CC BY
15
Виявлено iмуномодулювальнi власти-eocmi бюмаси Coriolus versicolor 353 на експериментальнш моделi мишей in vivo. Препарат 6ioMacu С. versicolor 353 nid-вищував здаттсть макрофагiв черевног порожнини ттактних мишей до накопичен-ня реактогенних метаболiтiв кисню та гх фагоцитарну активтсть
Ключовi слова: базидiальний гриб,
Coriolus versicolor, ттерферон
□-□
Обнаружено иммуномодулирующие свойства биомассы Coriolus versicolor 353 на экспериментальной модели мышей in vivo. Препарат биомассы C.versicolor 353 повышал способность макрофагов брюшной полости интактных мышей к накоплению реактогенных метаболитов кислорода и их фагоцитарную активность
Ключевые слова: базидиальные грибы,
Coriolus versicolor, интерферон
□-□
Immunomodulatingproperties of the biomass Coriolus versicolor353 was found in an experimental model in mice in vivo. Preparation of the biomass C.versicolor 353 enhances the ability of macrophages of the abdominal cavity of mice to the accumulation of intact reactogen-ic metabolites of oxygen and their phagocytic activity
Keywords: basidiomyceteous mushroom, Coriolus versicolor, interferon
УДК 582.284:57.083.3
ВПЛИВ БЮМАСИ CORIOLUS VERSICOLOR 353 НА ПОКАЗНИКИ 1МУНОРЕАКТИВНОСТ1 ОРГАН1ЗМУ НА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНШ
МОДЕЛ1
Л.О. Антоненко
Асистент*
Контактний тел.: (044) 406-83-12, 066-784-94-17 E-mail: lora.a@bigmir.net Л.М. Лазаренко Доктор бюлопчних наук, професор* E-mail: LazarenkoLM@gmail.com I. Р. Кл е ч а к Кандидат техшчних наук, доцент кафедри* Контактний телефон: роб. (044) 454-98-51 E-mail: prombt@ukr.net *Кафедра промисловоТ бютехнологп Нацюнальний техшчний ушверситет УкраТни «КиТвський пол^ехшчний шститут» просп. Перемоги, 37, корпус 4, м. КиТв , 03056
1. Вступ
За останш роки шфекцшно-запальш та онколо-пчш захворювання людини, nepe6ir яких супровод-жуеться формуванням вторинних iмунодефiцитних сташв, характеризуются тенденщею до зростання. Лжування та проф^актика, що засноваш на вак-цинацп, джть при обмеженому числi шфекцш. За-стосування сироватки або iмунних лiмфоцитiв е ефективним лише на раншх стадiях iнфекцiйного процесу. У зв'язку 3i швидким збiльшенням числа збудниюв, що характеризуються множинною стшкь стю, антибiотична терапiя стае менш ефективною [1]. Все це робить актуальним та перспективним пошук нових безпечних високоефективних iмуномодуля-торiв з вибiрковою дiею на окремi ланки iмунiтету. До таких iмуномодуляторiв можуть бути вщнесеш бiологiчнi речовини вищих базидiальних грибiв, на-самперед 1х полюахариди та бiлки.
Основним механiзмом iмуномодулювальних ефектiв полiсахаридiв глiканiв базидiальних грибiв е 1х стимулююча дiя на клиини фагоцитарно! си-стеми. Ця дiя проявляеться в активацii фагоцитозу, внутршньоклиинно! бактерицидностi, переварю-вання, цитотоксичноси та секрецii iмунорегулятор-них цитоюшв [2].
На сучасному ринку лжувально-проф^актичних препаратiв збiльшуеться попит на препарати, ство-ренi на основi мщелж вищих базидiальних грибiв. Зауважимо, що таю препарати мютять природнi бь ологiчно активнi комплекси, а не окремi бiологiчно активнi речовини, вид^еш з мiцелiю або культу-рально! рiдини. Зокрема, серед таких бюлопчно ак-тивних добавок: "Мжосви" [3], "Трамелан" [4], "Cor-iolus-MLR" [5] та ряд шших.
У зв'язку з цим перспективним е дослщження iмуномодулювальних властивостей мiцелiю штамiв базидiальних грибiв з вiтчизняних Колекцiй чистих культур, яю продемонстрували високi показниками росту та наявшсть бiологiчно активних речовин на еташ скринiнгу [6, 7].
