CC BY
69
Краткое сообщение
Литература
1. Гайдышев И. Анализ и обработка данных: Специальный справочник.- СПб.: Питер.- 2001.
2. Лазерная допплеровская флоуметрия микроциркуляции крови: Рук-во для врачей.- М.: Медицина.- 2005.
3. Коркушко О.В., Лишневская В.Ю. // Успехи геронтологии.- 2002.- Вып. 9.- С. 262-268.
4. Тихонова И.В. и др. // Росс. физиол. Ж. им. И.М. Сеченова.- 2005.- Т.91, № 10.- С. 1132-1137.
5. Тихонова И.В. и др. // Росс. физиол. Ж. им. И.М. Сеченова.- 2005.- Т.91, № 11.- С. 1305-1311.
6. Тихонова И.В. и др.// Клин. физиол. кровообр.- 2005.-№ 4.- С. 53-58.
7. Acharya U.R. et al.// Comput. Methods Programs Biomed.-2005.- Vol. 80(1).- P. 37-45.
8. Bonner R., Nossal R. // Appl. Opt.- 1981.- Vol. 20.-P. 2097-2107.
9. Carolan-Rees G. et al. // Med. Eng Phys.- 2002.-Vol. 24(1).- P. 71-76.
10. Harris N.R., Rumbaut R.E. // Pathophysiology.- 2001.- Vol. 8(1).- P. 1-10.
11. Muck-Weymann M.E. et al. // Microvasc. Res.- 1996.-Vol. 52(1).- P. 69-78.
12. Sevcik С. // Complexity International.- 1998.- Vol. 5.
13. Stefanovska A. et al.// IEEE Trans. Biomed. Eng.- 1999.-Vol. 46(10).- P. 1230-1239.
14. Tu C. et al. // Technol. Health Care.- 2004.- Vol.12 (1).-P. 1-9.
15. Van den Brande P. et al. // Microvasc. Res.- 1997.-Vol. 53(2).- P. 156-162.
УДК 611.77:616-076
ВОЗМОЖНОСТИ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ В ИЗУЧЕНИИ КЛЕТОК КОЖИ ЧЕЛОВЕКА
Д.Я. АЛЕЙНИК*, Н.В. ВОСТОКОВ**, И.А. КЛЕМЕНОВА ***
Изучение особенностей клеток кожи позволяет охарактеризовать патогенетические механизмы многих дерматозов. Особый интерес в этом отношении представляют клетки эпидермиса (кератиноциты) и клетки дермы - фибробласты.
Актуально уточнение механизмов развития псориаза. Патогенез этого заболевания остается до конца невыясненным. Многие авторы относят псориаз к мультифакториальным заболеваниям с высокой ролью наследственных факторов [1, 2]. Важнейшие проявления заболевания манифестируют в эпидермисе, однако структуры дермы также претерпевают существенные изменения. Усиление пролиферации и нарушение процесса созревания кера-тиноцитов является ведущим звеном морфогенеза заболевания. Роль фибробластов в этом процессе не ясна, хотя выявлены их изменения при псориазе [3-5]. Помимо рутинных методов микроскопии, лежащих в основе всех исследовательских программ, для изучения ультраструктур клетки и клеточных мембран в настоящее время используются электронная микроскопия и сканирующая зондовая микроскопия. Метод электронной микроскопии известен давно, в то время как методы сканирующей микроскопии развиваются не более 2 десятилетий. Сканирующая туннельная микроскопия и атомно-силовая микроскопия (АСМ) являются наиболее перспективными представителями сканирующей зондовой микроскопии, причем АСМ не требует обязательной электрической проводимости исследуемых образцов, то есть образцы не нуждаются в предварительной обработке. АСМ известна с 1986 года и в применяется не только для исследования твердых объектов, но и для изучения биоструктур (вирусы, молекулы белков, клетки крови) [6-8]. Работ по изучению клеток кожи с помощью АСМ в литературе обнаружить не удалось.
