CC BY
33
УДК: [612.353 + 612.013] : 616.8-009
ВПЛИВ ГОСТРОГО СТРЕСУ НА ПРОЦЕСИ АПОПТОЗУ I ВМ1СТ НУКЛЕ1НОВИХ КИСЛОТ
У ТКАНИН! ПЕЧ1НКИ ЩУР1В
Вплив стресорних чинниюв на оргаызм супроводжуеться функцiональними, б^1^чними i структурними розладами в ЦНС та периферичних органах [10]. Одним iз органiв, який активно реагуе на вплив надзвичайних факторiв, е печЫка [1]. За умов стресу в печЫц активуються процеси глiкогенолiзу i глiколiзу, порушуеться прооксидантно-антиоксидантний гомеостаз, дезЫтокикацмна i бiлiрубiнутворююча функ-цп, пiдвищуеться проникнiсть мембран гепатоцитiв [5, 6]. Таю метаболiчнi змiни в орган можуть призвести до ушкодження клiтин печiнки та Тх загибелi [4]. Загибель клiтин у тканинах зртого органiзму може вiдбуватись як шляхом некрозу, так i шляхом апоптозу [9]. Апоптоз - це генетично запрограмована кл^инна смерть у вщповщь на вплив деяких внутршньокл^инних та зовншых факторiв [9]. Одним iз яких може бути i стрес. Однак вплив гострого стресу на процеси апоптозу в гепатоцитах дослщжений недостатньо.
Метою роботи було вивчення змЫ вмюту нуклеТнових кислот i процесiв апоптозу в тканин печiнки за умов гострого стресу.
Матерiал та методи дослiдження. Експеримент виконано на 16 щурах-самцях лЫп Вютар масою 200-250 г. Тварин утримували в умовах "вщкритоТ системи", природного осв^лення, при температурi 18 - 210С i вiдноснiй вологостi пов^ря 45-60%. Вони одержували рацiон типу кормовоТ сумiшi i охолоджену прокип'ячену воду за потребою з автоматичних поТлок. Дослщи були виконанi навесы в один i той же час доби. Гострий стрес моделювали шляхом iммобiлiзацiТ тварин на спин за Сел'е протягом 3-х годин. Евтаназю щурiв здiйснювали пщ тiопенталовим наркозом (50 мг/кг) через 1,5 год пюля завершення дм стресорного фактору шляхом забору кровi з серця до його зупинки. Контролем слугували Ытакты щури. В гомогенатах печЫки визначали вмiст РНК, ДНК i обчислювали Тх стввщношення (коефiцiент Рiглера) [10]. Принцип методу грунтуеться на видтены нуклеопротеТнiв та Тх кислотному i лужному гiдролiзi, з подальшим спектрофотометричним визначенням концентрацп РНК при довжинi хвилi 260 нм i ДНК при довжин хвилi 270 - 290 нм. Наявнють апоптозу в тканинi печЫки оцiнювали за мiжнуклеосомною фрагментацiею ДНК. Зразки тканини заморожен при - 700 С гомогенiзували на сухому льоду. По^м додавали буфер видтення (рН = 7,5) у снввщношенн 10 мл на 1 г тканини. Видiлення ДНК проводили з використанням протеТнюнази К i фенолу. ДНК осаджували центрифугуванням, висушували пiд вакуумом i розчиняли в Трис-ЕДТО буферi [7]. Фрагменти ДНК роздтяли з використанням 1,8% агарозного гелю. Електрофорез тривав 3 години. Забарвлення ДНК проводили з використанням бромщу етидю Отриман електрофореграми вiзуалiзували в ультрафiолетових променях i фотографували. Про посилення апоптозу в тканин печЫки свiдчила наявнiсть феномену "сходинок" - смуг, вiдстань мiж якими кратна 150 - 200 парам основ. Статистичну обробку ктькюних показниюв здмснювали з використанням критерiю 1 Стьюдента [3].
Результати дослiдження та Тх обговорення. Експериментальними дослщженнями встановлено, що вмiст РНК у гепатоцитах щурiв за умов гострого iммобiлiзацiйного стресу зменшився в 2,1 рази (рисунок). Стресорний вплив викликав зменшення рiвня ДНК в тканинi печЫки в 2,3 рази порiвняно з показниками Ытактних щурiв (р<0,002) (див. рисунок). За цих умов коефщент Р^лера, тобто сiввiдношення РНК/ДНК у гепатоцитах Ытактних тварин становив 1,44. При стреа цей показник вiрогiдно не змiнювався порiвняно з Ытактними тваринами. Зменшення вмiсту РНК в тканин печiнки на фонi гострого стресу iмовiрно, вказувало на зниження метаболiчноТ активнiстi геному, а ткакож на пригнчення процесiв транскрипци в орган при дм на органзм надзвичайних факторiв.
