бiосинтезу полiпептидiв. Закономiрними виявилися кореляци мiж рiзними фрак^ями ОМБ: ОМБ356 i ОМБ370, ОМБ 356 i ОМБ430, ОМБ370 i ОМБ430. Наявнiсть лише одно! дуже сильно! кореляци (г=0,90-0,99) у представниш контрольно! групи (мiж ОМБ370 i ОМБ430) може свiдчити про виснаження резервно-адаптацiйних
можливостей органiзму [7]. На противагу, у довгожителiв ступiнь окиснювально! деструкцп бтково! молекули порiвняно менший.
Важливу роль у продовженнi тривалост життя вiдiграють, за даними кореляцшного аналiзу, оптимальнi зв'язки мiж ферментами глутатюново! системи i показниками окиснення бшмв. У довгожителiв виявлено п'ять значних кореляцш (г=0,5-0,69), двi з яких обернет. Закономiрним був обернений взаемозв'язок мiж активнiстю ГТ i Гп. Вiдомо, що ГТ бере участь у першому етапi детоксикацп, каталiзуe взаeмодiю ксенобiотикiв з глута^аном. Таким чином ГТ запобiгаe пошкодженню ДНК, мiтохондрiй, iнших життево важливих органел вiд дiТ шкiдливих речовин [8]. Подiбну функцiю виконуе i ГП, який не лише попереджае накопичення гiдроперекисiв, а й активно !х вiдновлюе [9]. Сумюно данi два ферменти гальмують подальше прогресування пероксидацп, поширення неферментних реакцш накопичення вторинних метаболiтiв. Ймовiрно,
однонаправленють дiT ГП i ГТ зумовлюе обернений зв'язок мiж !х активнютю.
Важливим доказом високого рiвня активност детоксикацп ксенобiотикiв у довгожителiв е наявнють двох значних позитивних кореляцш мiж ГП та ступенем конденсацп хроматину в епiтелiоцитах СОРП i ЛПК. Збiльшення в ядрах цих штин евхроматинових фракцiй може зумовлювати активацiю транскрипцп та, вiдповiдно, наступних етатв реалiзацil спадково! шформаци, зокрема, синтезу полтептиду ферменту ГП.
Вiдомо, що окиснювальна деструкцiя бiлкiв -одна з важливих причин шактиваци ферментiв, змши структурно! оргашзаци бiлкiв при стаж окиснювального стресу [10]. Тому вщсутнють значних кореляцiй мiж ОМБ, ферментами глутатюново! системи та цитоморфометричними i денситометричними показниками, на противагу
до таких у контрольнiй групi (11 кореляцш) опосередковано вказуе на високий рiвень ендогенних антиоксидан^в у довгожителiв. Заслуговуе на увагу обернений взаемозв'язок мiж ОМБ530 i максимальною оптичною щiльнiстю ядер СОРП довгожителiв. Переважання нейтральних фракцш ОМБ може спостер^атися в бiлках цитоплазми i кл^инно! мембрани. Змiненi iнтегральнi або перифершш бiлки, якi формують структуру останньо!, не дають змоги фракцiям конденсованого хроматину з'еднуватися з цитолемою. Тому гетерохроматин локалiзуеться окремими грудками в карюплазм^ що збiльшуе показник максимально! оптично! щiльностi ядра.
Порiвняльний аналiз взаемозв'язкiв мiж 29 показниками оаб двох дослiджуваних груп показав, що у довгожителiв кiлькiсть кореляцiй помiрноl сили (г = 0,30-0,49) була меншою (34), нiж у людей контрольно! групи (51). Визначальною особливютю якост зв'язкiв у довгожителiв була участь ферметчв глутатiоново! системи у 44,12 % рiзних кореляцiй. На противагу, у людей групи порiвняння виявлена ттьки одна кореляцiя серед уах (1,96 %), що мала вщношення до ГР -мiж активнiстю ГР та ОМБ356.