Федеральное государственное учреждение Нижегородский научно-
исследовательский институт травматологии и ортопедии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию
***Институт физики микроструктур РАН, Нижний Новгород
Федеральное государственное учреждение Нижегородский научноисследовательский кожно-венерологический институт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию
Цель исследования - определение возможностей АСМ для изучения клеток кожи: фибробластов и кератиноцитов.
Материалы и методы исследования. В работе использован атомно-силовой микроскоп (Atomic Force Microscope — AFM) «Solver-P4» (NT-MDT, Зеленоград). В конструкцию AFM входят зонд, пьезоэлектрические двигатели для перемещения зонда, компьютер для управления процессом сканирования, получения и обработки изображений. Главной частью микроскопа является сенсор с высоким пространственным разрешением. Принцип действия атомно-силового сенсора основан на использовании сил атомных связей, действующих между атомами вещества. В AFM такими телами служат исследуемая поверхность и скользящее над нею остриё сенсора. Одной из сложностей при изучении биоструктур с помощью АСМ является равномерное размещение исследуемых биообъектов на поверхности. Моно-слойные культуры поверхностно-зависимых клеток кожи - дер-мальных фибробластов и кератиноцитов - являются адекватной моделью для исследования микрорельефа клеточных мембран.
Культуры клеток кожи получали в лаборатории клеточных культур Нижегородского НИИ травматологии и ортопедии. Источником клеточного материала были биоптаты кожи, полученные от здоровых добровольцев, и взятые из очагов поражения кожи больных псориазом. Клеточные культуры, полученные из псориатических очагов, использовались для изучения гиперпро-лиферативных процессов. Первичные культуры фибробластов получали из биоптатов кожи после трипсинизации и механической дезагрегации и в дальнейшем культивировали с использованием среды Игла (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Москва) с добавлением 2% глутамина, антибиотиков и 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Санкт-Петербург). Культивирование проводили в СО2-инкубаторе в атмосфере воздуха с 5% углекислого газа, при температуре 370С и абсолютной влажности. Для исследования использовали культуру фибробластов 4-5 пассажей, сформировавшую конфлюэнтный монослой, через 24 часа после пассажа. Плотность исходного посева составляла 20x104 /см2 пластиковой чашки («Costar»).
Культуры дермальных фибробластов, полученные из био-птатов кожи молодых здоровых доноров с использованием указанной технологии каритипированы в Медико-генетическом научном центре РАМН (Москва) и использовались в качестве стандартных штаммов. Всего исследовано 3 стандартных штамма и 5 штаммов дермальных псориатических фибробластов.
Культуры кератиноцитов получали по методу Reinwald, Green [9-10]. В качестве источника первичного материала использовали такие же биоптаты кожи размером 1см2 от здоровых добровольцев и псориатические. С помощью холодовой трипси-низации при 4°С эпидермис отделялся от дермы по линии базальной пластинки, затем кусочки эпидермиса дополнительно обрабатывались трипсином и пипетировались для дезагрегации эпидермоцитов. Полученная в результате дезагрегации суспензия кератиноцитов культивировалась с использованием среды DMEM: F12 («Sigma») 1: 1 с добавлением телячьей эмбриональной сыворотки, антибиотиков, 2% глутамина, фактора роста эпидермоцитов, гидрокортизона [9-10]. Условия культивирования соблюдались, как и при выращивании культур фибробластов. Исследовали культуры, сформировавшие конфлюэнтный монослой с исходной плотностью посева 40x104 /см2 пластиковой чашки («Costar»). В качестве стандартных штаммов кератиноци-тов использовали культуры клеток из биоптатов кожи молодых здоровых доноров. Проведено исследование 2 штаммов керати-ноцитов из псориатических очагов и двух стандартных штаммов. Рост культур ежедневно контролировали, используя инвертированный микроскоп («Lewa DMIL HC», Swizerland) с системой видеоконтроля и компьтерной программой «LEICA IM 1000».
