CC BY
9Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского Серия «Биология, химия». 2007. Том 20 (59). № 1. С. 151-156.
УДК 616.33-002.44: 539.1.047
ВПЛИВ ШПБ1ТОР1В СИНТЕЗУ ОКСИДУ АЗОТУ НА ПРОЦЕСИ
ВИРАЗКОУТВОРЕННЯ Дробтська О.В., Максимович Я.С., ОстапченкоЛ.1.
Дослщжено вплив iнгiбiторiв синтезу оксиду азоту на процеси виразкоутворення. Встановлено, що введення серотоншу викликае тдвищення активност NO-синтази на 85% порiвняно з контролем i спричинюе розвиток значно'1 кiлькостi нейродистрофiчних уражень. Застосування неселективного шпбтору NO-синтази L-NAME призводить до зниження активност ферменту на 26% порiвняно з серотонiновою моделлю виразки. При цьому не було зареестровано виразок, i вiдмiчено зменшення кiлькостi ерозiй та ïx довжини. Селективний шпб™р шдуцибельно'1 форми NO-синтази амшогуашдин у дозi 20мг/кг посилював ураження слизово'1, тодi як застосування селективного шпб^ора нейронально'1 форми NO-синтази 7-штрошдазолу спричинювало статистично достовiрне зниження активност ферменту до рiвня контрольних величин. Через 2 години тсля введення 7-штрошдазолу утворення виразок та масивних крововиливiв не спостерiгалося. Ключов1 слова: оксид азоту, виразкоутворення.
ВСТУП
Експериментальними i клш1чними дослщженнями останшх роюв показано, що основним уражуючим фактором при ульцерогенез1 е ендотел1альна дисфункщя, яка характеризуеться дисбалансом м1ж факторами релаксацп i констрикцп. Наслщком цих процес1в е порушення репонального кровотоку, шем1я судин слизово1 оболонки шлунку, тканинна ппокс1я, що сприяе розвитку некрозу та ацидозу кл1тин ештел1ю, утворенню тромб1в та крововилив1в [1]. Одшею ¡з речовин, яка бере участь в регуляцп тонусу судин, сприяе вившьненню вазоактивних мед1атор1в ¡з кттин ендотелда i забезпечуе кровопостачання оргашв шлунково-кишкового тракту е оксид азоту (NO) [2]. Оксид азоту синтезуеться в оргашзм1 людини i тварин ¡з L-аргшшу за допомогою цитохром Р-450-под1бних гемопротешв NO-синтаз (NOS). По характеру вдукцп i ф1зюлопчним властивостям вони роздшеш на два типи: I тип конститутивш (Са2+- i кальмодулш залежш), до яких вщноситься нейрональна (nNOS) та ендотел1альна (eNOS) форми фермету i II тип 1ндуцибельна (цитокшзалежна) NO-синтаза, до яко1 в1дноситься макрофагальна (iNOS) форма ферменту [3]. При дп ацетилхол1ну, брадшшну та шших агент1в, яю стимулюють реакцп фосфатидилшозитолфосфатного регуляторного циклу вщбуваеться активащя конститутивно1 NO-синтази, що призводить до синтезу незначно1 кшькост NO (шкомол1) протягом кшькох хвилин. Щд впливом 1муногенних та прозапальних стимул1в (штерферон, штерлейкш-1, фактор некрозу пухлин та ш.) вщповщш кл1тини (макрофаги, нейтрофши, моноцити, гепатоцити, ф1бробласти та ш.) продукують значно бшьшу кшьюсть NO (наномол1) протягом кшькох годин за рахунок тдвищення активносп 1ндуцибельно1 форми ферменту [3]. На сьогодшшнш день немае
остаточно! думки про те, активащя яко! iз цих iзоформ залучена до процешв виразкоутворення або цитопротекци.
Даш лторатури щодо участi певних форм ферменту у розвитку виразково! хвороби доволi суперечливi. Так, було вiдмiчено надмiрну експресiю на 1 - 2 другу добу
шсля шдукування виразки оцтовою кислотою, що сшвпадало зi збiльшенням площi кратеру виразки [4], у той же час iншi автори пояснюють такий характер експреси дано! форми ферменту з раншми процесами загоення [5].