Базидiальнi гриби роду Coriolus Quel. (Trametes Fr.) е перспективними продуцентами для промис-лово! бютехнологп завдяки наявносп в мiцелii та культуральному ф^ьтраи речовин (полiсахариди, ферменти, б^ки, лiпiди та iншi) з широким спектром лжувальних властивостей - вщ антибактерiальних до протипухлинних. 1муномодулювальш властиво-стi встановлено для полiсахаридiв PSK i PSP, ви-д^ених з Coriolus versicolor [8-10], що у виглядi комерцiйних препаратiв широко використовуються у лiкувальнiй практицi як iмуномодулятори та про-
типухлинш засоби в поеднанш з хiмiо- та радюте-рапiею. Iмyномодyлювальний потенщал глибинного мiцелiю не дослiджyвався.
Тому, метою роботи 6уло встановлення iмyномо-дyлювальних властивостей препарату бiомаси ба-зидiального гриба Coriolus versicolor 353 шляхом до-слiдження його впливу на функщональну активнiсть клiтин фагоцитарноï системи, iнтерфероногенез та продyкцiю фактору некрозу пухлини-а на експе-риментальнш моделi iнтактних мишей в системi in vivo.
2. Матерiали та методи дослщження
У робой використовували люфШзовану 6ioMacy штаму базидiального гриба Coriolus versicolor 353. Бюмасу отримували методом глибинного культиву-вання при температyрi 30°С при перемiшyваннi 3i швидюстю 120 об/хв протягом 4 д1б. Культивування проводили на оптимiзованомy середовищi ОКС (г/ дм3): глюкоза - 20; дрiжджовий екстракт - 3,0; пептон - 3,0; K2HPO4 - 1,0; KH2PO4 - 1,0; MgSO4 - 0,25; пивне сусло - 20 см3/дм3. рН вихщного середовища встановлювали за допомогою 0,1 N HCl на рiвнi 5,0. Бюмасу люфшьно висушували за допомогою прила-ду Freeze Dryer 4.5 USA при попередньому заморожу-ванш до - 50°С.
Експериментальнi дослщження iмyномодyлю-вальних властивостей бiомаси проводили на мишах лiнii BALB/c (18-20 г), самицях вжом 6-8 тижшв, якi отримували iз розплiдника 1нституту молекyлярноi бiологii та генетики НАН Украши. Усi дослiдження проводились iз урахуванням норм 6вропейськоi кон-венцп по захисту хребетних тварин, що використову-ються для експериментальних та наукових щлей вiд 20.09.1985 та закону Украши № 3447-IV «Про захист тварин вщ жорстокого поводження» [11].
Мишам перорально вводили суспензт препарату бюмаси базидiального гриба C.versicolor 353 у фiзiоло-гiчномy розчиш (50 мкг на тварину) щодоби протягом
9 дiб. У контрольну групу увшшло 10 умовно-здо-рових мишей, яю перорально отримували фiзiоло-гiчний розчин. На 1, 3, 6 та 9 добу вщ декаштованих мишей, якi попередньо отримували повну анестезж, вiдбирали перитонеальний ексудат та перифершну кров. Фyнкцiональнy актившсть макрофагiв пери-тонеального ексудату (МФПЕ) дослщжували за iх здатнiстю до накопичення реактогенних метаболтв кисню в теси вiдновлення нiтросинього тетразолiю (НСТ-тест) спектрофотометричним методом, а також до поглинання латексу загальноприйнятим методом дослщження [12]. Визначали юлькють НСТ-позитив-них макрофапв у спонтанному та стимульованому НСТ-тестах. За рiзницею мiж показниками спонтанного та стимульованого НСТ-тесту визначали функ-щональний резерв (ФР) МФПЕ. Поглинальну актившсть ощнювали за показником фагоцитозу (ПФ) - юлькютю МФПЕ, здатних до поглинання латексу, та фагоцитарним числом (ФЧ) - середньою юлькютю частинок латексу, яю поглинались МФПЕ.
У сироватщ кровi визначали концентрацiю штер-ферону та фактора некрозу пухлин-а (ФНП-а).Сиро-ватку зберiгали при -20°С не бшьше 2 тижнiв.
Активнiсть штерферону визначали шляхом Mi-кротитрування у перещеплювальнш культурi ди-плоïдних фiбробластiв мишей L-929. Облiк резуль-TaTiB проводили при мiкроскопiï пiд швертованим мiкроскопом. Активнiсть iнтерферону оцiнювали за пригшченням цитопатичноï дiï вiрусу везикулярного стоматиту (ВВС). За титр штерферону приймали те розведення зразка, при якому спостертвся захист 50% моношарiв клиин вщ цитопатичноï дп 100 ТЦДбо/0,1 мл ВВС. При кожному окремому титруван-нi зразюв використовували пробу референс-штерфе-ронiв-a ^жнародний стандарт В 69/19) з вщомою активнiстю [12].
