CC BY
45
разования было отмечено в 100% случаев, причем у E. cloacae коэффициент ПО достоверно увеличился в среднем на 12,2%, у E. agglomerans - на 13% (р<0,01), у K. pneumoniae - на 15,6% (р<0,01) и у S. aureus - на 5,8% от исходного уровня признака.
Независимо от природы тромбодефенсинов наибольший стимулирующий эффект в отношении пленкообразующей способности микроорганизмов наблюдался при соинкубировании бактерий с тромбодефенси-нами в концентрации, соответствующей 1/4 МПК.
Как видно из представленных результатов, обнаружено модифицирующее влияние антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных на образование биопленок микроорганизмами. Поскольку биопленки - многофакторный феномен, то, вероятно, ТД действуют на различные этапы их развития по нескольким механизмам. Возможно, под воздействием антимикробных пептидов из тромбоцитов in vitro большая часть микробной популяции гибнет, а сохранившие жизнеспособность клетки-персистеры, присутствующие в бактериальной популяции до ее контакта с тромбодефенсинами, обеспечивают более активное формирование биопленок [5].
Литература
1. Доброхотский О.Н., Хомяков Ю.Н., Хомякова Т.И. Эпидемиологическое значение формирования биопленок в технических системах // Научная деятельность. - 2008. - №4. - С. 78-80.
2. Лакин Г. Ф. Биометрия. - М.: Высш. шк., 1990. - 288 с.
3. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing
the principle of protein-dye binding // Anal. Biochev. - 1976. - Vol. 72. - P. 248-254.
4. Merritt J. H., Kadouri D.E., O’Toole G.A. Growing and Analyzing Static Biofilms // Curr. Protoc. Microbiol. -2005.
5. Persister Cells and the Mechanism of Multidrug Tolerance in Escherichia coli / I. Keren, D. Shah, A. Spoering
[et al.] // Specialized J. Bacteriol. - 2004. - Vol. 186. - P. 8172-8180.
6. Tang Y., Yeaman M.R., Selsted M.E. Antimicrobial peptides from human platelets // Infection and Immunity. -2002. - Vol. 70. - №. 12. - P. 6524-6533.
УДК 591.11:598.2:577.3-578.088 Е.Г. Турицына, Г.В. Макарская, С.В. Тарских
ВЛИЯНИЕ АНТИГЕННЫХ СТИМУЛЯЦИЙ ВИРУСВАКЦИНАМИ НА ПАРАМЕТРЫ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ
КЛЕТОК ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ КУР
В статье представлены результаты исследования влияния многократных антигенных стимуляций живыми вирусвакцинами на параметры генерации активных форм кислорода клетками цельной крови кур. Ключевые слова: куры, кровь, вакцинация, хемилюминесценция, активные формы кислорода.
E.G. Turitsyna, G.V. Makarskaya, S.V. Tarskikh
INFLUENCE OF THE ANTIGENIC STIMULATIONS BY THE VIRUS VACCINES ON THE CHEMILUMINESCENCE
PARAMETERS OF HEN WHOLE BLOOD CELLS
The research results of influence of the repeated antigenic stimulations by the live virus vaccines on the parameters of active oxygen form generation by the hen whole blood cells are given in the article.
Key words: hens, blood, vaccination, chemiluminescence, active oxygen forms.
Программы профилактики инфекционных болезней на птицефабриках предусматривают многократные и разнообразные по антигенному составу стимуляции с целью выработки у привитого поголовья специфических антител, способных при необходимости защитить птицу от инфекции. Основными чертами общих структурных изменений в организме при вакцинациях являются гиперпластические процессы со сторо-
ны лимфоидных и макрофагальных элементов организма, клеточная трансформация, приводящая к появлению бластных клеток и развитию плазмоцитарной реакции, изменение метаболической активности иммуно-компетентных клеток [1].
Система неспецифической резистентности реагирует на антигенную стимуляцию изменением активности ее функциональных компонентов. В этом процессе важную роль играют фагоцитирующие клетки периферической крови, функциональная активность которых обеспечивается не только адгезивными и лизо-сомальными свойствами, но и способностью генерировать реакционноспособные активные формы кислорода [2]. Исследования кинетики генерации активных форм кислорода (АФК) клетками крови при антигенной нагрузке и без нее хемилюминесцентным методом позволяют контролировать состояние функциональной активности клеток неспецифической резистентности [3].
