CC BY
62Фізика живого, Т16, No 1, 2008. С.134-138.
© Максимович Я. С., Дробінська О.В., Остапченко Л.І.
УДК 577.152.151+ 616.33-002.44
РОЛЬ ІЗОФОРМ СИНТАЗИ ОКСИДУ АЗОТУ В УЛЬЦЕРОГЕНЕЗІ
Максимович Я.С., Дробінська О.В., Остапченко Л.І.
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, вул.Володимирська, 64, 01033, Київ, Україна e-mail: [email protected]
Надійшла до редакції 05.04.2008
У динаміці розвитку стрес-індуковних уражень шлунку щурів досліджено вплив інгібіторів синтази оксиду азоту на процеси ульцерогенезу. Встановлено, що оксид азоту залучений в складні патогенетичні механізми виразкоутворення. Показано, що основний внесок у формування деструктивних уражень слизової оболонки шлунку вносить кальційзалежна нейрональна ізоформа синтази оксиду азоту.
Ключові слова: оксид азоту, синтаза оксиду азоту, виразка шлунку.
ВСТУП
Відомо, що за умов гострого стресу формуються нейроендокринно-метаболічні зв’язки, які приводять до змін функціонального стану дофамінергічних механізмів і супроводжуються значними коливаннями секреції шлункового соку, посиленням моторики шлунку, порушенням мікроциркуляції крові та продукування слизу, інтенсифікацією перекисного окислення ліпідів активними формами кисню, що пов’ язано з високим ризиком виникнення виразкових дефектів. Оксид азоту (NO) як поліфункціональний фізіологічний месенджер регулює функціональний стан клітин слизової оболонки шлунка і залучений в складні патофізіологічні механізми ульцерогенезу [1].
NO в організмі синтезується за участю ферменту синтази оксиду азоту (NOS) за наявності NADPH, FAD, FMN, тетрагідробіоптерину,
кальмодуліну та іонів Са2+ [2]. По характеру індукції і фізіологічним властивостям вони розділені на два типи ферменту: І тип -
конститутивні (Са2- і кальмодулін залежні), до яких відноситься нейрональна (nNOS) та ендотеліальна (eNOS) форми ферменту і ІІ тип -індуцибельна (цитокінзалежна) NO-синтаза, до якої відноситься макрофагальна (iNOS) форма ферменту. При дії ацетилхоліну, брадікініну та інших агентів, які стимулюють реакції фосфатидилінозитолфосфатного регуляторного циклу відбувається активація конститутивних NO-синтаз. Під впливом імуногенних та прозапальних стимулів (інтерферон, інтерлейкін-1, фактор
некрозу пухлин та ін.) відповідні клітини (макрофаги, нейтрофіли, моноцити, гепатоцити, фібробласти та ін.) продукують значну кількість NO за рахунок підвищення активності індуцибельної форми ферменту.
Дані літератури щодо участі різних типів NOS у виникненні, розвитку та загоєнні виразок шлунку суперечливі [3] . Результати останніх досліджень дали можливість припустити, що активація NO-синтази і надмірна кількість NO проявляє як захисні, так і цитотоксичні властивості. Оксид азоту, який утворюється в результаті активації конститутивних форм NO-синтази проявляє гастропротекторні властивості, тоді як гіперпродукція NO внаслідок активації індуцибельної форми NO-синтази спричинює пошкоджуючий вплив на слизову оболонку шлунку [3]. Встановлено, що під час загоєння виразок, збільшується експресія мРНК ендотеліальної NO-синтази, що корелює з розвитком ангіогенезу. Оксид азоту синтезований даною ізоформою може пригнічувати активність протеїнкінази С та змінювати експресію молекул адгезії на ендотеліальних клітинах, впливаючи таким чином на процеси утворення нових судин у слизовій оболонці шлунка[4].
Показано, що надмірні кількості оксиду азоту, синтезованого іNOS, можуть сприяти
виразкоутворенню, оскільки ця ізоформа ферменту активується цитокінами і в нормі її експресію не виявлено, у той же час інші автори пояснюють такий характер експресії даної форми ферменту з ранніми процесами загоєння [5].
