ВПЛИВ іМУНОМОДУЛЯТОРіВ ПРИРОДНОГО ПОХОДЖЕННЯ НА ПОКАЗНИКИ КЛіТИННОГО іМУНіТЕТУ КРОВі КРОЛИКіВ ЗА УМОВ СТРЕСУ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

8. Voitkevitch, S. A. (2000). Efirni masla, arimatizatiri, konservanti. Moscow: Drofa, 67.

9. Zharkova, C. O., Demchenko, А. С., Podgaina, М. V., Khomenko, V. М. (2013). Ocinka tendencij spozhivannj protipukhlinnikh preparativ ta zakhvoruvanosti na rak shlunka v Ukraini ta cviti. Pharmacevtichiy zhurnal, 3, 9-15.

10. Statystyka onkologichnyh zahvorjuvan' v Ukrai'ni. Available at: http://diapharma.ua/articles/statistika-onkologichnih-zahvoryuvan-v-ukrayini

11. Osnovni prychyny j poshyrenist' zlojakisnyh puhlyn. Available at: http://www.cancer.ic.ck.ua/

u index 3 1.htm

Рекомендовано до публжацп д-р бюл. наук Шейко В. I.

Дата надходження рукопису 23.01.2015

Полковенко Ольга Володимирiвна, кандидат бюлопчних наук, доцент, кафедра анатоми i ф1зюлоги людини, 1нститут людини Кшвського ушверситету iменi Бориса Грiнченка, вул. Бульварно-Кудрявська, 18/2, м. Ки1в, Укра1на, 04053 E-mail: tpluso@ukr.net

УДК 612.015.2:591.05:599.323.4:176 DOI: 10.15587/2313-8416.2015.37406

ВПЛИВ 1МУНОМОДУЛЯТОР1В ПРИРОДНОГО ПОХОДЖЕННЯ НА ПОКАЗНИКИ КЛ1ТИННОГО 1МУН1ТЕТУ КРОВ1 КРОЛИК1В ЗА УМОВ СТРЕСУ

© С. С. Грабовський, О. С. Грабовська

Дослгджували Т- i В-лгмфоцити кролиюв при використанн ¡муномодуляторгв за умов стресу. Введення ¡муномодуляторгв мае стимулювальний вплив на юльюсть Т- i В-лiмфоциmiв i функцюнальну активтсть Т- i В-клтинного iмунiтету в кровi кролиюв перед ix забоем. Отримаш результати можуть бути використанi для пiдвищення резистентностi оргашзму, корекцИ та зняття впливу передзабшного стресу тварин.

Ключовi слова: кролики, передзабтний стрес, екстракти селезтки, T- i B-лiмфоцити

Aim. The article is devoted to the researching of T- and B-lymphocytes relative amount in the rabbits blood after using of plant and animal origin immunomodulators under stress.

Methods. The relative amount of T- and B-lymphocytes and its some populations in the reaction of spontaneous msetting with the ram erythrocytes in the blood was determined. Thus, the differentiated count of msetting lymphocyte with the different functional activity degree was conducted. The spleen extracts added to the rabbits feed by aerosol introduction method.

Results. T- and B-lymphocytes amount and functional activity T- and B-cell immunity was stimulated after additional supplementary to rabbits diet of experimental group natural origin immunomodulators. Spleen extract polyamines as the immunomodulators and antistressors most effectively influenced on some T- and B-cell immunity indices before slaughter: amount of T-(Th-0) and B-(3-5)lymphocytes were decreased. Conclusions. The results which obtained in experiment can to use in researches of cell immunity indices on farm animals for organism resistance increasing and correction their pre-slaughter stress. Keywords: rabbits, pre-slaughter stress, spleen extracts, T- and B-lymphocytes

1. Вступ

Функцюнуючою основою iмунноl системи е складний комплекс iмунокомпетентних клггин (Т-, В-лiмфоцити, макрофаги). На Bi^i^ ввд В^мфоципв, здатних розшзнавати антигени в розчиш i зв'язувати бшков^ полюахаридш i лшопротевдш розчинш антигени, Т^мфоцити здатш розрiзняти тшьки коротш пептидш фрагмента бшкових антигешв [1]. У попередшх дослвдженнях нами встановлено вплив передзабшного стресу на клгтанний iмунiтет та рiвень кортизолу у кровi щурiв [2].