Вмiст ФНПа у сироватщ кровi дослiджували за-гальноприйнятим методом за цитотоксичною дieю на перещеплювальнш культурi фiбробластiв мишей L-929. Кiлькiсть ФНПа у сироватщ кровi визначали за iндексом цитотоксичноси (1Ц, %), який обчислювали за формулою:
1Ц _ ОГ (контролю AcD)- ОГ (зразка) ^ ^^ ОГ (кoнтролюAcD)
де ОГ (контролю АсD) - середне арифметичне оптичноï густини в лунках з контролем АсD; ОГ (зразка) - середне арифметичне оптичноï густини в лунках iз одним дослщжуваним зразком [12].
Всi отримаш цифровi данi опрацьовували за допомогою комп'ютерноï програми Epi Info (верия 6.0) методом варiацiйноï статистики з використанням критерж Стьюдента. З метою ощнки окремих по-казниюв використовували '¿х середне арифметичне значення ± похибка середнього (M± m) [13].
3. Результати i обговорення
Coriolus versicolor (L. ex Fr.) Quél, який належить до дереворуйшвних грибiв бiлоi гнилi, мае досить тривалу юторж використання у Схщнш медицинi. Наприклад, у Китаi препарати на основi цього гриба застосовують в терапii iнфекцiйних хвороб, зокрема при шфекцшно-запальних процесах верхнiх дихаль-них шляхiв, сечостатевоi системи i травного каналу, а також для оздоровлення печшки (в т.ч. при гепатитах В) та для корекцп показниюв iмунореактивностi органiзму. Цей гриб добре адаптований до рiзних температурних умов. Зустрiчаеться в трошчних, суб-тропiчних i високотемпературних клiматичних широтах, росте на вщмерлих стовбурах, пнях та гiлках листяних та, рщше, хвойних дерев [8, 14].
В наших попередшх дослщженнях було показано [15], що бюлопчно активнi речовини бiомаси базидь ального гриба штаму C. versicolor 353 стимулювали здатшсть макрофагiв до накопичення реактогенних метаболтв кисню in vitro, що свщчить про можли-вють iндукцii неспецифiчноi iмунноi вiдповiдi цим препаратом в системi in vivo.
Показано, що шсля введення штактним мишам препарату бiомаси базидiального гриба C. versicolor 353 шдвищувалась функщональна активнiсть МФПЕ, зокрема '¿х киснезалежна бактерициднiсть, що пiдтверджувалось суттевим зростанням юлько-стi НСТ-позитивних клиин у спонтанному НСТ-те-
сть Так, шд впливом цього препарату встановлено активащю киснезалежно! бактерицидно! активноси МФПЕ на 3, 6 i 9 добу (табл. 1). Показники стиму-льованого НСТ-тесту МФПЕ зростали порiвняно з контролем на 3, 6 i 9 добу, однак функцiональний резерв (ФР) збертвся на рiвнi контролю.
Таблиця 1
Функцюнальна актившсть макрофапв перитонеального ексудату мишей, як отримували препарат бюмаси базид1ального гриба C. versicolor353, M ± m
Групи мишей Термш спосте-режен-ня Показники функцюнально! активной
ПФ, % НСТ-тест спон., % НСТ-тест стим., % ФР, %
Контроль - 24,6 ± 8,6 25,6 ± 3,1 24,3 ± 1,8 4,8 ± 1,8
Миш1, яю отримували препарат 1 доба 41,3 ± 2,1* 17,7 ± 3,1 27,8 ± 6,1 6,7 ± 2,0
3 доба 43,1 ± 3,2* 64,0 ± 2,9* 65,0 ± 6,3* 3,9 ± 0,9
6 доба 45,8 ± 4,0* 60,0 ± 3,8* 74,0 ± 3,9* 7,9 ± 1,1
9 доба 50,7 ± 2,9* 58,0 ± 2,9* 61,0 ± 1,1* 3,9 ± 0,8
Прим1тка. *Р < 0,05 пор1вняно з показниками контролю
1з даних, наведених у табл. 1, випливае, що препарат бюмаси C.versicolor 353 мав активуючий вплив на поглинальну актившсть МФПЕ. Шсля введення мишам цього препарату спостертлось тдвищення ПФ на 1, 3, 6 та 9 добу. ФЧ МФПЕ мишей (рис. 1), як отримували препарат бюмаси C. versicolor 353, ста-новило 2,5 ± 0,1; 2,0 ± 0,9; 3,3 ± 0,8 та 4,4 ± 0,9 ум.од. вщповщно на 1, 3, 6 та 9 добу проти 2,4 ± 0,7 ум.од. у контролi (P > 0,05).