Метою роботи було ощнити вплив iнгiбiторiв К0-синтази на процеси ульцерогенезу за умов експериментально! серотоншово! моделi виразки шлунка у щурiв.
МАТЕР1АЛ I МЕТОДИ
Експерименти проведет на 50 нелшшних бших щурах-самцях масою 180-200г. Щурiв утримували на стандартному ращош вiварiю. За добу до проведення експерименту тварини мали доступ лише до води. Серотонш вводили в/о в дозi 10 мг/кг за методом [6]. Неселективний шпб™р К0-синтази Ь^ЛМЕ (2,5 мг/кг) [7] та специфiчнi iнгiбiтори 1К08 та пК08 - амшогуашдин (20мг/кг) [8] та 7-штровдазол (50 мг/кг) [9] вводили в/о за 5 хвилин до введення серотошну. Через 2 години тварин декаштували i вiзуально дослiджували стан слизово! оболонки шлунку. Диференцiйно тдраховували кiлькiсть ерозiй, виразок, масивних крововиливiв та довжину ерозiй, площу виразок i масивних крововиливiв. Ступiнь ураженост слизово! оболонки оцiнювали iз розрахунку на 1 шлунок. Слизову оболонку шлунка шддавали гомогешзаци в трис-НС1 буферi (рН=7,4) у спiввiдношеннi 1:10 при 00С [10] i дослщжували активнiсть К0-синтази за методом [11]. Бшок визначали за методом Лоурь Статистичну обробку результатiв проводили на 1ВМ РС ЕТ з використанням стандартних пакетiв прикладних програм.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
В результатi проведених дослiджень, нами було встановлено, що через 2 години шсля введення серотонш спричиняв нейродистрофiчнi ураження в слизовш оболонцi шлунку щурiв. Ми реестрували значну кшьюсть виразок, ерозш i крововиливiв в кiлькостi 3,5; 2,6; 1,3 вщповщно iз розрахунку на 1 шлунок. Площа виразок i крововиливiв становила 8,5 та 3,7 мм2 , а довжина ерозш 5,2 мм (табл.).
Серотоншова модель виразки шлунку вщома як iшемiчна модель, яка виникае за рахунок вазоконстрикторних властивостей серотоншу, що задiяний в мехашзми скорочення гладеньких м'язiв i е медiатором нервових процешв в ЦНС. У вщповщь на вазоконстрикторний ефект серотонiну, вщбуваеться генерацiя оксиду азоту, що проявляеться у статистично значимому збiльшеннi активносп К0-синтази на 85% (рис.).
Активащя К0-синтази призводить до гшерпродукцш оксиду азоту, надлишковий рiвень якого може проявляти пошкоджуючу дiю на клггини. Оксид азоту може бути агресивним фактором за рахунок свое! здатносп при певних умовах пригнiчувати циклооксигеназу, посилювати цитотоксичшсть пероксиду водню, шщювати апоптоз клiтин. N0 реагуе з кштинними залiзовмiсними бiлками (такими, як акоштаза циклу Кребса, комплекси 1-Ш мiтохондрiального ланцюга переносу електронiв) i шляхом S-нiтрозилювання повнiстю !х
шактивуе. У присутносп кисню утворюються активнi iнтермедiати NO (включаючи пероксинприт ONOO), що прямо проявляе цитотоксичну дiю [12].