Зменшення вмiсту ДНК за умов гострого стресу, на нашу думку, пов'язане з пригнченням процеав репарацп i репаративного синтезу двониткових нуклеТнових кислот.
lмовiрно, ц змЫи вмiсту нуклеТнових кислот зумовленi надлишком глюкокортикоTдiв при стресi та Тх катаболiчною дieю, зокрема на геном кл^ин. Вiдсутнiсть вiрогiдних змiн стввщношення РНК/ДНК на фонi загального зменшення нуклеТнових кислот при гострому стреа може вказувати, що в стадю тривоги гострого стресу порушення обмЫу нуклеТнових кислот рiвною мiрою стосуеться i ДНК i РНК. Отриман нами результати узгоджуються з даними Ыших авторiв стосовно катаболiчноT направленост впливу стресорного фактору на функцюнальну активнiсть геному гепатоцитiв iнших лабораторних тварин [12].
А
2i
1,5 1
0,5 0J
Б
Рис. Змши BMicTy нуклеТнових кислот в тканинн печiнки за умов гострого стресу. А - РНК; Б - ДНК. Приммтки: 1 - 1нтактнл; 2 - Гострий стрес; 3 - * - p<0,05 порiвняно з штактними щурами (контроль).
При дослщжены процес1в апоптозу показано, що на електрофореграмах Ытактних щур1в 1снуе по одн1й яскрав1й смуз1, яка розташована поблизу л1н1Т старту. Це свщчить, що ДНК видтена з печ1нки 1нтактних тварин високомолекулярна i не м1стить розрив1в. У тварин пщданих стресу на електрофореграмах спостер^аеться по кiлька смуг, розташованих вiд середини дистанцiТ електрофореграми до ТТ фiнiшy. Порiвняння таких смуг з маркером молекулярних мас фага лямбда М 13 показуе, що вони кратн 150 - 200 пар основ. Такий феномен сходинок свщчить про посилення загибелi гепатоци^в за апоптотичним типом [9]. Посилена фрагмента^я ДНК внаслщок активацп апоптозу при гострому стреа, вочевидь, е одним з фaкторiв, як зменшують вмiст нативноТ ДНК визначеноТ бiохiмiчними методами в ткaнинi печiнки. Таким чином, стресорн пошкодження печiнки вщбуваються шляхом посилення програмованоТ зaгибелi гепатоци^в, що супроводжуються зниженням вмiстy ДНК i рiвною мiрою пригнiченням транскрипцп, про що свiдчило зменшення вмюту РНК в оргaнi.
Вочевидь, Ыщальною ланкою виявлених процесiв е посилення перекисного окиснення лт^в i порушення антиоксидантного захисту в печЫцк Таю зрушення вiдмiченi нами в попередых дослiдженнях, а також вiдоме з лтератури [6, 14]. 1ншим iмовiрним мехaнiзмом iнiцiaцiТ апоптозу при стреа може бути пщвищення концентрaцiТ Са2+ в ткaнинi печiнки [7, 13], осюльки вiдомо, що накопичення цього йону в кттинах активуе ендонуктази, призводить до утворення апоптозних т^ець, порушуе структуру клiтинних мембран, функцю мiтохондрiй та призводить до зaгибелi клiтини [2, 12]. Бiологiчнa доцтьнють виявлених феноменiв, вочевидь, полягае в тому, що вщбуваеться посилення плановоТ елiмiнaцiТ фyнкцiонaльно неповноцiнних клiтин i Тх метaболiчнi перетворення з вивтьненням пластичних сyбстрaтiв, якi будуть використан в aнaболiчнy фазу гострого стрессу.
Встановлено, що гострий стрес сприяе зменшенню вмiстy нуклеТнових кислот в тканин печiнки, а ушкодження печiнки при гострому стресi супроводжуеться посиленням процеав апоптозу в органк
1. Кресюн В.В. Мехаызми стрес-iндyковaних уражень печiнки: Автореф. дис.... к. мед. наук. 14.03.04 / Од. держ. мед. ун-т. - Одеса, 2002. - 17 с.
2. Кудрин А.В., Жаворонков А.А. Роль микроэлементов и кальция в регуляции апоптоза // Усп. совр. биологии. - 1998. - Т. 118, вып.5. - С. 623 - 629.
3. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-био-логических исследованиях с использованием Excel.- К.: Морион, 2000.-320 с.