2. Постановка проблеми

У лiтературi недостатньо висвилеш питання про вплив передзабшного стану тварин на окремi

показники iMyHrreiy. Слщ пам'ятати, що перед забоем сшьськогосподарських тварин не можна використовувати препарата, яю б мали негативний вплив на оргашзм людини тсля споживання продукцй' вiд цих тварин. Саме тому у дослвдженнях ми використали бiологiчно активнi речовини природного походження - екстракт селезiнки. Метою роботи було встановити чи тдвищуеться резистентшсть та iмyнiтет у кролишв при одночасному зменшеннi передзабiйного стресу за використання екстракту селезiнки.

3. Лггературний огляд

З лiтератyрних джерел вiдомо про вплив стресу рiзного характеру на Т- i В-клггинний iмyнiтет

[3-8]. У контролi вроджено1' îmyhhoï вiдповiдi у вищих хребетних вщграють важливу роль полiамiни: спермiдин, спермш та путресцин. Полiамiни можуть сприяти розвитку вiдповiдноï адаптивно1 iмунноï реакци [9, 10], поглинатися Т- та В^мфоцитами, регулювати апоптоз В-клiтин [11]. Встановлено вищий рiвень полiамiнiв у кровi та окремих тканинах курчат-бройлерiв, яким до основного рацiону вносили екстракт селезiнки [12], що дозволило використати цей субстрат як iмуномодулятор та з'ясувати його дiю ще й як антистресора. Екстрагованi потамши отримували з екстракту селезiнки iз застосуванням ультразвуку [13].

4. Вплив iмуномодуляторiв природного походження на показники клiтинного ÏMyHÏTery KpoBi кролишв за умов стресу

Дослвд провели на 10 кроликах породи бший велетень, яких утримували на стандартному гранульованому комбiкормi фермерського госпо-дарства Бузького району Львiвськоï областi. Для дослiдження сформовали двi групи тварин 5-мь сячного вiку (по п'ять у кожнш). Як бiологiчно активнi речовини у передзабшний перiод (за п'ять дiб до забою) використовували екстракт селезшки, одержаний iз застосуванням ультразвуку (дослвд). Екстракти наносили на комбiкорм аерозольним методом (70° спиртовий розчин екстракту селезшки об'емом 1,4 мл на тварину). Кроликам контрольноï групи таким же чином давали до корму 70° розчин етанолу в аналопчному об'ем^ Утримання, годiвлю, догляд та уа манiпуляцiï з тваринами здшснювали згiдно з Свропейською конвенцieю «Про захист хребетних тварин, яш використовуються для експериментальних i наукових цшей» (Страсбург, 1986 р.) i «Загальних етичних принципiв експери-ментiв на тваринах», ухвалених Першим Нацюналь-ним конгресом з бiоетики (Кшв, 2001). Експерименти проводили з дотриманням принцитв гуманносл. викладених у директивi £вропейсько1' Спiльноти [14].

У цiльнiй кровi кроликов визначали вiдносну к1льк1сть Т- i В-л1мфоципв та 1'х окремих популяцш у реакцй' спонтанного розеткоутворення з еритро-цитами барана в якосп маркерiв. За к1льк1стю еритроципв, адсорбованих одним л1мфоцитом, судили про стутнь активностi лiмфоцитiв. Визначали вщносну к1льк1сть загальних (ТЕ-РУЛ -загальш розеткоутворюючi л1мфоцити) та активних Т-л1мфоципв (ТА-РУЛ - активнi розеткоутворюючi лiмфоцити). Для ввдмивання лiмфоцитiв використовували забуферений фiзiологiчний розчин (рН розчину 7,2-7,4 (7,3). Мононуклеарну фракцiю клггин видiляли з гепаринiзованоï кровi кролишв. Мазки висушували, фiксували метанолом, фарбували 7-10 хв за Романовськжм-Гiмзою. Мжроскошю мазк1в робили пвд iмерсieю при збшьшенш 90*7. Лiмфоцити за шльшстю приеднаних еритроцитiв: нульовi - не приеднали жодного; малодифе-ренцiйованi (низькоаввдш або кл1тини з малою щшь-нiстю поверхневих рецепторiв) - приеднали 3-5 еритроципв; середньоавiднi субпопуляцй' -6-10 еритроципв; високодиференцiйованi (високо-

аввдш) - «розетки» з б1льше як 10 еритроцитами (M -морула).

Визначення в1дносно1 шлькосп теофшн-резистентних л1мфоципв (Т-хелпер1в, Th) грунтуеться на тому, що щ клгтини несуть на свош поверхш рецептори до 1муноглобулш1в класу М, а Т-супресори - до 1муноглобул1н1в класу G. Хелперш -л1мфоцити, здатш формувати розетки тсля ïx шкубацп з теофшном - це теофшнрезистентш клпини. Кшьшсть теофшнчутливих л1мфоцит1в (Т-супресор1в, Ts) визначали за р1зницею м1ж к1льк1стю ТЕ-РУЛ та Т-хелпер1в.