Таблиця
Вплив серотошну i дослiджуваних речовин на ураження слизово'1 оболонки шлунку щурiв. (п=40, М±т)
Показники ураженосп Серотонiн (10 мг/кг) Серотонiн (10 мг/кг) + L-NAME (2,5 мг/кг) серотонiн (10 мг/мг ) + амшогуашдин (20 мг/кг) серотонiн (10 мг/кг) + 7-нiтроiндазол (50 мг/кг)
Кiлькiсть ерозiй 2,6±0,68 0,7±0,21* 1,1±0,52 0
Довжина ерозш (мм) 5,18±0,95 1,15± 0,48* 2,36+1,98 0
Кiлькiсть виразок 3,46±0,93 0 1,84±0,58 0
Площа виразок (мм2) 8,48±3,10 0 20,45+8,0 0
Кшьюсть крововиливiв 1,27±0,52 1,1±0,40 6,6+1,34 0
Площа крововиливiв (мм2) 3,68±1,02 6,35±1,13* 80+42,9 0
ПримЬтка: * рiзниця вiрогiдна в порiвняннi з експериментальною моделлю виразки, р < 0,05
Пперпродукщею оксиду азоту також обумовлено шпбування глiцеральдегiд - 3-фосфатдепдрогенази шляхом рибозилювання i нiтрозилювання. Це призводить до гальмування глiколiзу i, як наслщок, до порушення енергетичного метаболiзму. Всi цi небажанi ефекти опосередковаш активацiею NOS та надмiрним виробленням NO, при якому проявляеться цитотоксичний ефект оксиду азоту. Отримаш нами данi свiдчать, що в ураження слизово1 оболонки шлунка, викликаних серотонiном робить свiй внесок i оксиду азоту. З лтературних джерел вщомо, що високi концентрацiï оксиду азоту не реалiзують вазодилататорний ефект через активащю розчинноï гуанiлатциклази по гемзалежному мехашзму з накопиченням цГМФ. Навпаки, вони виявляють пряму цитотоксичну дт, зв'язуючись з супероксидним радикалом, утворюють пероксинiтрит (ONOO ), який i^^^e ушкодження ДНК i мутацп [13 ]. Надмiрне генерування оксиду азоту NO-синтазою можна розглядати як додатковий цитотоксичний фактор ушкодження слизовоï оболонки шлунка щурiв. У високих концентрацiях оксид азоту е фактором ендогенноï iнтоксикацiï, що визначае його цитотоксичну дда i викликае загибель клгтин i тканин за мехашзмами апоптозу i некрозу.
8 1
1 2 1 3 4 5
Рис. Активнють ЫО-синтази в гомогенат! кттин слизово! оболонки шлунку щурiв за умов серотонiновоl моделi виразки i при введеннi дослiджуваних речовин.
1. контроль, п=10;
2. серотонш (10 мг/кг), п=10;
3. серотонш (10 мг/кг) + Ь-ЫЛЫЕ (2,5 мг/кг), п=10;
4. серотонш (10 мг/мг ) + амшогуашдин (20 мг/кг), п=10;
5. серотонш (10 мг/кг) + 7-штрошдазол (50 мг/кг), п=10.
* р1зниця в1ропдна в пор1внянш з контролем, р < 0,05
** р1зниця в1ропдна в пор1внянш з експериментальною моделлю виразки, р<0,05
Доказом цього е цитопротекторна дiя на слизову оболонку шлунка щурiв неселективного iнгiбiтору ЫО-синтази Ь-ЫЛЫЕ. Пiсля введення Ь-ЫЛЫЕ активнiсть N0-синтази знижувалась на 26%. Нами не було зареестровано виразок, встановлено статистично достовiрне зменшення на 73% i 78% кiлькостi ерозiй i !х довжини, але площа крововиливiв статистично значно збiльшувалась на 72%.
Використання селективного iнгiбiтора iндуцибельноl форми ЫО-синтази амiногуанiдину призводило до незначного зниження активностi ферменту. При цьому кшьюсть ерозiй i виразок зменшувалася на 58% i 47% вщповщно, однак площа виразок збiльшувалася у 2,4 рази, кшьюсть масивних крововиливiв пiдвищувалася у 5,2 рази, а !х площа - у 21,7 рази.
Можна припустити, що активащя ЫО-синтази здiйснюеться за рахунок конститутивних форм синтази оксиду азоту, яю проявляють свою активтсть тiльки в присутносп кальцiю i кальмодулiну. Вазодилататорний ефект оксиду азоту реалiзуеться через його взаемодда з цитозольним ферментом розчинною гуанiлатциклазою, що призводить до 11 активацн, зростання внутрiшньоклiтинного рiвня циклiчного гуанозинмонофосфату (цГМФ) та активацп специфiчного ферменту цГМФ-залежно! протешкшази (О-кшази) [15].
