CC BY
90
ЕЮ
УДК 612.086:616.5-076
возможности атомно-силовой микроскопии в исследовании клеток кожи
И.А. Клеменова1, Н.К. Никулин1, Н.В. Востоков2, Д.Я. Алейник3,
'ФГУ «Нижегородский научно-исследовательский кожно-венерологический институт Росздрава», 2Институт физики микроструктур РАН, 3ФГУ «Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Росмедтехнологий»
Клеменова Ирина Александровна - e-mail: nnikvi_2@mail.ru
Исследованы ультраструїктурньїе особенности цитоплазматической мембраны фибробластов и кератиноцитов больных псориазом в сравнении с показателями здоровых лиц. Впервые для изучения строения мембраны клеток кожи авторами использована атомно-силовая микроскопия. Показаны достоверные различия ряда характеристик мембран клеток кожи у больных псориазом в сравнении с контролем.
Ключевые слова: псориаз, фибробласты, кератиноциты, атомно-силовая микроскопия.
Ultrastructural peculiarities of cell membrane of fibroblasts and keratinocytes of patients with psoriasis in comparison with the indicators of healthy people were studied. For the first time atomic force microscopy was used by the authors to study the structure of skin cell membranes. The differencies between skin cell membranes of patients with psoriasis and skin cell membranes of healthy people are shown.
Key words: psoriasis, fibroblasts, keratinocytes, atomic force microscopy.
Введение
По данным крупномасштабных исследований псориаз является наиболее распространенным хроническим дерматозом. Этиология псориаза остается неизвестной, многие авторы относят его к мультифакториальным заболеваниям с реализацией генетической программы под воздействием многочисленных экзо- и эндогенных причин. В результате нарушается процесс дифференцировки клеток эпидермиса - кератиноцитов при наличии патологических процессов в дерме [1, 2]. Именно поэтому исследование ультраструктур-ных и функциональных особенностей мембран кератиноцитов и фибробластов кожи у больных псориазом представляется весьма актуальным. В последнее время одним из наиболее перспективных направлений развития науки является область нанотехнологий. Уникальную возможность изучения биологических объектов предоставляет метод исследования, относящийся к нанотехнологиям - атомно-силовая микроскопия [3, 4, 5, 6].
Материал и методы. Для изучения фибробластов и кератиноцитов кожи использован атомно-силовой микро-
скоп «Бо^ег-Р4» (NT-MDT) - исследование клеток кожи проводили в Институте физики микроструктур РАН (г. Нижний Новгород). Атомно-силовой датчик представляет собой зонд с высокой чувствительностью, позволяющей регистрировать силы взаимодействия между отдельным атомами. Сканированные изображения получаются как в виде двумерных (2Э), так и трехмерных (3Э). При 2Э визуализации каждой точке поверхности придается определенный цветовой тон в соответствии с высотой точки поверхности. При 3й визуализации изображение поверхности строится в аксонометрической перспективе с помощью определенным образом рассчитанных линий рельефа.
Для АСМ исследования на воздухе требуется прочно зафиксировать исследуемый объект на поверхности подложки. При изучении объектов с помощью АСМ возникает необходимость равномерного размещения исследуемых биологических объектов на поверхности. Для этого были выбраны монослойные культуры клеток кожи - дермальных фибробластов и кератиноцитов, представляющие идеальную модель для исследования микрорельефа клеточных
мембран. При этом исследуемые клетки находятся в нативном состоянии и довольно прочно фиксированы к поверхности пластиковой чашки. Кроме того, чтобы исключить контаминацию культур клеток микроорганизмами, культивирование производили в условиях специального стерильного бокса лаборатории культивирования клеток, а в последующем проводили исследование культур на наличие микроорганизмов.
Источником клеточного материала служили биоптаты кожи, полученные от здоровых добровольцев и взятые из очагов поражения кожи больных псориазом. Культуры фибробластов получали из биоптатов кожи после трипсини-зации и механической дезагрегации и в дальнейшем культивировали с использованием среды «Игла». Культуры кератиноцитов получали по методу Reinwald, Green. Для исследования использовали культуры, сформировавшие конфлюэнтный монослой с исходной плотностью посева 40х104 /см2 пластиковой чашки. Являясь существенно менее трудоемким по сравнению с жидкостным, воздушный режим исследования клеток позволяет обеспечить высокое разрешение, а также возможность наблюдать целостность и характер повреждений плазматической мембраны. Поэтому для исследования клеток кожи был выбран воздушный режим. Исследования на воздухе проводилось в полукон-тактном режиме. С целью объективизации проводили математическую обработку результатов исследования поверхности мембран. С помощью компьютера, входящего в AFM, и специальной программы статистической обработки изображений оценивали максимальные величины микровыростов (Rmax, nm), перепада высот (Rmean, nm), а также шероховатость поверхностей (сумма модулей разностей между Rmax и Rmean, приходящаяся на количество точек измерения - Ra).