Визначали вщносну к1льк1сть В^мфоциив, метод вдентифшацп яких грунтуеться на наявносп у них мембранних 1муноглобул1нових рецептор1в, що забезпечуе приеднання до В-л1мфоципв 1нди-каторних клгган, як1 на свош поверхш мютять комплемент-антиген-комплекс (ЕАС-РУЛ). Як 1нди-каторш клиини використовували еритроцити барана, сенсибшзоваш аптитшами i комплементом. Для приготування комплемент-антиген-комплексу використовували готову рвдку гемолiтичну сироватку (титр 1 : 1200) та готовий сухий комплемент морсько1 свинки [15].

Математичну обробку результатiв опрацьо-вували статистично за допомогою пакету програм Statistica 6.0 i Microsoft Excel for Windows XP. Вiрогiднiсть рiзниць оцiнювали за t-критерiем Стьюдента. Результати вважали вiрогiдними при P<0,05.

Аналiзуючи отриманi результати дослвджень не було встановлено вiрогiдниx рiзниць у шлькосп загальних та активних Т^мфоципв у кровi кроликов як дослвдно].', так i контрольно1 груп (табл. 1). Однак, ввдшчено зменшення шлькосп недиференцiйованиx лiмфоцитiв (Th-0) у кролишв дослiдноï групи на 5,5 % (Р<0,01) порiвняно з контролем. Встановлено зменшення шлькосп малодиференцiйованиx -лiмфоцитiв, як1 приеднали 3-5 еритроцитiв. Спосте-рiгалася тенденцiя до зменшення ввдсотка Ts у кровi кроликов дослщно1 групи, що може вказувати на зб№шення кiлькостi В-клiтин та синтез антитш, але цi данi невiрогiднi. Кiлькiсть В-лiмфоцитiв вiрогiдно менша - на 12,5 % (Р<0,01) у кровi тварин дослiдноï групи за рахунок малодиференцiйованиx лiмфоцитiв, як1 приеднали 3-5 еритроципв. З цих даних випливае, що внесения екстракту селезшки до корму кроликам дослiдноï групи мае вплив на функцюнальш властивосп Т^мфоципв кровi, зокрема активуе рецепторний апарат клггин.

У модельному експерименп на щурах ми вивчали вплив передзабшного стресу на клпинний Тмуштет i концентрацiю в кровГ кортизолу -стресового гормону. У кровГ щурГв, яш отримували екстракт селезшки, була б№ша к1льк1сть Т^мфоциив активних, Т^мфоциив xелперiв «ну-льових» та вГропдно нижчий рiвень кортизолу, що може сввдчити про зменшення стресу перед забоем. Отже, додаткове введення щурам ГмуномодуляторГв природного походження мало стимулювальний вплив на функцюнальну активнiсть Т- i В-клiтинноï ланок iмунiтету [2].

У табл. 1 представлеш показники клтгинного 1мун1тету кров1 кроликов за умов передзабшного стресу.

Таблиця1

Юльшсть T- i В-лшфоципв та ïx функцюнальна активтсть у кров1 кролик1в, % (М±ш; n=5)

Показники Група тварин

Дослвдна Контрольна

Т-загальш (ТЕ-РУЛ), 0 51,50±1,73 53,75±2,22

3-5 37,50±2,08 35,25±2,22

6-10 7,75±1,26 7,50±1,29

М 3,25±1,89 3,502±2,08

% 48,50±1,73 46,25±2,22

Т-активш (ТА-РУЛ), 0 74,00±2,94 78,00±1,83

3-5 21,50±3,42 18,75±3,40

6-10 4,50±1,73 3,00±1,41

% 26,00±2,94 22,00±1,83

Т-теофшн-резистентш (ТК), 0 72,00±1,83** 76,00±1,63

3-5 22,25±2,87 20,75±1,50

6-10 4,75±0,50 3,00±1,41

М 1,00±0,82 0,25±0,50

% 28,00±1,83** 24,00±1,63

Т-супресори ^s) 20,50±3,11 22,25±0,96

В-РУЛ (ЕАС-РУЛ), 0 54,00±2,94 53,00±6,78

3-5 30,00±2,16** 33,75±1,50

6-10 10,25±0,96 7,00±3,46

М 5,75±1,26 6,25±4,50

% 45,00±2,65** 50,33±1,53

Примтка: статистична вiрогiднiсть рiзниць: ** - Р<0,01 порiвняно до контролю

Дослвдження на щурах та кроликах вказують на те, що бiологiчно активш речовини екстракту селезiнки (полiамiни) тдвищують резистентнiсть органiзму, корегують та швелюють вплив стресу перед забоем тварин.