РОЛЬ ІЗОФОРМ СИНТАЗИ ОКСИДУ АЗОТУ В УЛЬЦЕРОГЕНЕЗІ
Метою роботи було дослідити вплив інгібіторів КО-синтази на процеси ульцерогенезу в гомогенаті клітин слизової оболонки шлунку щурів за умов експериментальної стресової виразки.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Експерименти проведені на нелінійних білих щурах-самцях масою 250 - 280 г. Щурів утримували на стандартному раціоні віварію. За добу до проведення експерименту тварини мали доступ лише до води. Експериментальну модель стресової виразки відтворювали за рекомендаціями [6]. Неселективний інгібітор КО-синтази Ь-КАМБ (2,5мг/кг) [7] та специфічні інгібітори ¡N08 та пК08 - аміногуанідин (50 мг/кг) [8] та 7-
нітроіндазол (50 мг/кг) [9] вводили в/о за 5 хвилин до впливу уражуючого фактору. Візуально досліджували стан слизової оболонки шлунку і активність КО-синтази за умов впливу стресового чинника протягом 0,5, 1, 2 та 3-годин. Вміст білку визначали за методом Бредфорд [10].Статистичну обробку результатів та побудову графіків проводили методами варіаційної статистики з використанням Іжритерію Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
У результаті проведених нами досліджень було встановлено, що деструктивні пошкодження слизової оболонки шлунка залежать від тривалості дії стресового чинника. Так, при 30 хвилинній дії стресового фактору лише у одного щура з 10 виявилися 2 виразки загальною площею 2 мм2, слизова оболонка при цьому була гіперемована. Протягом 1, 2, 3 годинного впливу стресу кількість і площа виразок збільшувались і становили 1,3±0,28; 5±0,98 та 10,5±1,7 та
2,18±0,31; 8,33±1,78; 17,68±3,5 відповідно із
розрахунку на 1 шлунок. При цьому було зафіксовано значні крововиливи у порожнину шлунку.
У відповідь на дію стресового чинника відбувається посилення синтезу оксиду азоту, що підтверджується зростанням рівня активності NO-синтази протягом всього терміну досліджень. При 30 хвилинному, 1,2,3-годнинному впливові
стресового фактору активність NOS збільшувалась на 54, 234 485 та 670 % відповідно в порівнянні з контрольною групою тварин.
Гіперпродукція оксиду азоту призводить до інгібування SH-залежних ферментів, зокрема альдолази, аконітази, цитохромоксидази та креатинкінази, гальмування гліколізу, порушення енергетичного метаболізму і синтезу ДНК в клітинах слизової оболонки шлунку [11]. Оксид азоту (NO) може бути агресивним фактором за рахунок своєї здатності при певних умовах пригнічувати циклооксигеназу, посилювати цитотоксичність пероксиду водню, виступати одним із патогенетичних факторів розвитку запалення, ініціювати апоптоз клітин слизової оболонки шлунка, що може бути однією з причин розвитку деструктивних уражень. Всі ці небажані ефекти опосередковані активацією NOS та надмірним виробленням NO, при якому проявляється цитотоксичний ефект оксиду азоту.
З літературних джерел відомо, що високі концентрації оксиду азоту не реалізують вазодилататорний ефект через активацію розчинної гуанілатциклази по гем залежному механізму з накопиченням цГМФ. Вони виявляють пряму цитотоксичну дію, зв’язуючись з супероксидним радикалом, утворюють пероксинітрит (ONOO ), який індукує ушкодження ДНК і мутації. Пероксинітрит здатний безпосередньо
ушкоджувати ліпідне оточення іонних каналів мембран клітин і впливати на їх функцію, окислювати залізосірні активні центри, тіоли і нитрозилювати білки по залишкам тирозину. Крім того, ONOO" може викликати оксидативний стрес, що змінює структуру ланцюгів ДНК, а також інгібує ферменти, що беруть участь в синтезі та репарації ДНК[3].