Отже, тд впливом препарату бюмаси C. versicolor 353 активащя поглинально! активноси МФПЕ була частковою: упродовж усього термшу спостереження зростав ПФ на Mi незмшного ФЧ.
g
Я 4
g 3
I
«.Il
Контроль 1доба
Здоба 6 доба
9 доба
Рис. 1. Фагоцитарне число макрофапв черевноТ порожнини мишей, як отримували препарату бюмаси С. versicolor 353
Результати проведених нами дослщжень показали, що введення мишам препарату бюмаси C.versicolor 353 призводило до активацп ендогенного штерфероно-генезу (табл. 2). Суттеве накопичення штерферону у сироватщ кровi пiд впливом цього препарату спосте-рiгали уже через 3 доби.
Високий рiвень сироваткового штерферону зберь гався i на 6 добу. Водночас на 9 добу тсля введення
мишам препарату титри штерферону зменшувались до рiвня контролю.
Водночас встановлено, що препарат бюмаси С. versicolor 353 in vivo не впливав на продукщю ФНП-а. Так, тсля введення мишам цього препарату концентращя ФНП-а у сироватщ кровi на 1, 3, 6 i 9 добу не змшювалась вщносно показниюв контролю.
Таким чином, препарат бюмаси C.versicolor 353 на експериментальнш моделi штактних мишей мав iмуномодулювальний вплив. Шсля перорального введення цього препарату мишам протягом 9 дiб шдвищувалась функцюнальна актившсть кл^ин фагоцитарно! системи та продукцiя ендогенного ш-терферону.
Разом з тим цей препарат не впливав на продукщю потужного прозапального цитокшу - ФНП-а, що свщчить про вщсутшсть розвитку запально! реакцп органiзму. Препарат бюмаси C.versicolor 353 е перспективним для створення препарату iз iмуномоду-лювальною дiею, але потрiбнi додатковi дослiдження його впливу на iншi показники iмунореактивностi органiзму, зокрема на продукщю iмунорегуляторних цитокiнiв рiзних опозицiйних груп, як на моделi ш-тактних тварин, так i при рiзних патологiчних станах.
Таблиця 2
ПродукЩя iнтерферону та фактора некрозу пухлин-а пiсля введення мишам препарату бюмаси С. versicolor353
Групи мишей Термш спостереження Титри штерферону, log2, Од/мл Концентращя ФНП, 1ЦТ (%)
Контроль - 5,0 ± 0,8 2,9 ± 0,7
Миш^ якi отримували препарат 1 доба 5,1 ± 0,9 1,9 ± 0,8
3 доба 8,0 ± 0,1* 2,3 ± 0,3
6 доба 8,2 ± 0,1* 4,3 ± 1,8
9 доба 5,2 ± 0,3 2,7 ± 0,9
Примiтка. *Р < 0,05 порiвняно з показниками контролю
Висновки
1. Препарат бюмаси C.versicolor 353 в дозi 50 мкг/ мишу при пероральному введенш штактним мишам протягом 9 дiб щодоби активував клггин фагоцитарно! системи: спостертлось пiдвищення здатно-стi макрофапв черевно! порожнини до накопичення реактогенних метаболтв кисню в НСТ-тестi на 3, 6 та 9 добу, а також часткова активащя !х поглиналь-но! функцп протягом усього термшу спостереження (зростав ПФ на Mi незмшного ФЧ).
2. Препарат бюмаси C. versicolor 353 in vivo ефек-тивно шдукував продукщю «шзнього» штерферону, про що свщчило тдвищення титрiв штерферону в сироватщ кровi на 3 та 6 добу.
3. Препарат бюмаси C. versicolor 353 in vivo не впливав на продукщю потужного прозапального цитокшу - ФНП-а : концентращя цього цитокшу у сироватщ кровi не змшювалась упродовж усього перюду спостереження.