Результаты и их обсуждение
В поле зрения инвертированного микроскопа фибробла-сты в виде монослоя были преимущественно веретеновидной, реже - звездчатой формы с выраженными отростками. Отчетливых различий в рисунке монослоя и строении обра-зущих его клеток в культурах фибробластов, полученных от здоровых лиц, и от больных псориазом при световой микроскопии выявить не удалось. Культуры кератиноцитов представляли собой монослой клеток неправильной полигональной формы со светлыми ядрами. Существенных различий в характере монослоя и клеточной структуры на этапе исследования при световой микроскопии не было выявлено.
Атомно-силовая микроскопия фибробластов позволила получить трехмерное изображение плазматической мембраны клеток. На поверхности плазматической мембраны четко выявлялись глобулы, предположительно, являющиеся частью мембранных интергральных и полуинтегральных белков, а также фрагментов гликокаликса. Также отчетливо контурировались мембранные выросты.
Поверхность плазматической мембраны фибробластов, полученных из биоптатов кожи больных псориазом, имела существенные различия с поверхностью плазматической мембраны фибробластов здоровых доноров. В первом случае микровыросты мембраны были более выражены. Плазматическая мембрана контрольных штаммов фибробластов отличалась более ровным, упорядоченным рельефом.
При изучении двухмерного изображения плазматической мембраны клеток кожи обращали внимание на неровности рельефа, которые в данном случае были представлены более светлыми участками (выросты мембраны и белковые глобулы), а также темными участками (области западения рельефа мембраны). С помощью компьютерной программы атомно-силового микроскопа проведены измерения параметров таких участков. Так, максимальный диаметр микровыростов на мембране был характерен для фибробластов, выделенных у больных псориазом. Поверхность плазматической мембраны фибробластов от здоровых доноров имела менее выраженные микровыросты. При статистической обработке выявлены достоверные различия характеристик поверхности клеток, полученных из псориатического очага и биоптатов нормальной кожи. Так, микровыросты цитоплазматической мембраны фибробластов были максимальными в клетках, полученных из псориатических очагов (405,2±65,2 нм) по сравнению со стандартными культурами фибробластов (137,2±35,6 нм), р<0,05. Перепад высот рельефа мембраны фибробластов из псориатических очагов был более выражен в клетках кожи больных псориазом по сравнению со стандартными штаммами (186,6±32,8 нм и 69,3±18,2 нм соответственно, р<0,05). Также достоверно отличался показатель шероховатости поверхности. Шероховатость поверхности плазматической мембраны фибробластов, полученных из псориатических очагов, составила 47,1±11,3 нм. Тот же показатель, характеризующий поверхность фибробластов здоровых доноров, был в среднем 11,3±2,7 нм, р<0,05.
С помощью атомно-силовой микроскопии были получены двухмерные и трехмерные изображения плазматической мембраны кератиноцитов. Поверхность плазматической мембраны кератиноцитов, полученных из биоптатов кожи больных псориазом, имела существенные различия с поверхностью плазматической мембраны кератиноцитов здоровых доноров псориазом. При статистической обработке выявлены достоверные различия характеристик поверхности плазматической мембраны кератиноцитов, полученных из псориатического очага и из биоптатов кожи здоровых доноров. Так, микровыросты цитоплазматической мембраны кератиноцитов были максимальными в клетках, полученных из псориатических очагов (342,5±4,5 нм) в сравнении с контролем (63,1±7,5 нм; р<0,05). Также различались параметры перепада высот - соответственно 127,5±57,5 нм и 15,6±1,8 нм, р>0,05; а также шероховатость поверхностей -соответственно 20,5±5,5 нм и 5,0±0,1 нм; р<0,05).
ЕЮ
Заключение
Таким образом, АСМ позволяет получить двухмерное и трехмерное изображение плазматической мембраны клеток кожи. Выявлены достоверные отличия характеристик поверхности мембран фибробластов и кератиноцитов, полученных из псориатического очага, по сравнению с таковыми для мембран клеток здоровых штаммов. Выявленные особенности рельефа цитоплазматической мембраны клеток кожи из псориатических очагов были однотипными для культуральных штаммов, полученных от разных больных, что свидетельствует о закономерности выявленных особенностей. Ш
литература
1. Miura H., Sano S., Higashiyama M., Yoshikawa K., Itami S. Involvement of insulin-like growth factor-I in psoriasis as a paracrine growth factor: dermal fibroblasts play a regulatory role in developing psoriatic lesions. Arch Dermatol Res 2000. № 12. Р. 590-597.
2. Dimon-Gadal S., Gerbaud P., Therond P. et al. Increased oxidative damage to fibroblasts in skin with and without lesions in psoriasis. J Invest Dermatol. 2000. № 5. Р. 984-989.
3. Ushiki T., Hitomi J., Ogura S. et al. Atomic force microscopy in histology and cytology. Arch Histol Cytol. 1996. № 5. Р. 421-431.
4. Матюхина Т.Г. Исследование эритроцитов методом атомно-силовой микроскопии. Клин лаб диагностика 1999. № 6. Р. 13-16.
5. Almqvist N., Backman L., Fredriksson S. Imaging human erythrocyte spectrin with atomic force microscopy. Micron 1994. № 3. Р. 227-232.
6. Takeuchi M., Miyamoto H., Sako Y. et al. Structure of the erythrocyte membrane skeleton as observed by atomic force microscopy. Biophys J. 1998. № 5. Р. 2171-2183.