Потребують детального пояснення типи взаемозв'язш мiж ферментами глутатiоново! системи та цитоморфометричними i цитогенетичними показниками. Збтьшення периметру ядер за рахунок швапнацш карiолеми, посилення оптично! щiльно! ядер може бути вщображенням гетерохроматизацi!. Це не сприяе синтезу полiпептидiв ^ вiдповiдно, ферментiв ГП i ГТ, на що вказують вщ'емж кореляци мiж зазначеними показниками. Однак, регуля^я експресi! генiв ГП може бути забезпечена за рахунок оптимального контролю сай^в Х-хромосоми, що засвiдчено позитивним взаемозв'язком (г=0,30-0,49). Встановлено також позитивний взаемозв'язок мiж активнiстю ГП та здатнютю акроцентричних хромосом утворювати асо^аци. Вiдомо, що найбiльш iнформативним цитогенетичним показником iмунореактивностi лiмфоцитiв у рiзних фазах всiх видiв iмунно! вщпов^ф в органiзмi людини на момент дослщження е частота ААХ. Це зумовлено тим, що важлива функ^я акроцентричних хромосом полягае в утворенн ядерця. В останьому вiдбуваеться систез рРНК, з яко! в цитоплазмi формуються рибосоми. Окрiм того, з активнютю ядерця пов'язан транспорт рiзних видiв РНК з ядра в цитоплазму. Тобто, активнють бiосинтетичних процеав у клiтинi безпосередньо залежнi вщ функцi! ядерцевих органiзаторiв. Можна припустити, що частота ААХ у лiмфоцитах вщображае функцiональний стан клiтини в передуючш iнтерфазi. При цьому, за нашими даними, цей показник досягав максимуму у людей зртого вку i знижувався в похилому вщк Оскiльки в довгожителiв iмовiрнiсть утворення ААХ бтьша, нiж у людей
групи П0рiвняння, активнють бюсинтетичних процесiв ферменту ГП також вища. Даний факт може бути ще одним доказом функцюнальноТ активност ферменпв глутатюновоТ' системи як складовоТ' ендогенного антиоксидантного захисту в довгожителiв.
Цитогенетичними маркерами достатньоТ' продукцiï ГР i ГТ е встановленi нами позитивна кореляцiя мiж активнiстю ГР та IX i, вщповщно, вiд'емна кореляцiя мiж ГТ i максимальною оптичною щiльнiстю ядра. Гетерохроматиза^я асоцiюеться зi зниженням здатност деспiралiзацiï ДНК та першого етапу експреси гешв [11]. Саме з таких позицш можна розглядати обернет взаемозв'язки мiж максимальною оптичною щтьнютю та IX, позитивы - мiж дiапазоном оптичноТ' щiльностi та IX рiзних соматичних клiтин. Варто зазначити про узгодженють деконденсацiï хроматину з показником СХ у лiмфоцитах, нейтрофтах i епiтелiоцитах СОРП, що засвщчили чотири позитивнi кореляцiï. ТакоТ' уыверсальноТ' оптимально-адекватноТ' взаемодiï мiж активнiстю евхроматину та регулярною функ^ею X-хромосоми не виявлено в оаб контрольно!' групи. У людей, в родоводах яких не було довгожителiв, мiж вищезазначеними
показниками спостер^алися вiд'емнi кореляци. Водночас 17 взаемозв'язш зареестровано мiж ОМБ i денситометричними, цитогенетичними шдексами. Чим бiльше з'являлося ОМБ, тим виражешшими були змiни структури хроматину, ядер. Поява МЯ в лiмфоцитах, епiтелiоцитах сОРп також залежала вщ активностi ОМБ370 та ОМБ430, вщповщно. При цьому достатньоТ' кiлькостi ГР i ГП, як попереджають накопичення гщроперекиав, а ГТ ще й вщновлюе останнi [8], у людей контрольно!' групи не встановлено.
Отже, окиснювальна деструк^я бiлкiв - одна з можливих причин iнкактивацiï ферметчв глутатiоновоï системи, якi належать до ендогенних чинниш АОС. ОМБ зумовлюють змiни структури та функцiï клп"инних компонентiв, що демонструють зростання частоти МЯ, патолопчних ядер, максимально!' оптичноТ' щiльностi ядер, гетерохроматизацiï. Такi процеси супроводжуються дисрегуляторним впливом гетеропiкнотичноï Х-хромосоми у людей похилого вку.