Целью данного исследования явилось изучение влияния многократных антигенных стимуляций живыми вирусвакцинами на параметры генерации активных форм кислорода клетками цельной крови кур.
Материалы и методы исследования
Исследования проведены в сентябре 2009 года в секторе иммунологии Международного научного центра исследований экстремальных состояний организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН и на кафедре анатомии и гистологии животных Красноярского государственного аграрного университета. Объектом исследований были куры яичного кросса «Хайсекс уайт», полученные из ОАО «Птицефабрика Заря» Красноярского края. Всего исследовано 34 головы клинически здоровых птиц двух возрастных групп: суточные цыплята (10 голов) и молодняк кур 55-68-суточного возраста (24 головы) в наиболее напряженный период иммунизаций. Суточные цыплята привиты против болезни Марека (БМ), 53-суточная птица вакцинирована против инфекционного бронхита кур (ИБК), в возрасте 55 суток - против инфекционного ла-ринготрахеита (ИЛТ), на 64 сутки - ревакцинированы против ИБК, на 66 сутки - против ньюкаслской болезни (НБ). Определение параметров хемилюминесценции проведено через 5 ч (БМ) или 48 ч (ИБК, ИЛТ, НБ) после вакцинации. Материалом для исследований служила цельная гепаринизированная кровь, взятая из яремной вены у суточных цыплят или подкожной локтевой (крыловой) вены у птицы старшего возраста.
Функциональную активность клеток венозной нефракционированной крови кур оценивали по методу Tono-Okа в модификации В.М. Земскова с соавторами [4] и нашей модификации при антигенной стимуляции клеток in vitro (индуцированная) и без нее (спонтанная) по кинетике генерации АФК, регистрируемой микрометодом люминол- и люцигенинусиленной хемилюминесценции (ХЛ) с использованием аппаратурнопрограммного 36-канального комплекса «Хемилюминометр CL-3604» - ПЭВМ (СКТБ «Наука», Красноярск). Время записи хемилюминесцентной кривой составляло 90 мин при температуре в регистрационной камере +42оС, соответствующей температуре тела клинически здоровой птицы.
Состав реакционной смеси: 100 мкл гепаринизированной крови, разведенной в 2, 5 и 10 раз неокрашенным раствором Хенкса; 200 мкл раствора люминола ("Sigma", USA) в концентрации 2,2*10-4М или люци-генина ("Sigma-Aldrich", Switzerlend) 10-4 М на растворе Хенкса при рН=7,4; 50 мкл взвеси частиц латекса размером 2,3 мкм в концентрации 5*108 частиц/мл (ВНИИСК, СПб.), опсонизированных белками пуловой сыворотки крови взрослых кур.
О кинетике генерации АФК клетками цельной крови кур судили по амплитуде максимальной активности ХЛ-реакции (Imax, имп/с), времени достижения максимума ХЛ (Tmax, мин), суммарному объему АФК за период записи ХЛ (S, имп. за 90 мин), индексу активации ХЛ (ИА=Sакг./SсПoHT, усл. ед.), определяемому как соотношение между суммарными объемами индуцированной и спонтанной продукции свободных радикалов кислорода.
Общее содержание лейкоцитов крови, процент лейкоцитарных клеток с частицами латекса в цитоплазме (фагоцитарная активность) определяли в камере Горяева при окраске 0,25% раствором генцианвио-лета, приготовленного на 3% уксусной кислоте. Результаты статистически обрабатывались с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при Р<0,05.
Результаты исследований и их обсуждение
Через пять часов после внутримышечной иммунизации только вылупившихся цыплят живой вирус-вакциной против БМ достоверных изменений в продукции АФК клетками периферической крови не отмечалось. Однако имело место снижение показателей максимальной интенсивности продукции люцигенин- и лю-
минолзависимых АФК на 6 и 10%, а суммарных объемов генерации АФК - на 6 и 13% соответственно по сравнению с интактной птицей (рис. 1).
Уровень спонтанной продукции люминолзависимых АФК у привитых цыплят был на 37,5%, а интенсивность ХЛ-реакции - на 9,4% ниже по сравнению с непривитой птицей. В то же время под влиянием вакцинного вируса спонтанная продукция супероксиданиона, выявляемого с помощью люцигенинового ХЛ-зонда, увеличилась на 41,3% относительно уровня невакцинированной птицы.
