CC BY
53
5. Карелина Л.Н., Ильина О.П., Власов Б.Я. Витамин С - сберегающий эффект малоновой кислоты у цы-плят-бройлеров при темновом стрессе // Ветеринария. - 2008. - № 5. - С. 44-45.
6. Кармолиев Р.Х., Кармолиев Р.Р., Нестеров В.В. Теоретические основы в биохимии испытания биологически активных соединений сукцината и аминоацетата // Докл. РАСХН. - 2006. - № 2. - С. 35-39.
7. Кондрашова М.Н. Шкала отклонений состояния митохондрий от нормы и вещества, обращающие эти изменения // Реакции живых систем и состояние энергетического обмена. - Пущино, 1979. - С. 185-191.
8. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньщикова [и др.]. - М.: Слово, 2006. -C. 136-140.
9. Биохимические маркеры развития окислительного стресса у новорожденных телят / М.И. Рецкий, Д.Б. Чусов, Т.Г. Ермолова [и др.] // Ветеринария. - 2008. - № 8. - С. 47-49.
10. Защитное действие глутаминовой кислоты при гемической гипоксии у кур-молодок / А.Б. Симонян [и др.] // Ветеринария. - 1998. - № 5. - С. 52-54.
11. Взаимосвязь между пероксидным окислением липидов и содержанием веществ низкой и средней молекулярной массы при интоксикации животных ацетальдегидом / И.П. Степанова, Л.М. Дмитриева, А.Г. Патюков [и др.] // С.-х. биология. Биология животных. - 2004. - № 6. - С. 16-19.
12. Ураков А.Л. Малонатподобное действие антиангинальных препаратов // Вопр. мед. химии. - 1982. -№ 3. - С. 127-130.
УДК 636.082.22:612.1 И.Ю. Еремина, Г.В. Макарская, С.В. Тарских
ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ КИСЛОРОДНОГО МЕТАБОЛИЗМА КЛЕТОК КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
На основе анализа данных функциональной активности клеток в цельной крови быков методом люминолусиленной хемилюминесценции за 1999-2009 гг. выявлена возрастная и сезонная динамика способности клеток генерировать активные формы кислорода в ответ на антигенную стимуляцию. Определены параметры кинетики хемилюминограмм, определяющие нормо-, гипо- и гиперпродуктивный типы реактивности клеток крови быков на антигенную провокацию.
Ключевые слова: бык-производитель, возрастные особенности, клетки крови, метаболизм.
I.Yu. Eremina, G.V. Makarskaya, S.V. Tarskikh AGE PECULIARITIES OF THE CATTLE BLOOD CELLOXYGEN METABOLISM
The age and seasonal dynamics of cellability to generate the oxygen active kinds in reply to antigenic stimulation is revealed on the basis of the analysisof data about cell functional activityin bull whole blood by means of the technique of luminolintensifiedchemiluminescence in 1999-2009 period. Chemiluminogram kineticsparameters which determine norm-, hypo- and hyperproductive types of bull blood cellreactivity on antigenic provocation are determined.
Key words: bull, age peculiarities, blood cells, metabolism.
Развитие организма в онтогенезе определяется формированием его тканеспецифических систем и их функциональных свойств, что отражается в устойчивости организма к разного рода воздействиям внешней среды в определенные возрастные периоды. Особую роль в адаптационной устойчивости организма играет система гемоиммуногенеза, гомеостатические свойства которой определяются интеграционной слаженностью функционирования гуморальных и клеточных факторов. Одним из механизмов, обеспечивающих неспецифическую резистентность организма, является способность лейкоцитарных клеток продуцировать активные формы кислорода (АФК) в процессе своего функционирования, наиболее выраженная в состоянии антигенной активации [1, 2]. В компетенцию клеток, обладающих фагоцитарной активностью, входит выполнение функций неспецифической резистентности организма как первичной реакции на вторжение антигенных агентов, а также важная роль в кооперативных взаимодействиях специализированных иммунокомпетентных клеток организма в
процессе специфического иммунного ответа [1, 3]. Генерация АФК: супероксиданиона, гидроперекиси, гидроксила, гипохлоританиона является обязательным эффектом активации и функционирования клеток в процессе фагоцитоза в норме, и в то же время антигендеструктирующим свойством противомикробного, противовирусного, противопаразитарного иммунитета [1-3]. Кинетика продукции АФК в системе клеток нефракционирован-ной крови при антигенной активации in vitro отражает не только потенциал активации кислородного метаболизма фагоцитирующих клеток, но и функционирование кооперативно взаимодействующих с ними про- и антиок-сидантных факторов плазмы крови и других клеточных субпопуляций [4, 5]. Регистрируемая кинетика активированного in vitro респираторного взрыва в образце крови представляет собой интегральную характеристику кислородзависимой неспецифической реакции системы крови на антиген.