4. Препарат бюмаси C. versicolor 353 е перспективним для створення препарату iз iмуномодулювальною дiею для корекцп функцюнально! активносп клиин фагоцитарно! системи та продукцп штерферону.
Лиература
1. Смирнов, Д. А. Влияние полисахаридов глубинных культур Ganoderma lucidum, Lentinus edodes, Crinipellis schevcze-nkovi на фагоцитарну активность нейтрофилов [Текст] / Д. А. Смирнов, В. Г. Бабицкая, Т. А. Пучкова, В. В. Щерба // Биотехнология. - 2007. - № 1. - С. 47-51.
2. Караваева, А. В. Грибные гликаны как иммуномодуляторы и перспективы их практическог о использования [Текст] / А. В. Караваева, М. А. Кашкина // Микология и фитопатология. - 1994. - Т.28. - Вып.6. - С.76-84.
3. Бухало, А. С. Лекарственные препараты и пищевые добавки из макромицетов [Текст] / А. С. Бухало, Э. Ф. Соломко, С. П. Вассер, О. Б. Михайлова // Успехи медицинской микологии: материалы 3-го Всероссийского конгресса (Москва, апрель 2005 г.). - М., 2005. - Т. V, Глава 7. - С.254-256.
4. Скворцова, М. М. Трамелан: опыт клинического применения [Текст] / М. М. Скворцова, Е. С. Горшина // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2009. - № 2. - С. 211-212.
5. Горшина, Е. С. Глубинное культивирование грибов рода Trametes Fr. с целью получения биологически активной биомассы: дисс. ... канд. биол. наук: 03.00.23, 03.00.24 [Текст] / Е. С. Горшина. - М., 2003. - 250 с.
6. Антоненко, Л. А. Особливост росту Coriolus versicolor у глибиннш культур! // Л. О. Антоненко, I. Р. Клечак, Н. Ю. Ми-тропольська, О. I. Нишпорська // Наую^ вют НТУУ «КП1». - 2009. - №1 (63). - С.128-133.
7. Антоненко, Л. А. Грибы рода Сoriolus Quel (Trametes Fr.) - продуценты биологически активных веществ [Текст] / Л. А. Антоненко, И. Р. Клечак, В. Н. Кучма, Ю. С. Крысюк / / материалы международной научной конференции: «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 31 мая - 4 июня 2010). - Минск, 2010. - С. 96-99.
8. Hobbs, Ch. Medicinal value of Turkey Tail fungus Trametes versicolor (L.: Fr.) Pilat (Aphyllophoromycetideae). A literature review // Int. J. Med. Mushr. - 2004. - Vol. 6. - P. 195-218.
9. Vincent, E. C. Ooi A review of pharmacological activities of mushroom polysaccharides / Vincent, E. C. Ooi, Fang Liu // Int. J. Med. Mushr. - 1999. - Vol. 1. - P. 195-206.
10. Даниляк, М. I. Лшарсьга гриби. Медичне застосування та проблеми бютехнологй [Текст] / М. I. Даниляк, С. В. Решет-шков. - К.: !н-т боташки ¡м. М.Г. Холодного НАН Украши, 1996. - 65с.
11. Резшков, О. Г. Проблеми етики при проведенш експериментальних медичних i бюлопчних дослщжень на тваринах [Текст] / О. Г. Резшков // Вкник НАНУ. - 2001. - № 11. - С. 5-7.
12. Современные методы диагностики вирусных респираторных инфекций и их терапии с использованием препаратов интерферона (Методические рекомендации) [Текст] / Под. ред. А. Ф. Модзолевского, Н. С. Дяченко, Н. Я. Спивака. - К., 1994. - 18 с.
13. Pagano, M. Regulation of the cell cycle by the cdk2 protein kinase in cultured human fibroblasts / Pagano M., Pepperkok R., Lukas J., Baldin V., Ansorge W., Bartek J. and Draetta G. // J. Cell Biol. - 1993. - 121. - РР. 101-111.
14. Stamets, P. Growing gourmet and medicinal mushroom / Stamets P. - Berkeley Toronto: Ten Speed Press, 2000. - 574 p.
15. Антоненко, Л. А. Иммуномодулирующие свойства биомассы базидиальных грибов рода Coriolus (Trametes) [Текст] / Л. А. Антоненко, И. Р. Клечак, Л. Н. Лазаренко // материалы международной научной конференции «Микробиологическая биотехнология - наукоёмкое направление современных знаний» (Кишинев, Молдова, 6-8 июля 2011 г.). - Кишинев, 2011. - С.129.