Таблиця
Ураження слизової оболонки шлунку при дії стресу та інгібіторів NO-синтази, (n=10, M±m)
0,5 год 1 год 2 год 3 год
кількість виразок площа виразок, мм2 кількість виразок площа виразок, мм2 кількість виразок площа виразок, мм2 кількість виразок площа виразок, мм2
стрес 1 виразка в 1 шлунку 2 1,3±0,28 2,16±0,31 5,0±0,98 8,38±1,78 10,5±1,7 17,68±3,5
стрес + L-NAME, 2,5 мг/кг 0 0 0 0 1,0±0,11 0,64±0,12 1 виразка 1
стрес + нітроіндазол, 50 мг/кг 0 0 1±0,11 1,25±0,22 1,0±0,11 1,25±0,22 1,5±0,33 4,88±0,88
стрес + аміногуанідин, 50мг/кг 1,5±0,33 2,25±0,45 2±0,40 1,64±0,34 7,0±1,2 7,08±1,23 10,25±1,23 17,8±3,3
Максимович Я.С., Дробінська О.В., Остапченко ЛЛ.
Рис. N0 - синтазна активність в гомогенаті клітин слизової оболонки шлунку щурів за умов стресової моделі виразки і при введенні досліджуваних речовин.
Примітки: * - різниця вірогідна в порівнянні з контролем, р < 0,05
Надмірне генерування оксиду азоту N0-синтазою можна розглядати як додатковий цитотоксичний фактор ушкодження слизової оболонки шлунка. У високих концентраціях оксид азоту є фактором ендогенної інтоксикації, що визначає його цитотоксичну дію і викликає загибель клітин і тканин за механізмами апоптозу і некрозу. Отримані нами дані підтверджуються даними літератури, де показано, що при хронічному коліті, термальних станах організму (септичний шок) спостерігається різке підвищення рівня оксиду азоту в крові, що може бути однією із причин спонтанної кровотечі за рахунок інгібування агрегації і адгезії тромбоцитів [12].
Доказом участі оксиду азоту в процесах виразкоутворення є цитопротекторна дія на слизову оболонку шлунка щурів неселективного інгібітору N0-синтази Ь-КАМБ. Введення інгібітору мало значний гастропротекторний ефект, оскільки навіть тригодинний вплив стресового фактору не спричинював значних пошкоджень слизової оболонки шлунку: не було зафіксовано виразок, однак було відмічено ерозії та значну гіперемію слизової оболонки шлунку. Нами було встановлено, що активність N0-синтази статистично достовірно зростала на 85% і 46% на 2, 3 годину дії стресового фактору. Отримані нами дані співвідносяться з даними літератури, де показано, що застосування Ь-
NAME зменшує ступінь ураженості слизової оболонки шлунку, викликаних ібупрофеном [14].
Схожий гастропротекторний ефект відмічено і при застосуванні селективного інгібітору
нейрональної ізоформи синтази оксиду 7-нітроіндазолу. Встановлено, що при 1, 2, 3 -годинному впливі стресового фактору було зафіксовано наявність виразок і збільшення їх площі залежно від тривалості ушкоджуючого чинника. У ці ж терміни досліджень активність ферменту зростала на 159, 300, 52% порівняно з контрольною групою тварин. Таким чином, нами було показано, що оксид азоту синтезований nNOS залучений у розвиток виразкових дефектів слизової оболонки шлунку. Відомо, що нейрональна форма NО-синтaзи присутня у нітрергічних нейронах, які іннервують судини органів шлунково-кишкового тракту. Оксид азоту, який утворюється в результаті активації нейрональної форми NО-синтaзи задіяний в процеси регуляції тонусу судин як гальмівний нейромедіатор периферичної нервової системи [14]. Крім того, нейрональна форма NO-синтази здатна продукувати і супероксидний радикал, який вступає в реакцію з оксидом азоту утворюючи пероксинітрит (ОNОО) [15]. Пероксинітрит не тільки ушкоджує ліпідне оточення іонних каналів мембран клітин і впливає на їх функцію шляхом нітрозилювання або окислення відповідних білків, але і безпосередньо проявляє вазодилататорні властивості, що
РОЛЬ ІЗОФОРМ СИНТАЗИ ОКСИДУ АЗОТУ В УЛЬЦЕРОГЕНЕЗІ
призводить до незворотної релаксації гладеньких м’язів. Схожі результати отримали дослідники при вивченні розвитку пошкоджень слизової шлунку при уремії [16].