У привитых цыплят увеличилось содержание лейкоцитов и доля активно фагоцитирующих клеток (с 52±5 до 66±3%), при этом снизилась удельная активность генерации АФК клеток в ответ на антигенную провокацию in vitro.
Сравнение хемилюминесцентной кинетики генерации АФК клетками крови привитой и интактной птицы показало отсутствие разницы по параметру времени достижения максимума индуцированной in vitro (28 мин) и спонтанной (44 мин) продукции люминолзависимых АФК. При применении люцигенина в качестве ХЛ-зонда время выхода на максимум индуцированной продукции АФК у вакцинированных цыплят сократилось на 8,3% (22 и 24 мин), а спонтанной продукции - в 2,14 раза (62 и 29 мин).
Рис. 1. Параметры хемилюминесцентной кинетики активированной in vitro и спонтанной генерации АФК клетками цельной крови интактных и привитых суточных цыплят через 5 ч после иммунизации против БМ
Индекс активации (ИА), отражающий потенциальные возможности клеток крови к генерации различных форм свободных радикалов кислорода в ответ на антигенную стимуляцию in vitro, сократился на 33,5% для люцигенинзависимых АФК и повысился на 52% для люминолзависимых АФК у привитой птицы по сравнению с интактными цыплятами. Данные факты свидетельствуют о снижении потенциальных возможностей клеток крови кур к генерации первичных радикалов кислорода, таких, как супероксиданион, и повышении объемов вторичных АФК под влиянием вакцинного вируса БМ.
Исследование кислородного метаболизма клеток крови молодняка кур в разгар реализации комплексной программы вакцинаций показало значительное изменение его параметров по сравнению с суточной привитой птицей. У цыплят 55-суточного возраста через 48 ч после очередной иммунизации против ИБК объем продукции люцигенинзависимых АФК сократился более чем в 3 раза (Р<0,01) и составил при индуцированной ХЛ 2,03±0,54х106 имп. за 90 мин, при спонтанной - 0,86±0,22*106 имп. за 90 мин. При этом максимальная интенсивность индуцированной люцигенинзависимой ХЛ-реакции снизилась в 3,2 раза (Р<0,05), а спонтанной - в 1,7 раза.
Объемы генерации люминолзависимых АФК у 55-суточных птиц сократились в 1,4-1,6 раза, содержание лейкоцитов в крови увеличилось в 1,89 раза, а количество фагоцитов снизилось в 2,4 раза относительно суточной птицы, что привело к сокращению удельной активности генерации АФК в ответ на антигенную стимуляцию in vitro частицами латекса.
У 58-суточной птицы через 48 ч после иммунизации против ИЛТ интегральная светосумма люцигенин-зависимых АФК индуцированной in vitro и спонтанной ХЛ снизилась на 30,5 и 11,6% соответственно по сравнению с показателями 55-суточной птицы (рис. 2). Индуцированная in vitro продукция люминолзависимых АФК сохранилась на уровне 55-суточной птицы, но почти в два раза сократилось время достижения максимума хемилюминесцентной кривой, с 23±5 до 12±1 мин (Р<0,05). Уровень лейкоцитов в крови увеличился до 22,8±2,01*109/л, фагоцитарная активность клеток составила 35,7±5,34%.
Очередная ревакцинация 64-суточных цыплят против ИБК стимулировала рост объемов продукции люминол- и люцигенинзависимых АФК активированными in vitro клетками через 48 ч после иммунизации на 22,2 и 61,7% соответственно по сравнению с предыдущим возрастным периодом. Показатели спонтанной продукции люминолзависимых АФК возвратились к показателям 55-суточной птицы, привитой против ИБК (рис. 2). У 66-суточного молодняка кур увеличилась максимальная интенсивность продукции индуцированных люцигенинзависимых АФК до 1180,7±330,4 имп/с, что в 1,5 раза превысило показатели кур 58-суточного возраста.
Вакцинация 66-суточной птицы против НБ сопровождалась истощением функциональной активности клеток крови в отношении антигениндуцированной in vitro продукции как люминол-, так и люцигенинзависимых АФК, а также спонтанной продукции супероксиданиона (рис. 2).