4. Логинов А.С., Матюшин Б.Л. Цитотоксическое действие активных форм кислрода и механизмы развития хронического процесса в печени при её патологии // Пат. физиол. и эксперим. терапия. - 1996. - №.4. - С.3-5.
5. Луценко Р.В. Ефективнють нейротропних засобiв при порушеннях дезштоксикацшно''' функци печшки за умов гострого стресу // Лки. - 2005. - №1-2. - С. 34-38.
6. Луценко Р.В. Гепатозахисна дiя мексидолу i и системний аналiз // Лки.- 2007.- №1-2.- С. 71-76.
7. Мiрошниченко А.О., Ляшенко В.П., Лукашов С.М. Вплив стресу рiзного генезу на накопичення кальцш в печшц та и функцюнальну активнiсть // Фiзiол. журн. - 2002. - Т. 48, №5. - С. 22 - 26.
8. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер.с англ. / Под ред. С. Херрингтона. Дж. Макги.-М.: Мир,1999. - 558 с.
9. Програмировання клеточная гибель / Под ред. проф. В.С. Николаева. - СПб.: Наука, 1996. - 276 с.
10. Пшенникова М.Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии // Пат. физиол. и эксперим. терапия. - 2000. - №.2. - С. 24-31.
11. Трудолюбова М.Т. Количественное определение РНК и ДНК в субклеточных фракциях клеток животных // Современные методы биохимии. Под ред. В.Н. Ореховича.- М.: Медицина,1977.- С.313-316.
12. Шкурупий В.А. Ультраструктура клеток печени при стрессе.-Новосибирск:Изд."Наука",Сиб. отд., 1989. - 144 с.
13. Cain K., Inayat-Hussain S. H., Wolfe J.T., Cohen G.M. DNA fragmentation in rat liver nuclei is stimulated by Mg 2+ alone and / Mg 2+ but not by Ca 2+ alone // FEBS Lett. 1994. - Vol. 349. - P. 385-391.
14. Gursoy E., Cardounel A., Hu Y., Kalimi M. Biological effects of long-term caloric restriction: adaptation with simultaneous administration of caloric stress plus repeated immobilization stress in rats // Exp. Biol. Med. (Maywood). - 2001. - Vol.226, №2 - P. 97-102.
ВЛИЯНИЕ ОСТРОГО СТРЕССА НА ПРОЦЕССЫ АПОПТОЗА И СОДЕРЖАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ТКАНИ ПЕЧЕНИ КРЫС Рябушко Н.Н., Луценко Р.В., Капустник Ю.А.
Целью исследования было изучение содержания нуклеиновых кислот и процессов апоптоза в ткани печени в условиях острого стресса. В гомогенатах печени изучали содержание РНК и ДНК и определяли коэффициент Риглера. Установлено, что содержание РНК в гепатоцитах крыс в условиях острого иммобилизационного стресса уменьшилось в 2,1 раза, а содержание ДНК в 2,3 раза по сравнению с показателями у интактных животных. При стрессе коэффициент Риглера достоверно не изменился по сравнению с интактными животными. Повреждение печени при остром стрессе сопровождалось усилением процессов апоптоза в органе.
Ключевые слова: печень, острый стресс, апоптоз.
INFLUENCE OF ACUTE STRESS ON THE PROCESSES OF APOPTOSIS AND CONTENT OF NUCLEIC ACIDS IN RATS' LIVER TISSUE Ryabushko M.M., Lutsenko R., Kapustnik Yu.
The research purpose was study of content of nucleic acids and processes of apoptosis in liver tissue in the conditions of acute stress. In liver homogenates content of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid is studied. Rigler coefficient is determined also. It was found out in experimental researches, that in the conditions of acute immobilized stress content of ribonucleic acid in rat hepatocytes is diminished in 2,1 time, and content of deoxyribonucleic acid is diminished in 2,3 time as compared to the indexes of intact animals. In stress the Rigler coefficient did not change as compared to this index of intact animals. In acute stress damage of liver was accompanied by strengthening of processes of apoptosis in organ.
Key words: liver, acute stress, apoptosis.
УДК 582.282.23:57.085:615.28
АНТИБАКТЕР1АЛЬНА АКТИВН1СТЬ АНТИСЕПТИЧНИХ КРАПЕЛЬ
Запальн захворювання очей вщносяться до найбтьш частих причин звернень па^ен^в до лiкарiв. Одыею з найскладнших серед них е широке розповсюдження гнмно -запальних захворювань [4]. Складна еколопчна ситуа^я несприятливо вщбиваеться на