Результаты. В поле зрения инвертированного микроскопа x40 наблюдали культуры фибробластов, формирующие конфлюэнтный монослой и образоющие типичный рисунок в виде завитков. Клетки в монослое x100, x250 были преимущественно веретеновидной, реже - звездчатой формы с выраженными отростками. Ядра клеток были плотными, четко очерченными с 1-2 мелкими ядрышками. Различий в рисунке монослоя и строении образующих его клеток в культурах фибробластов, полученных от здоровых лиц и от пораженных псориазом, при световой микроскопии выявить не удалось. Культуры кератиноцитов представляли собой монослой клеток неправильной полигональ-
Краткое сообщение
ной формы со светлыми ядрами. Для исследования кератиноци-тов использовали монослойные культыры без очагов стратификации. Различий в характере монослоя и клеточной структуры на этапе исследования при световой микроскопии не было. После контроля с помощью инвертированного микроскопа культуры без обработки передавались для атомно-силовой микроскопии.
Атомно-силовая микроскопия позволила получить трехмерное изображение цитоплазматической мембраны клеток. На поверхности мембраны контурировались глобулы и эллипсоиды, мембранные выросты. Изображение мембраны соответствовало гипотетическим представлениям. Для объективизации проводили матобработку результатов исследования поверхности мембран. Оценивали максимальные величины микровыростов (Rmax, nm), перепада высот (Rmean, nm). При статобработке выявлены достоверные различия между характеристиками клеток, полученных из псориатического очага и и стандартными культурами. Микровыросты цитоплазматической мембраны фибробластов были максимальными в клетках, полученных из псориатических очагов (402±82 нм) по сравнению со стандартными культурами фибробластов (139±43 нм), р<0,05. Перепад высот рельефа мембраны фибробластов из псориатических очагов был более выражен в клетках кожи больных псориазом по сравнению со стандартными штаммами (187±30 нм и 76±21 нм соответственно, р<0,05).
При исследовании кератиноцитов, полученных в культуре клеток, выявлены следующие особенности: микровыросты цитоплазматической мембраны были максимальными в клетках, полученных из псориатических очагов (в среднем 491 нм), в то время как в стандартных штаммах - 187 нм. С помощью АСМ удалось получить 3-мерное изображение цитоплазматической мембраны клеток кожи без их предварительной обработки реагентами. Выявлены достоверные отличия характеристик поверхности мембран фибробластов, полученных из псориатического очага по сравнению с таковыми для мембран фибробластов здоровых штаммов. Обнаружены достоверные отличия структуры поверхности мембраны кератиноцитов из очага поражения кожи больных псориазом по сравнению со стандартными культурами. Выявленные особенности характеристик рельефа цитоплазматической мембраны культивированных клеток кожи из псориатических очагов были однотипны для культуральных штаммов, полученных от больных, что может говорить о связи этих изменений с повреждением генома клеток при псориазе.
Результаты демонстрируют возможность использования АСМ для изучения нативных клеточных культур, в т.ч. культур клеток кожи - кератиноцитов и фибробластов. Достоинством этого метода является возможность изучения микрорельефа поверхности биомембран без предварительной обработки, деформирующей клеточные структуры. Выявлены отличия микрорельефа биомебран клеток при псориазе по сравнению с биомембранами клеток здоровой кожи. Вопрос об использовании АСМ для исследования особенностей рельефа биомембран клеток при патологии кожи (рубцы, дистрофические поражения кожи и т.д.) заслуживает дальнейшего изучения.
Литература
1. Бакстон П. Дерматология /Пер. с англ.- М.: БИНОМ, 2005.- 176 с.
2. Павлова О.В. // Вест. дерматол. и венерол.- 2005.- №6.-С.36-39.