У довгожителiв достовiрно переважала активнiсть ферметчв глутатюновоТ' системи. ГТ знешкоджують сполуки майже вах класiв: рiзнi токсичн речовини, канцерогени, мутагени, цитостатики, пестициди, фарби, лки тощо. Речовини, з'еднан з ГТ, поступово iнактивуються i виводяться не пошкоджуючи клiтину. ГР необхщний для вiдновлення окиснювального глутатюну, а разом iз ГП пщтримують певний рiвень вiдновленого глутатiону.
На противагу до людей похилого вку, у довгожителiв активнiсть ГТ не знижена. Можна припустити, що саме тому в соматичних кл^инах
довгожителiв спостер^алася невелика кiлькiсть змшених мтохондрш, елементiв комплексу Гольдж1 та ендоплазматичноТ сiтки. Пошкодженню цих органел запоб^ала ГТ, що значно збiльшувало стшкють клiтин i цiлого органiзму. Сумюно ферменти глутатюново''' системи попереджають подальше
прогресування пероксидацп, накопичення вторинних метаболтв.
Висновки
1. Кореляцшним аналiзом 29 ктькюних показниш доведено важливу роль ферменпв ендогенноТ антиоксидантноТ глутатюново''' системи у пщтриманш структурно-функцюнально''' стабтьносп клiтин i органiзму довгожителiв.
2. У довгожителiв встановлено прямi дуже сильн взаемозв'язки мiж окисними модифка^ями бiлкiв основного та нейтрального характеру, активнютю ферменпв ГТ, ГП, ГР та денситометричними, цитогенетичними шдексами; у людей групи порiвняння виявлено бтьш виражену окиснювальну деструкцiю бiлкiв, що зумовлюе велику частоту МЯ, ХА, ядер з максимальним ступенем компактизаци хроматину, що може бути одною з причин шкактиваци ферменпв глутатюновоТ' системи.
Перспективи подальших дослщжень у даному напрямку полягають у ктькюному визначеннi внеску ендогенних i екзогенних чинникiв
Лтература
1. Асанов Э.О. Возрастные особенности интенсивности перекисного окисления липидов и состояния антиоксидантной системы при гипоксическом стрессе / Э.О. Асанов, М.В. Беликова // Пробл. старения и долголетия. - 2006. - 15, № 4. -С.285-290.
2. Ткачук С.С. Порiвняльний аналiз впливу двобiчноТ' каротидно'Т шеми-реперфузи на стан окислювально'Т модифкаци бтюв у структурах мозку дорослих та старих щурiв / С.С. Ткачук, Т.1. Бойчук // Клтчна та експериментальна патолопя. - 2010. - Том IX, № 4 (34). - C. 65-69.
3. Delphine Grivet Molecular Footprints of Local Adaptation in Two Mediterranean Conifers / Delphine Grivet, Federico Sebastiani, Ricardo Alia [et al.] //Molecular Biology and Evolution.- 2010. -Vol. 28 (1) - Р. 101-116.
4. Козовый Р.В. Анализ функционального состояния хроматина лимфоцитов периферической крови у долгожителей Прикарпатья / Р.В. Козовый // Фундаментальные исследования.
- 2013. - № 7 (2) - с. 324-327
5. Зерова-Любимова Т.Е., Горовенко Н.Г. Цитогенетичш методи дослщження хромосом людини: Методичш рекомендацп. -Ки'в, 2003. - 24 с.
6. Лапач С.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel / С.Н. Лапач, А.В. Губенко, П.Н. Бабич // 2-е изд., перераб. и доп. - К. : МОРИОН.
- 2000. - 10408 с.
7. Основы шляхи утворення активних форм кисню в нормi та при iшемiчних патолопях (Огляд лп"ератури) / Ю.1. Губський, 1.Ф. Белешчев, С.1. Коваленко [та шш^ // Современные проблемы токсикологии. - 2004. - № 2. - С. 8-15.