Оценка уровня кислородного метаболизма клеток периферической крови позволяет не только определить уровень неспецифической защищенности организма при различных обстоятельствах, но и в случае гипо- или гиперпродукции АФК клетками оценить необходимость проведения ее коррекции.
Цель настоящей работы состояла в исследовании особенностей кислородного метаболизма клеток цельной крови быков-производителей и его возрастной и сезонной динамики.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования являлись быки-производители ФГУП «Красноярскгосплем» Емельяновского района Красноярского края. Материалом исследования являлась периферическая кровь, отбираемая в период ежегодных плановых весенне-осенних ветеринарных обследований. Функциональную активность клеток крови быков, полученной из яремной вены, при антигенной стимуляции in vitro оценивали по кинетике генерации АФК, регистрируемой микрометодом люминолусиленной хемилюминесценции с использованием аппаратурно-программного комплекса «Хемилюминометр CL-3604» - ПЭВМ (СКТБ «Наука») [6-8]. Время записи хемилюминесцентной кривой составляло 180 мин при температуре в регистрационной камере +37оС. Реакционная смесь регистрационной кюветы состояла из 200 мкл 2,2х10-4 М люминола (Sigma) в растворе Хенкса (рН 7,2), 100 мкл разведения (1:1, 1:5, 1:10) крови животных в растворе Хенкса, 50 мкл суспензии монодисперсных частиц латекса (ВНИИСК, С-Петербург) (5х108 част/мл), опсонизированных белками пуло-вой сыворотки крови человека. О кинетике генерации АФК в системе клеток цельной крови быков судили по параметрам хемилюминесцентной кривой, принимая во внимание наиболее информативные: амплитуду максимальной активности хемилюминесцентной реакции (Imax - имп/с), время достижения максимума (Tmax - мин) и площадь под кривой хемилюминесценции (S - имп. за 180 мин), определяющей общее количество АФК, генерируемых клетками за время записи хемилюминесцентной кривой.
Определение количества лейкоцитов и активных фагоцитов в периферической крови быков выполняли методом счета в камере Горяева при окрашивании метиленовым синим или генцианвиолетом в 3% уксусной кислоте [9,10].
Результаты и их обсуждение
Особенностью лейкоцитарного состава периферической крови крупного рогатого скота является преобладание лимфоцитарных клеток (свыше 64%), объем продукции АФК которых невысок [10]. Гранулоциты, являющиеся основными участниками фагоцитоза в кровяном русле и обладающие высокой активностью генерации АФК, составляют менее 30%. Исследование хемилюминесцентной кинетики генерации АФК клетками в цельной крови быков-производителей выявило закономерные отличия хемилюминесцентных кривых при разведении крови (рис.1). С уменьшением содержания лейкоцитарных клеток в тестируемом образце достоверно (P<0,05) снижалась не только амплитуда максимума хемилюминесцентной кривой респираторного взрыва, но и изменялся вид кривой. Кривая с двумя четко выраженными максимума при разведении крови в два раза превращалась в кривую с одним при разведении в 6 раз или двумя сглаженными максимумами при разведении в 11 раз, последние же мало отличались друг от друга (рис.1) только по параметру времени достижения максимума Tmax. Очевидно, такая закономерность связана с сокращением числа полиморфноядерных клеток крови, активно продуцирующих АФК в тестируемом образце при разведении и, возможно, с исчезновением нейтрофилов, характеризующихся быстрым типом продукции АФК [3]. Во избежание потери информации об особенностях кислородного метаболизма клеток в крови в последующих исследованиях использовали двукратное разведение крови и 180-минутный период регистрации кинетики генерации АФК в антигенактивированном in vitro респираторном взрыве.