5. Висновки

Таким чином, встановлено, що як iмуномодулятори та антистресори, полiамiни з екстракту селезiнки впливають на показники T- i B-клiтинного iмунiтету в кровi кролишв перед ïx забоем. При цьому зменшуеться к1льк1сть Т-теофiлiнрезистентниx ((Th), 0) недиференцiйованиx лiмфоцитiв та В-РУЛ (3-5) малодиференцшованих (низькоаввдних або клгган з малою щiльнiстю поверхневих рецепторiв).

Лiтература

1. Лаповець, Л. £. Посiбник з лабораторноï iмуно-логи [Текст] / Л. G. Лаповець, Б. Д. Луцик, Г. Б. Лебедь. - Л^в, 2014. - 292 с.

2. Грабовський, С. С. Вплив iмуномодуляторiв природного походження на показники клiтинного iмунiтету i рiвень кортизолу в кровi щурiв за умов стресу

[Текст] /С. С. Грабовський // Бюлопчш Студи. - 2014. -Т. 8, № 1. - С. 93-102

3. Чернушенко, Е. Ф. Местный иммунитет: диагностика его нарушений и возможности коррекции [Текст] / Е. Ф. Чернушенко // Мистецтво лжування. -2007. - Вип. 7, № 43. - С. 61-67.

4. Groer, M. Reduction of hair glucocorticoid levels in an animal model of post-traumatic stress disorder (PTSD) [Text] / M. Groer, S. Wolfe, C. R. Park // Brain, Behavior, and Immunity. - 2013. - Vol. 68, Issue 32. - P. 20.

doi: 10.1016/j.bbi.2013.07.080

5. Кузьменко, О. В. Добовi ритми показниюв iмyнноI системи щургв i радючутливють [Текст] / О. В. Кузьменко // Експериментальна i клшчна медицина. - 2011. - Вип. 1, № 50. - С. 132-141.

6. Киселёва, Н. М. Стресс и лимфоциты [Текст] / Н. М. Киселёва, Л. Г. Кузьменко, М. М. Нкане Нкоза // Педиатрия. - 2012. - Вып. 91, № 1. - С. 137-143.

7. Marvar, P. J. T lymphocytes and vascular inflame-mation contribute to stress-dependent hypertension [Text] / P. J. Marvar, A. Vinh, S. Thabet et al. // Biological psychiatry. - 2012. - Vol. 71, Issue 9. - P. 774-782. doi: 10.1016/j.biopsych.2012.01.017

8. Салига, Н. Т- i В-клггинний iмyнiтет за умов введення L-глутамшово! кислоти [Текст] / Н. Салига // Вюник Львгвського ушверситету. Серiя бюлопчна. -2012. - Вип. 58. - С. 80-84.

9. Naduge, M. Polyamines in aging and disease [Text] / M. Naduge, C-G. Didac, M. Frank // AGING. - 2011. - Vol. 3, Issue 8. - P. 1-16.

10. Reyes-Becerril, M. Effects of polyamines on cellular innate immune response and the expression of immune-relevant genes in gilthead seabream leucocytes [Text] / M. Reyes-Becerril, F. Ascencio-Valle, D. Tovar-Rammez et al. // Fish Shellfish Immunol. - 2010. - Vol. 30. - P. 248254. doi: 10.1016/j.fsi.2010.10.011

11. Nitta, T. Involvement of Polyamines in B Cell Receptor-Mediated Apoptosis: Spermine Functions as a Negative Modulator [Text] / T. Nitta, K. Igarashi, A. Yamashita et al. // Experimental Cell Research. - 2001. - Vol. 265, Issue 1. - P. 174-183. doi: 10.1006/excr.2001.5177

12. Грабовський, С. С. Вмют птамшв та Ix корекщя у кровi та тканинах кyрчат-бройлерiв за умов стресу /Текст] / С. С. Грабовський // Бюлогш тварин. -2014. - Том 16, № 2. - С. 18-25.

13. Грабовский, С. С. Экстрагирование биологически активных веществ селезенки с использованием ультразвука [Текст] / С. С. Грабовский // Сборник научных трудов SWorld. Иваново: МАРКОВА А. Д. - 2013. - Т. 49, Вып. 4. - C. 3-6.