3. Miura H. et al. // Arch Dermatol Res.- 2000.- Vol. 292, №12.- Р. 590-597.
4. Dimon-Gadal S. et al.i i J. Invest Dermatol.- 2000.- Vol 114, №5.- Р.984-989.
5. Fransson J. et al. // Arch Dermatol Res.-1999.- Vol 291, №10.- Р.538-541.
6. TakeuchiM. et al. // Biophys J.- 1998.- №5.- Р.2171-2183.
7. Almqvist N. et al. // Micron.- 1994.- №3.- Р.227-232.
8. Ushiki T. et al. // Arch Histol Cytol.- 1996.- №5.- Р.421.
9. Rheinwald J.G, Green H.H Cell. 1975.- №5.- Р.331-344
10. Rheinwald J.G., Green H. // Nature.- 1977.- №5.- Р.42.
УДК 547.995.15
ЛАЗЕРОФОРЕЗ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ В ПРОФИЛАКТИКЕ И ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ НАРУШЕНИЙ ФУНКЦИЙ КОЖИ
Е.А.РЯЗАНОВА, А.А.ХАДАРЦЕВ*
Введение. Способ лазерофореза основан на способности лазерного излучения возбуждать клеточные мембраны, увеличивая их проницаемость и активируя продвижение биоактивных веществ, используемых для профилактики, во внутренние среды организма. Одним из таких веществ, широко используемых в дерматологической практике, является гиалуроновая кислота.
Объект и методы исследования. У 57 женщин в возрасте 32-35 лет с жалобами на сухость кожи и появление морщин проведено термовизионное исследование кожи на матричном тепловизоре до и после 15-дневного курса фитолазерофореза с 1,5% гелем гиалуроновой кислоты. Оценивалось состояние кожных пор. Для изучения микроциркуляции кожи использовался метод лазерной допплеровской флоуметрии.
Полученные результаты. При лазерной допплеровской флоуметрии до лечения выявлено изменение показателей, свидетельствующее о нарушении микроциркуляции кожи. Анализ тепловизионной картины состояния кожных пор также свидетельствовал об ухудшении ик функционирования. После проведенной терапии (лазерофорез с 1,5% гелем гиалуроновой кислоты в течение 10 минут ежедневно, на курс 15 процедур) установлено достоверное улучшение показателей микроциркуляции кожи, функционирования кожных пор. Известно синтоксическое действие гиалуроновой кислоты, состоящее в активации синтоксиче-ских программ адаптации (преобладания антисвертывающей, парасимпатической, антиоксидантной систем). Положительный эффект лазерофореза сопряжен с активирующим действием лазерного излучения и улучшением пластического обеспечения интерцеллюлярного ретикулума гиалуроновой кислотой.
Заключение. Способ лазерофореза гиалуроновой кислоты может использоваться в восстановительной терапии при патологии кожи, а также для профилактики. Существенно использование лазерной допплеровской флоуметрии и тепловизионного исследования для ранней диагностики и контроля терапии.
УДК 618.14
ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОВОСПАЛИ-ТЕЛЬНЫХ И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ В ЛОХИЯХ ДЛЯ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ЭНДОМЕТРИТА ПОСЛЕ КЕСАРЕВА СЕЧЕНИЯ
Л.Д. БЕЛОЦЕРКОВЦЕВА, В.В. ДАНИЛОГОРСКАЯ, С.Е. ИВАННИКОВ, Л.В. КОВАЛЕНКО*
Введение. Ныне эндометрит после кесарева сечения (КС) является наиболее частым гнойно-воспалительным осложнением послеродового периода. В структуре послеродовых инфекций удельная частота эндометрита варьируется в пределах 6,6-45% [3]. Цитокины - важнейшие факторы иммунопатогенеза воспалительных заболеваний. Поэтому исследователи используют определение концентраций цитокинов для диагностики воспалительных послеродовых осложнений [1, 5]. В зависимости от влияния на воспалительный процесс различают два вида цитокинов: провоспалительные (IL-1, IL-6, IL-8, TNF-a) и противовоспалительные (IL-4, IL-10). Инициация воспалительного ответа контролируются провоспалительными цитокинами, продуцирующимися макрофагами, нейтрофилами и Т-клетками в ответ на стимуляцию бактериальными антигенами. Провоспалительные цитокины играют защитную роль, обеспечивая рекрутирование в очаг инфекции эффекторных клеток (нейтрофилов, макрофагов), стимулируя их фагоцитарную, бактерицидную активность и индуцируя запуск антигенспецифического иммунного ответа [4].
Защитная роль провоспалительных цитокинов проявляется тогда, когда эти медиаторы работают локально, в очаге воспа-
* ГУП НИИ новых медицинских технологий, г. Тула Сургутский государственный университет, кафедра акушерства и гинекологии, лаборатория клинической и экспериментальной перинатологии