100
so
(J
в 60
Ё
И к 40
S
я
20
0
□ актив. ■ спонт.
I
І і і
'5 сут. 48 ч 38 сут. 48 ч 66 сут. 48 ч 68 сут. 48 ч посттеТТБК посттеТТ.ТТТ посттеТТБК поспеНБ
Рис. 2. Динамика показателей активированной in vitro и спонтанной продукции люцигенин- (А) и люминолзависимых АФК (Б) клетками крови молодняка кур через 48 ч после иммунизаций против ИЛТ, ИБК и НБ
Объем индуцированной и спонтанной продукции люцигенинзависимых АФК через 48 ч после вакцинации против НБ сократился почти в два раза относительно показателей предыдущего возрастного периода и составил 1,09±0,12х106 и 0,69±0,09*106 имп. за 90 мин соответственно, что, очевидно, обусловлено не только количеством антигенных стимуляций, которым подвергли молодняк кур, но и депрессивными свойствами самого вакцинного вируса НБ. Спонтанная продукция люминолзависимых АФК сохранилась на прежнем уровне, а индуцированная in vitro снизилась в 1,75 раза.
Исследования индекса активации ХЛ-реакции в период проведения интенсивных вакцинаций молодняка кур выявили его значительные колебания, обусловленные, на наш взгляд, биологическими особенностями вакцинных вирусов. Максимальный показатель индекса активации продукции люминолзависимых АФК составил 3,60 ед. и были зафиксирован у 68-суточной птицы через 48 ч после реиммунизации против ИБК; люцигенинзависимых - у 55-суточных цыплят спустя 48 ч после вакцинации против ИБК, он составил 2,36 ед. (рис. 3). Минимальные показатели индекса активации были зарегистрированы при генерации люци-
генин- и люминолзависимых АФК у 68-суточной птицы через 48 ч после вакцинации против НБ. Под влиянием вакцинного вируса НБ произошло резкое снижение индекса активации продукции люминолзависимых АФК с 3,60 до 1,60 ед., т.е. в 2,25 раза в течение 48 ч после прививки (Р<0,01), а индекс активации люциге-нинзависимых АФК упал до 1,58 ед. (рис. 3).
Рис. 3. Динамика индекса активации продукции люминол- и люцигенинзависимых АФК клетками цельной крови вакцинированных кур
Рис. 4. Фагоцитоз частиц латекса лейкоцитами крови при исследовании индуцированной ХЛ. Окраска 0,25% генцианвиолетом. Ув. 1000
Содержание лейкоцитов у 68-суточной птицы через 48 ч после вакцинации против НБ выросло почти на 9% по сравнению с предыдущим исследованием и составило в среднем 23,2*109/л, при этом фагоцитарная активность клеток резко сократилась и составила 23,9% (рис. 4).
Выводы
Иммунизации птицы живыми вирусвакцинами против болезни Марека, инфекционного бронхита кур, инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслской болезни вызывают изменение кислородного метаболизма клеток цельной крови кур, характеризующееся подавлением максимальной интенсивности и объемов индуцированной in vitro и спонтанной продукции люминол- и люцигенинзависимых АФК, что свидетельствует о снижении реактивности системы неспецифической резистентности организма и сокращении потенциальных возможностей клеток цельной крови кур к ответу на антигенную стимуляцию.
Литература
1. Практикум по иммунологии: учеб. пособие / И.А. Кондратьева, А.А. Ярилин, С.Г. Егорова [и др.]. - М.: Академия, 2004. - 272 с.
2. Faulker K., Fiodorovich I. Luminol and lucigenin as detectors for Ю2- // Free Radical Biol. Med. - 1993. -Vol. 15. - P. 447-451.
3. Макарская Г.В., Лопатин В.Н., Тарских С.В. Хемилюминесцентный анализ функциональной активности фагоцитирующих клеток крови рыб // Докл. АН. - 2003. - Т. 390. - № 3. - С. 420-422.
4. Земсков В.М., Барсуков А.А. Изучение функционального состояния фагоцитов человека (кислородный метаболизм и подвижность клеток): метод. рекомендации. - М.: Ин-т иммунологии МЗ СССР, 1988. - 20 с.