14. Official Journal of the European Union L276/33 [Text] / Directive 2010/63/EU of the european parliament and of the council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. 86/609/EC. 20.10.2010.

15. Влiзло, В. В. Лабораторш методи доолджень у бюлогй, тваринницт та ветеринарнш медицин : довiдник [Текст] / В. В. Влiзло, Р. С. Федорук, I. Б. Ратич та ш.; за ред. В. В. Влiзла. - Львгв : Сполом, 2012. - 764 с.

References

1. Lapovecz, L. Ye., Lucyk, B. D., Lebed, G. B. (2014). Manual of Laboratory Immunology, Lviv, 292. [in Ukrainian]

2. Grabovskyi, S. S. (2014). Natural origin immunomodulators influence on cellular immunity indices and cortisol level in rats blood at pre-slaughter stress. Studia Biologica, 8 (1), 93-102. [in Ukrainian]

3. Chernushenko, E. F. (2007). Local immunity: diagnostics of its violations and possibility of correction. Art of treatment, 7(43), 61-67. [in Russian]

4. Groer, M., Wolfe, S. Park, C. R. (2013). Reduction of hair glucocorticoid levels in an animal model of post-traumatic stress disorder (PTSD) Brain, Behavior, and Immunity, 68 (32), 20. doi: 10.1016/j.bbi.2013.07.080

5. Kuzmenko, O. V. (2011). Daily rhythm of immune system indexes rats and radio sensitivity. Experimental and clinical medicine, 1 (50), 132-141. (in Ukrainian).

6. Kyseleva, N. M., Kuzmenko, L. H. Nkane Nkoza, M. M. (2012). Stress and lymphocytes, Paediatrics, 91(1), 137-143. [in Russian]

7. Marvar, P. J., Vinh, A., Thabet, S. et al. (2012). T lymphocytes and vascular inflammation contribute to stress-dependent hypertension. Biological psychiatry, 71 (9), 774782. doi: 10.1016/j.biopsych.2012.01.017

8. Salyha, N. (2012). T- and B-cells immunity at the condition introduction L-glutamic acid. Visnyk of Lviv Univ. Biology Series, 58, 80-84. [in Ukrainian]

9. Naduge, M., Didac, C-G., Frank, M. (2011). Polyamines in aging and disease. AGING, 3 (8), 1-16.

10. Reyes-Becerril, M., Ascencio-Valle, F., Tovar-RamHrez, D. et al. (2010). Effects of polyamines on cellular innate immune response and the expression of immune-relevant

genes in gilthead seabream leucocytes. Fish Shellfish Immunol., 30, 248-254. doi: 10.1016/j.fsi.2010.10.011

11. Nitta, T., Igarashi, K., Yamashita, A. et al. (2001). Involvement of Polyamines in B Cell Receptor-Mediated Apoptosis: Spermine Functions as a Negative Modulator. Experimental Cell Research, 265 (1), 174-183. doi: 10.1006/excr.2001.5177

12. Grabovskyi, S. S. (2014). Polyamines content and its correction in broiler chickens blood and tissues at pre-slaughter stress. The Animal Biology, 16 (2), 18-25. [in Ukrainian]

13. Grabovskyi, S. S. (2013). Extracting of biologically active substances of spleen with the application an ultrasound. Proceedings SWorld. Ivanovo: Markova A. D., 4 (49), 3-6. [in Russian]

14. Official Journal of the European Union L276/33. Directive 2010/63/EU of the european parliament and of the council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. 86/609/EC. 20.10.2010.

15. Vlizlo, V. V., Fedoruk, R. S., Ratych, I. B. et al. (2012). Laboratory methods of investigation in biology, stock-breeding and veterinary : Reference book ; Edited by V. V. Vlizlo. Lviv : SPOLOM, 764. [in Ukrainian]

Рекомендовано до публгкацИ д-р бгол. наук, професор Малик О. Г.

Дата надходженнярукопису 27.01.2015

Грабовський Степан Стефанович, кандидат бюлопчних наук, кафедра бюлопчно! та загально! xiMii', Львiвський нацюнальний ушверситет ветеринарно! медицини та бютехнологш iM. С. З. Гжицького, вул. Пекарська, 50, м. Львiв, Укра!на, 79010 E-mail: grbss@ukr.net

Грабовська Олександра Степашвна, кандидат бюлопчних наук, Лаборатория штелектуально! власносп та маркетингу шновацш, 1нститут бюлоги тварин НААН, вул. В. Стуса, 38; м. Львiв, Укра!на, 79034

E-mail: alice_grb@ukr.net