I, имп/с
Продолжительность регистрации, мин
Рис. 1. Кинетика генерации АФК антигенактивированными in vitro клетками в цельной крови быков-производителей (n=20) при разведении раствором Хенкса в 2 (1), 6 (2) и 11 (3) раз
7000
6000
5000
О
1= 4000
s
S
, 3000 2000 1000 0
□ Imax (I), имп./с
□ Imax (II), имп./с
X „ г
ft 1
1
Sfc Й 5 * Д
Рис. 2. Межгодовая динамика величины амплитуды максимумов кинетики (Imax(I) и Imax(II)) и объема продукции (S) АФК антигенактивированными in vitro клетками в цельной крови быков-производителей
Анализ данных многолетних наблюдений (1999-2008 гг.) выявил, что для животных разного экогенеза, возраста в различные сезонные промежутки характерен особый вид кинетики продукции АФК [7]. Это выражается в изменении амплитуды первого !теа(!) и второго !тах(!!) максимума, а также их соотношения, величины общего объема (5) продуцируемых АФК (рис. 2). Сравнение параметров индивидуальных хемилюминесцент-ных кривых с значением параметра 5 среднестатистической кинетики, полученной при исследовании 832 образцов крови быков, выявило, что 32% животных относится к нормопродуктивному типу активности клеток в реакции на антиген (рис. 3, табл. 1), т.е. отклоняется не более чем на 33% от среднестатистической нормы [11]. 48% животных - гипопродуктивны, для 20% характерна гиперпродукция АФК. При этом в весенний период число случаев гипопродуктивного ответа на антиген возрастает на 7% по сравнению со среднегодовым, осенью же снижается на 1%. В осенний период доля быков с нормопродукцией АФК больше по сравнению с весенним, зимним периодами и средним многолетним на 6, 26 и 3% соответственно. В феврале отмечалось наибольшее число отклонений от среднестатистической нормы. Лишь 9% обследованных животных характеризовались нормопродуктивным типом генерации АФК, 52% были гиперпродуктивны, притом численность лейкоцитарных клеток в периферической крови этих групп животных достоверно не отличалась (см. табл.). Отличительной особенностью кинетики при нормопродуктивном типе генерации АФК является стабильность временного интервала между первым и вторым максимумом (102 ± 2 мин) во все сезоны.
1GG
8G
6G
2G
■
і 1 ■ 1 1
среднегодовое весна
зима
осень
G
□ гипопродукция □ нормопродукция ■ гиперпродукция
Рис. 3. Распределение обследованных быков по типу АФК-продуктивности антигенактивированных in vitro клеток периферической крови в различные сезонные периоды
Значения параметров кинетики генерации АФК антгенактивированными in vitro клетками цельной крови быков-производителей с нормо-, гипо- и гиперпродуктивным типом активности
фагоцитирующих клеток
Пе- риод Тип про- дук- ции Воз- раст, мес. Лейкоциты, млн кл/мл ФИ, % Imax (I), имп/с Imax (II), имп/с S, млн имп. за 180 мин Tmax (I), мин Tmax (II), мин S/лей ко- цит, имп/к л S/фаг о-цит, имп/к л
1 2 3 4 5 б 7 В 9 10 11 12
Среднее многолет- нее 37 ± 1 787 7,3 ± 0,1 558 39 ± 1 268 1909 ± 63 829 1836 ± 60 818 13,72 ± 1,01 832 25 ± 1 829 130 ± 1 818 41 ± 6 558 139 ± 9 268
Окончание табл.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Среднее многолетнее ги- по- 35 ± 1 381 7,0 ± 0,1 296 40 ± 1 115 1325 ± 42 395 933 ± 40 384 5,22 ± 0,11 398 22 ± 1 395 137 ± 1 384 16 ± 1 296 64 ± 4 115
нор мо- 38 ± 1 247 7,0 ± 0 175 39 ± 1 108 1777 ± 71 264 1825 ± 53 264 12,98 ± 0,16 264 27 ± 1 264 129 ± 2 264 39 ± 2 175 132 ± 12 108
ги- пер 39 ± 1 159 8,1 ± 0,3 87 35 ± 2 45 3473 ± 235 170 3889 ± 184 170 34,77 ± 4,55 170 30 ± 2 170 116 ± 3 170 122 ± 39 87 474 ± 192 45
Весна ги- по- 36 ± 1 196 7,0 ± 0,2 179 34 ± 2 51 1233 ± 46 197 1105 ± 64 189 4,83 ± 0,15 250 23 ± 1 197 143 ± 2 189 15 ± 1 179 69 ± 8 51
нор мо- 38 ± 2 119 7,5 ± 0,3 76 32 ± 2 42 1748 ± 82 129 1772 ± 86 129 12,97 ± 0,23 129 28 ± 2 129 126 ± 3 129 39 ± 2 76 146 ± 13 42
ги- пер 43 ± 2 69 8,0 ± 0,5 16 30 ± 5 9 2153 ± 171 71 3124 ± 268 71 26,79 ± 0,99 71 37 ± 3 71 104 ± 6 71 60 ± 5 16 242 ± 48 9
Зима ги- по- 48 ± 4 22 9,1 ± 0,6 22 670 ± 81 22 744 ± 61 22 5,54 ± 0,44 22 28 ± 6 22 132 ± 5 22 13 ± 1 22
нор мо- 41 ± 8 5 10,6 ± 0,7 5 1717 ± 610 5 1704 ± 147 5 12,12 ± 1,43 5 28 ± 14 5 132 ± 11 5 23 ± 2 5
ги- пер 23 ± 3 27 9,8 ± 0,5 29 32 ± 4 15 7720 ± 611 29 5648 ± 497 29 45,91 ± 2,90 29 20 ± 2 29 126 ± 3 29 101 ± 9 29 319 ± 48 15