8. Власова С.Н. Активность глутатионзависимых ферментов эритроцитов при хронических заболеваниях печени у детей / С.Н. Власова, Е.И. Шабунина, И.А. Переслягина // Лаб. дело. -1990. - № 8. - С. 19-21
9. Ran Q. Reduction in glutathione peroxidase 4 increases life span through increased sensitivity to apoptosis / Q. Ran, H. Liang, Y. Ikeno [et al.] // J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. - 2007. - Vol. 62 (9) - Р. 932-942.
10. Губський Ю.1. Основы шляхи утворення активних форм кисню в нормi та при iшемiчних патолопях (Огляд лп"ератури) / Ю.1. Губський, 1.Ф. Белешчев, С.1. Коваленко [та шш^ // Современные проблемы токсикологии. - 2004. - № 2. - С. 8-15.
11. Lewin's Genes XI. - 11th ed. / Jocelyn Krebs, Stephen Kilpatrick, Ellio Goldstein., Jones and Bartlett Learning. - 2014. - 940 p.
Реферат
ОЦЕНКА ЗНАЧИМОСТИ ВЛИЯНИЯ ФАКТОРОВ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА НА ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ И ДОЛГОЛЕТИЯ
Козовый Р. В., Ковальчук Л. Е.
Ключевые слова: корреляционный анализ, долгожители, глутатионовая система, окислительные модификации белков, структурно-функциональное состояние генома.
Обследовано 486 долгожителей (основная группа) и 297 человек в возрасте от 36 до 60 лет, в родословных которых не было долгожителей (группа сравнения). Проведен корреляционный анализ между биохимическими, цитогенетическими, морфометрических и спектрометрическими параметрами исследуемых групп. Отобрано 29 количественных показателей активности состояния глутатионовой системы (ферменты глутатион^-трансферазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы), окислительной модификации белков (ОМБ) в сыворотке крови, функционального состояния генома эпителиоцитов слизистой оболочки полости рта, лимфоцитов, нейтрофилов. Анализ корреляций доказал важную роль ферментов эндогенной антиоксидантной глутатионовой системы в поддержании структурно-функциональной стабильности клеток и организма долгожителей. В основной группе установлены прямые очень сильные взаимосвязи между ОМБ основного и нейтрального характера, активностью ферментов глутатион-S-трансферазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и денситометрическими, цитогенетическими индексами; у людей группы сравнения выявлено более выраженное окислительное деструкцию белков, обуславливает большую частоту микроядер, хромосомных аберраций, ядер с максимальной степенью компактизации хроматина, может быть одной из причин инкактивации ферментов глутатионовой системы.
Summary
EVALUATION OF SIGNIFICANCE OF FACTORS DIFFERENT GENESIS INFLUENCING ON LIFE SPAN AND LONGEVITY
Kozovy R.V., Kovalchuk L. Ye.
Key words: correlation analysis, long-living persons, glutathione system, oxidative modification of proteins, structural and functional state of the genome.
486 long-living persons (test group) and 297 patients aged from 36 to 60 years who had no long-living blood relatives (control group) were subjected to comprehensive examination. The correlation analysis between biochemical, cytogenetic, morphometric and spectrometric parameters of the groups under the observation was carried out. We selected 29 quantitative indicators for determining the state of the glutathione system activity (enzymes glutathione-S-transferase, glutathione peroxidase, glutathione reductase), oxidative modification of proteins (MBP) in serum, the functional state of the genome of epithelial cells of the oral mucosa, lymphocytes, neutrophils. The correlation analysis has proven the important role of enzymes of the endogenous antioxidant glutathione system in maintaining the structural and functional stability of the cells and the body of long-living persons. The test group established a very strong direct correlation between OMB of basic and neutral character, enzyme activity of glutathione-S-transferase, glutathione peroxidase, glutathione reductase and densitometric, cytogenetic indices; the persons of the control group demonstrated more pronounced oxidative degradation of proteins and a greater frequency of micronuclei, chromosomal aberrations, nuclei with a maximum degree of chromatin compaction, that might be one of the causes leading to inactivation of enzymes glutathione system.