Можна припустити, що надмірна активація nNOS призводить до сильної вазодилатації судин, порушенню кровотоку і гіпоксії, що може сприяти розвитку виразкових дефектів слизової оболонки шлунку.
Кількість і площа виразок слизової оболонки шлунку при введенні селективного інгібітору індуцибельної ізоформи синтази оксиду азоту аміногуанідину і при дії стресового чинника були однаковими. Активність ферменту зростала на 44, 203, 464 і 90%.
Індуцибельна кальцій-незалежна NOS експресується в тканинах-мішенях після стимуляції цитокінами. Такий шлях синтезу NO відбувається за умов розвитку запалення і призводить до надмірної вазодилятації та пошкодження тканин. Останнім часом деякі дослідники припускають, що низький рівень експресії iNOS може відігравати певну роль у захисті слизової оболонки шлунку. Зокрема підвищення активності індуцибельної ізоформи ферменту може призводити до формування некротичних зон, де пошкоджена слизова відділяється в просвіт шлунку. Даний процес відіграє позитивну роль у загоєнні виразки, оскільки желеподібний шар, що вкриває дно виразки і складається з фібринового гелю, нектротизованих клітин і клітин слизової, захищає дно виразки, попереджаючи його прямий контакт з вмістом шлунку - соляною кислотою, пепсином та їжею. Це підтверджується дослідами на мишах, дефектних по гену іNOS, у яких пошкодження, спричинені оцтовою кислотою, були більші, а запалення навколо виразки - гострішим [5]. У той же час дія ряду факторів (ліпопротеїни низької щільності, високі концентрації глюкози та ішемія) може викликати зниження продукції NO як за рахунок інгібування NO-синтази, так і за рахунок зниження їх експресії . При цьому низький рівень оксиду азоту призводить до підвищення тонусу судин, згортання крові та зниження імунітету, тим самим сприяючи розвитку гіпертензії, атеросклерозу, тромбозів та пухлинного росту.
ВИСНОВКИ
Таким чином, в результаті проведених досліджень нами встановлено, що оксид азоту залучений в складні патогенетичні механізми виразкоутворення. Основний внесок у формування деструктивних уражень слизової оболонки шлунку відіграє кальцій залежна нейрональна ізоформа NO-синтази. Інгібування nNOS селективним інгібітором 7-нітроіндазолом (50 мг/кг) проявляло виражену гастропротекторну дію на слизову
оболонку шлунку щурів. Встановлено, що індуцибельна форма NO-синтази відіграє важливу роль в процесах цитопротекції. Інгібування іNOS селективним інгібітором аміногуанідином (50 мг/кг) посилювало ураження слизової оболонки шлунку щурів. Надмірне генерування оксиду азоту NO-синтазою можна розглядати як додатковий цитотоксичний фактор ушкодження слизової оболонки шлунка щурів.
Література
1. Elliott S.N., Wallace J.L. Nitric oxide: a regulator of mucosal defence and injury// J. Gastroenterol. - 1998. -Vol. 33. - P. 792-803.
2. Michel T., Feron O. Nitric Oxide Synthases: Which, Where, How, And Why//J. Clin. Invest. - 1997. -Vol. 100, No. 9. - Р. 2146-2152.
3. Cho C.H. Current roles of nitric oxide in gastrointestinal disorders// Journal of Physiology - Paris. - 2001. -Vol. 95. - P.253-256.
4. Ma L., Wallace JL. Endothelial nitric oxide synthase modulates gastric ulcer healing in rats // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. - 2005. - Vol. 279 . -P. 341-346.
5. Tatemichi M., Ogura T., Sakurazawa N., Nagata H.,
Sugita M., Esumi H. Roles of inducible nitric oxide
synthasein the development and healing of experimentally induced gastric ulcers // Int. J. Exp. Path.
- 2003. - Vol.84. - Р. 213-220.