Осень ги- по- 32 ± 1 164 6,6 ± 0,2 95 44 ± 2 61 1507 ± 76 176 770 ± 51 173 5,62 ± 0,15 176 20 ± 1 176 132 ± 2 173 21 ± 1 95 60 ± 5 61
нор мо- 38 ± 2 123 7,3 ± 0,3 94 44 ± 2 66 1808 ± 118 130 1883 ± 64 130 13,01 ± 0,24 130 27 ± 2 130 131 ± 2 130 40 ± 2 94 123 ± 17 66
ги- пер 41 ± 2 63 7,1 ± 0,5 42 38 ± 4 20 3092 ± 324 67 3972 ± 245 67 38,76 ± 11,38 67 27 ± 2 67 125 ± 2 67 159 ± 80 42 703 ± 429 20
При гипопродукции АФК этот показатель больше в среднем на 13 мин, а в весенний период увеличивается до 121 мин (см. табл.) за счет сокращения времени наступления первого максимума. Поскольку амплитуда первого максимума также ниже его среднестатистического значения, можно заключить, что не реализуется или недостаточен прооксидантный потенциал клеток, что снижает обеспечение ими неспецифической резистентности организма. Такие животные более подвержены инфекционным воздействиям. В случае гиперактивного типа продукции АФК отмечается сокращение временного интервала между максимумами в среднем до 89 мин в основном за счет сокращения времени достижения второго максимума на 7-30 мин относительно среднестатистического значения и значения при нормопродукции. В весенний период у гиперпродуктивного типа проявляется еще увеличение величины времени наступления первого максимума при возрастании значения его интенсивности, что свидетельствует о недостаточной активности антиоксидантных систем. Двукратно более высокий, чем в норме объем продукции АФК в системе крови, может стать причиной повреждения не только чу-
жеродных антигенных структур, но и собственных молекулярных структур клеток, если такой уровень продукции АФК будет сохраняться длительное время. Животные с гиперпродуктивным, а особенно с гипопродуктив-ным типом генерации АФК - клетками крови, характеризуются менее устойчивым адаптивным потенциалом и, очевидно, нуждаются в проведении коррекции с помощью витаминных и иммуномодулирующих препаратов. В случае гипопродуктивности следует корректировать активность клеток введением в питание витаминных компонентов с прооксидантным действием. При гиперпродуктивном - введением антиоксидантов с кормом, предварительно оценив, не следствие ли это воспалительного процесса при «нездоровье».
Анализ параметров хемилюминограмм быков, выбракованных в 2009 году, показал, что все они входили в группу с гипопродуктивной активностью клеток крови.
Сравнение значений среднего возраста животных в обследуемых выборках выявило их неравнозначность. Корреляционный анализ связи значений среднего возраста с усредненным значением для выборок объемом антигенактивированной продукции АФК в весенний и осенний периоды определил достоверную прямо пропорциональную зависимость (Рвесна=0,75 и Росень=0,78 при Ртабл=0,6) (рис. 4). Полученная закономерность послужила отправной точкой для более детального анализа возрастных особенностей кинетики генерации АФК антигенактивированными in vitro клетками в крови быков.
25
н
к
м о 20 00
15
ей
СО
а
м
к
* 10
GO
5
0
весна
осень
0
10
d*
□
□ ♦
□ □ ♦ ♦
1 ♦ _пт 1 1 1
40
50
20 30
Возраст, мес.
Рис. 4. Объем продукции АФК антигенактивированными in vitro клетками в цельной крови быков-производителей разных возрастных групп в весенний и осенний периоды разных лет обследования
Обнаружено, что с возрастом закономерно изменяется по величине соотношение амплитуды 1-го и 2-го максимумов (рис. 5): в возрасте 1,5-2-х лет по амплитуде доминировал 1-й максимум, в 2,5-4 года амплитуда максимумов выравнивалась, в возрасте с 5 до 9 лет доминировал 2-й максимум. Для каждой возрастной группы до 5,5 лет характерна динамика повышения общей (Б) и удельной (Э/лейкоцит) продукции АФК от осеннего к зимнему периоду и снижение к весеннему до уровня, ниже осеннего. Для особей старше 6 лет выявлено закономерное снижение этих характеристик от осени к весне (см. рис. 5). С возрастом у животных старше 5 лет в осенний период проявляется тенденция снижения активности антиоксидантных систем в крови, о чем свидетельствует возрастание объема продукции АФК клетками при антигенной активации (см. рис. 5) выше среднестатистических значений для вида (табл.).