Пiдвищення продукцн ЫО вщбуваеться пропорцiйно надходженню в цитоплазму юшв кальцiю або ззовнi, або iз ендоплазматичного ретикулуму (при дИ ацетилхолiну,
брадшншу та шших агентов, стимулюючих реакци фосфатидилiнозитолфосфатного циклу). Ефекти оксиду азоту залежать не лише вщ концентраций але також i вiд мiсця його продукци, дифузи в клiтинах i тканинах, утворення NO-вмiсних сполук, взаемоди з реактивними формами кисню (особливо i3 супероксид-анiон радикалом).
Застосування селективного шпбтоору нейронально! форми NO-синтази 7-нiтроiндазолу спричинювало статистично достовiрне зниження активносп NO-синтази до рiвня контрольних величин. Через 2 години шсля введення 7-штрошдазолу утворення виразок та масивних крововиливiв взагалi не спостерiгалося.
Вщомо, що нейрональна форома NO-синтази присутня у нiтрергiчних нейронах, якi шнервують судини органiв шлунково-кишкового тракту. Оксид азоту, який утворюеться в результат активаци нейронально! форми NO-синтази задiяний в процеси регуляцп тонусу судин як гальмiвний нейромедiатор периферично! нервово! системи [15]. Тому можна припустити, що надмiрна активацiя nNOS призводить до сильно1 вазодилатацп судин, порушенню кровотоку i гшокси. Крiм того, нейрональна форма NO-синтази здатна продукувати i супероксидний радикал, який вступае в реакцда з оксидом азоту утворюючи пероксинiтрит (ONOO ). Пероксинприт не тiльки здатний ушкоджувати ттдне оточення iонних каналiв мембран клггин i впливати на !х функщю шляхом нiтрозилювання або окислення вщповщних бiлкiв, але i безпосередньо проявляе вазодилататорнi властивостi, що призводить до незворотно! релаксаци гладеньких м'язiв.
ВИСНОВКИ
Таким чином, в результат проведених дослiджень, нами встановлено, що у складш механiзми виразкоутворення, спричиненого серотоншом залучена нейрональна форма NO-синтази. Пперпродукщю синтезу NO можна розглядати як один iз основних цитотоксичних факторiв ушкодження слизово! оболонки шлунка щурiв i прогресування виразкоутворення.
Список лiтератури
1. Язвенная болезнь / Под ред. Ю.Ю. Елисеева. - М.: КРОН-ПРЕСС, 2000. - 304 с.
2. Поленов С.А. Окись азота в регуляции функций желудочно-кишечного тракта // Рос. журн. гастроэнторологии, гепатологии, колонопроктологии. - 1998. - Т.8, № 1. - С. 53-60.
3. Michel T., Feron O. Nitric Oxide Synthases: Which, Where, How, And Why // J. Clin. Invest. - 1997. -Vol. 100( 9) - Р. 2146-2152.
4. Guo J.S., Cho C.H., Wang W.P., Shen X.Z., Cheng C.L., Koo M.W.L. Expression and activities of three inducible enzymes in the healing of gastric ulcers in rats // World J Gastroenterol. - 2003.- Vol. 9, № 8. -Р. 1767-1771
5. Tatemichi M., Ogura T., Sakurazawa N., Nagata H., Sugita M., Esumi H. Roles of inducible nitric oxide synthasein the development and healing of experimentally induced gastric ulcers // Int. J. Exp. Path. - 2003. -Vol. 84. - Р. 213 - 220.
6. Dixit C., L.Rastogi., M. Dikshit. Effect of nitric oxide modulators on pylorus ligation induced ulcers in the rat // Pharmacol. Res. - 1999. - Vol.39. - P. 33-39.
7. Takeuchi K., Yasuhiro T., Asada Y., Sugawa Y. Role of nitric oxide in pathogenesis of aspirin-induced gastric mucosal damage in rats // Digestion - 1998. - V.59. - P. 298-307.