6. Takagi K., Okabe, S. // Jpn. J. Pharmacol - 1968. -Vol.18. - P. 918.
7. Takeuchi K.., Yasuhiro T., Asada Y., Sugawa Y. Role of nitric oxide in pathogenesis of aspirin-induced gastric mucosal damage in rats // Digestion - 1998. - Vol. 59. -P. 298-307.
8. Takeuchi K., Hatazawa R., Tanigami M., Tanaka A.,
Ohno R., Yokota A. Role of endogenous nitric oxide
(NO) and NO synthases in healing of indomethacin-induced intestinal ulcers in rats//Life Sciences . - 2007. -Vol. 80. - P. 329-336
9. Москвин А. Н., Жиляев С. Ю., Шарапов О. И., Платонова Т. Ф., Гуцаева Д. Р., Косткин В. Б., Демченко И. Т. Мозговой кровоток модулирует нейротоксическое действие гипербарического кислорода с помощью нейронального и эндотелиального оксида азота // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2002.
- Т. 88, N 7. - С. 873-880.
10. Шоно Н.И., Баскаева Е.М. Метод определения белка по Бредфорд: область применения, преимущества, недостатки. // Лаб. дело. - 1980. - №4. - С. 4-7.
11. Martin M.J. , Jimenez M.D. Motilva V. New Issues about Nitric Oxide and its Effects on the Gastrointestinal Tract// Current Pharmaceutical Design. - 2001. - Vol. 7.
- P. 881-908.
12. Wallis J. P. Nitric oxide and blood: a review // Transfusion Medicine. - 2005.- Vol.15. - P. 1-11
13. Abraham P., Indirani K, Desigamani K Nitro-Arginine Methyl Ester, A Non-Selective Inhibitor Of Nitric Oxide Synthase Reduces Ibuprofen-Induced Gastric Mucosal
Максимович Я.С., Дробшська О.В., Остапченко Л.1.
Injury In The Rat// Digestive Diseases And Sciences -2005. - Vol. 50, No. 9. - P. 1632-1640
14. Toda N., Herman A.G. Gastrointestinal Function Regulation by nitrergic Efferent Nerves // Pharmacol Rev. - 2005. -Vol. 57, No. 3. - P. 315-338
15. Pou S., Pous W.S., Bredt D.S., Snyder S.H., Rosen G.M. Generation Of Superoxide By Purified Brain Nitric
Oxide Synthase // The Journal Of Biological Chemistry.
- 1992. - Vol. 267, No. 34. - P. 24173-24176.
18. Mendez A., Fernandez M., Barrios Y., Lopez-Coviella I., Gonzalez-Mora J.L., Del Rivero M., Salido E., Bosch J., Quintero E. Constitutive NOS isoforms account for gastric mucosal NO overproduction in uremic rats // Am. J. Physiol. - 1997. - Vol. 272. - P. G894 - 901.
РОЛЬ ИЗОФОРМ СИНТАЗЫ ОКСИДА АЗОТА В УЛЬЦЕРОГЕНЕЗЕ Максимович Я.С., Дробинская О.В., Остапченко Л.И.
В динамике развития стресс-индуцированных поражений желудка крыс исследовано влияние ингибиторов синтазы оксида азота на процессы ульцерогенеза. Установлено, что оксид азота вовлечен в сложные патогенетические механизмы язвообразования. Показано, что основной вклад в формирование деструктивных поражений слизистой оболочки желудка делает кальцийзависимая нейрональная изоформа синтазы оксида азота.
Ключевые слова: оксид азота, синтаза оксида азоту, язва желудка.
ROLES OF NITRIC OXIDE SYNTHASE IN ULCERATION Maksynovych I.S., Drobinska O.V., Ostapchenko L.I.
Influence of nitric oxide synthase inhibitors on processes of ulceration in dynamics of development stress induced gastric lesions in rats was investigated. It is established that nitric oxide is involved in complex pathogenetic mechanisms of ulceration. It is shown that calcium dependent neuronal isoform of nitric oxide synthase make a main contribution to formation of destructive gastric mucosal damages.
Key words: nitric oxide, nitric oxide synthase, gastric ulcer.