В весенний период у быков этого же возраста проявляется тенденция снижения активности проокси-дантных факторов АФК-генерирующих клеток, что может сопровождаться снижением резистентности организма к внешнему антигенному внедрению.
На современном этапе совершенствования породных типов остро стоит вопрос о необходимости разработки эффективных методов разведения и селекции, обеспечивающих повышение племенных и продуктивных качеств животных, улучшение качества продукции. При этом для практического использования важно, чтобы воспроизводство животных, базирующееся на использовании искусственного осеменения и характеризующееся малым числом производителей (и, соответственно, одновременным увеличением влияния отдельных особей на повышение продуктивности), основывалось на научно обоснованных программах,
предотвращающих возможный ущерб из-за ошибок при оценке генетической ценности этих производителей. Разработка программ на основе объективных данных о состоянии животных, возможностей реализации их генетического потенциала и своевременное диагностирование проблемных зон, начальных этапов патологических процессов является актуальной.
7000
н) □ □ 1(1Г
d г2 ■ нч нч г( ■
СО ■ нч н-ч^ со ■
Рис. 5. Возрастная динамика значений амплитуды максимумов кинетики продукции АФК антигенактивированными in vitro клетками в цельной крови быков-производителей: 1 - зимний период;
2 - весенний период; 3 - осенний период
Мониторинг функциональной активности иммунокомпетентных клеток (ФА ИКК) может способствовать формированию объективного прогноза и программ.
Таким образом, выявленные закономерности возрастной динамики функциональной активности клеток крови быков-производителей, с учетом сезонных колебаний, позволяют выявлять периоды наиболее устойчивого состояния гомеостаза организма и при необходимости осуществлять и контролировать немедикаментозную коррекцию про- и антиоксидантного потенциала организма на основе использования хемилю-минесцентного микрометода оценки респираторной активности клеток крови при антигенной активации.
Литература
1. Бахов Н.И., Mайчук Ю.Ф., Корнев А.В. Механизмы защиты организма от вирусных инфекций: нейтро-фильные лейкоциты //Успехи современной биологии. - 2000. - Т.130. - № 1. - С.23-35.
2. Белова Л.А. Биохимия процессов воспаления и поражения сосудов. Роль нейтрофилов // Биохимия. -1997. - Т.62. - Вып.6. - С.659-668.
3. Герасимов И.Г., Игнатов Д.Ю. Функциональная неравнозначность нейтрофилов крови человека: генерация активных форм кислорода // Цитология. - 2001. - Т.46. - № 5. - С.432-436.
4. Tono-Oka, Norihito V., Takohide M. Chemiluminescence of whole blood: 1. A simple method for the estimation of phagocytic function of granulocytes and opsonic activity in whole blood //Clin. Immunol. Immunopa-thol. - 1983. - V.26, № 1. - P.66-75.
5. Functional states of polymorphonuclear leucocytes determined by chemiluminescent analysis / M.Y. Magris-so [et al.] //Luminescence. - 2000. - V.15. - P.143-151.
6. Изучение функционального состояния фагоцитов человека (кислородный метаболизм и подвижность клеток): метод. рекомендации. - М.: Изд-во Ин-тута иммунологии МЗ СССР, 1988. - 20 с.
7. Еремина И.Ю., Mакарская Г.В., Шатурина Л.П. Сравнительный анализ кинетики генерации АФК клетками крови быков-спермодоноров // Вестн. КрасГАУ. - 2005. - № 7. - С.159-164.
8. Mакарская Г.В., Лопатин В.Н., Тарских С.В. Хемилюминесцентный анализ функциональной активности фагоцитирующих клеток крови рыб // Докл. АН. - 2003. - Т. 390, № 3. - С. 420-422.
9. Лабораторные методы исследования в клинике: справ. / В.В. Mеньшиков [и др.]. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.
10. Лабораторные исследования в ветеринарии / под ред. В.Я. Антонова и П.Н. Блинова. - М., 1974.
11. Земсков A.M., Земсков B.M. Дополнительные методы оценки иммунного статуса // Клиническая лабораторная диагностика. - 1994. - № 3. - С.34-35.