8. Takeuchi K., Hatazawa R., Tanigami M., Tanaka A., Ohno R., Yokota A. Role of endogenous nitric oxide (NO) and NO synthases in healing of indomethacin-induced intestinal ulcers in rats//Life Sciences . - 2007. - Vol. 80. - P.329-336
9. Москвин А. Н., Жиляев С. Ю., Шарапов О. И., Платонова Т. Ф., Гуцаева Д. Р., Косткин В. Б., Демченко И. Т. Мозговой кровоток модулирует нейротоксическое действие гипербарического кислорода с помощью нейронального и эндотелиального оксида азота // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. - 2002. - Т. 88, N 7. - С. 873-880.
10. Биологические мембраны. Методы / Под ред. Дж. Финдлея, У. Эванза. - М.: Мир, 1990. - 424 с.
11. Hevel J.M., White K.A., Marietta M.A. Purification of the inducible murine macrophage nitric oxide synthase // - 1991. - Vol. 266, № 34. - P. 22789 - 22791.
12. Маеда Х., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке // Биохимия. - 1998. - Т. 63, № 7. - С. 1007-1019.
13. Lamarque D., Whittle B.J.R. Role of oxygen-derived metabolites in the rat gastric mucosal injury induced by nitric oxide donors // Europen Journal of Pharmacology. - 1995. - Vol.277. - P.187 - 194.
14. Северина И.С. Растворимая гуанилат циклаза в молекулярном механизме физиологических эффектов оксида азота // Биохимия. - 1998. - Т. 63, № 7. - С. 939-947.
15. Toda N., Herman A.G. Gastrointestinal Function Regulation by nitrergic Efferent Nerves // Pharmacol Rev. -2005. -Vol. 57, No. 3. - Р. :315-338
Дробинская О.В., Максимович Я.С., Остапченко Л.И. Влияние ингибиторов оксида азота на процессы изъязвления // Ученые записки Таврического национального университета имени В.И. Вернадского. - 2007. - Серия «Биология, химия». - Т. 20 (59), № 1. - C. 151-156.
Исследовано влияние ингибиторов синтеза оксида азота на процессы изъязвления, вызванного серотонином. Показано, что введение серотонина вызывает увеличение активности синтазы оксида азота на 85% по сравнению с контролем. Использование неселективного ингибитора NO-синтазы L-NAME (2,5мг/кг) ведет к снижению активности фермента на 26% в сравнении с серотониновой моделью язвы. При этом не было зарегистрировано язв, и отмечено уменьшение количества эрозий и их длины. Селективный ингибитор индуцибельной формы NO-синтазы аминогуанидин в дозе 20 мг/кг не имел сильного влияния на активность фермента, но усиливал повреждения слизистой. Использование селективного ингибитора нейрональной формы NO-синтазы 7-нитроиндазола вызывало снижение активности фермента к контрольному уровню. Через 2 часа после введения 7-нитроиндазола образование язв, кровоизлияний и эрозий не наблюдалось. Ключевые слова: оксид азота, изъязвление.
Drobinska O., Maksymovych I., Ostapchenko L. Effects of inhibitors of nitric oxide on process of
ulceration // Uchenye zapiski Tavricheskogo Natsionalnogo Universiteta im. V.I. Vernadskogo. Series "Biology, chemistry". - 2007. - Vol. 20 (59), № 1. - P. 151-156.
Effects of inhibitors of nitric oxide synthesis on processes of ulceration induced by serotonin were studied. Serotonin provoked damages of gastric mucosa in 2 h after serotonin administration. The NOS activity increased by 85% in comparison with control animals. Usage of aminoguanidine resulted in significant enlargement of the ulcers and hemorrhages areas. NOS activity didn't differ from that after the serotonin administration. L-NAME treatment inhibited NOS activity by 25, а^ prevented ulcers and hemorrhages formation, but increased the hemorrhages area. 7-nitroindasole administration decreased NOS activity to control level and prevented ulcer injuries. Keywords: nitric oxide, ulceration.
