CC BY
100
УДК 599.735.53 О.Ф. Чернова, С.Б. Розенфельд
ВОЗМОЖНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА КУТИКУЛЯРНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РАСТЕНИЙ
ПО ИХ ФРАГМЕНТАМ
В статье рассматривается использование метода кутикулярного анализа для решения задач биологической экспертизы. Метод основан на изучении отпечатков скульптуры (орнамента) эпидермиса на внутренней поверхности кутикулы растений и их сравнении с эталонами базы данных.
Ключевые слова: диагностика растений, кутикулярный анализ, биологическая экспертиза, питание фитофагов.
O.F. Chernova, S.B. Rozenfeld
POSSIBILITY OF CUTICULAR ANALYSIS TECHNIQUE APPLICATION FOR PLANTS DIAGNOSTICS REGARDING THEIR FRAGMENTS
Cuticular analysis technique application in order to solve the problems of biological examination is considered in the article. The technique is based on studying the prints of a primary cuticle sculpture (ornament) on an internal plants cuticle surface and their comparison with database standards.
Key words: plants diagnostics, cuticular analysis, biological examination, phytophages food.
Наружные покровы растений представлены эпидермисом и покрывающей его кутикулой, а иногда и восковидным налетом. Эпидермис - это клеточная структура. Клетки эпидермиса обычно бесцветные, располагаются в один ряд, тесно примыкают друг к другу: они «живые» - метаболически активные и, за исключением расположенных в эпидермисе клеток устьиц (пор), лишены хлорофилла. В состав ткани эпидермиса входят следующие типы клеток: эпидермальные (или двигательные), защитные, вспомогательные и трихомы (волосовидные эпидермальные выросты). Эпидермальные клетки самые многочисленные, крупные и наименее специализированные. У однодольных растений они более вытянуты, чем у двудольных. Орнамент отпечатка скульптуры эпидермальных клеток специфичен для таксонов разного ранга.
Кутикула - это прозрачный слой бесструктурного вещества - кутина, лежащий поверх эпидермиса в виде тонкой пленки. Кутин продуцируется эпидермисом, представляет собой воскоподобное вещество, смесь высших жирных кислот и их эфиров. Эта пленка местами прерывается вкраплениями пектиноподобных веществ. Через такие участки лист может поглощать из попадающих на его поверхность растворов вещества, содержащие азот, фосфор, калий и другие элементы, необходимые для питания и нормальной жизнедеятельности растения.
Кутикула выполняет защитную функцию, обладает гидрофобными свойствами, служит для защиты от испарения и ожогов солнечными лучами - листья растений способны отражать до 40% солнечной радиации. Кутикула и эпидермис защищают внутренние клетки от быстрого высыхания; толщина этих наружных слоев часто говорит об адаптации вида к среде обитания. Так, у сосен и других узколистных вечнозеленых растений мощная кутикула весьма эффективно замедляет испарение, особенно зимой, когда в промерзшей почве содержится мало доступной для корней воды.
Верхняя и нижняя поверхности листа имеют различную структуру и выполняют разные функции. Кутикула нижней части листа, как правило, тоньше, чем на верхней, и толще у обитателей биотопов с аридным климатом (в Арктике растения также испытывают недостаток воды и обладают толстой кутикулой, хотя климат засушливым назвать нельзя), чем у растений, живущих там, где недостаток влаги не ощущается.
Особенностью внутренней поверхности кутикулы является то, что на ней, как на восковой пленке, отпечатывается орнамент поверхности эпидермиса, образованный эпидермальными клетками. Эта характерная черта кутикулы взята на вооружение в зоологии и палеоботанике. В зоологии для исследований пищевой энергетики животных (определения качественного и количественного состава кормов с помощью анализа проб экскрементов) используется метод кутикулярного анализа растений [6]. Этот метод микроскопического анализа основан на диагностике фрагментов растений при помощи идентификации отпечатка на кутикуле видоспецифичного орнамента, образованного эпидермальными клетками. Он снимает много ограничений на размер идентифицируемых частиц и делает микроскопический анализ образцов быстрым и относительно простым.
Метод, предложенный Оуэном, состоит в следующем. Участки эпидермиса растений, произрастающих в местах обитания изучаемых видов, выдерживают в глицерине и фотографируют, собирая базу данных, которые потом и сравнивают с фрагментами растительного материала из экскрементов птиц и млекопитающих для диагностики пищевых объектов. Для микроскопического анализа берут образцы экскрементов, которые сохраняют в 5% растворе глицерина и предварительно тщательно перемешивают. Из такой пробы получают пять препаратов на предметных стеклах 22х50 мм. На каждом стекле выделяют квадрат, а в каждом квадрате определяют и записывают фрагменты растений. Через каждые 5 мм квадрат делят 4-мя трансек-тами, что дает 200 рассматриваемых точек. Из них около 100 попадают на фрагмент растения, т.е. получается 100 записей. Если 100 фрагментов не набирается, то готовят следующий препарат [1-2].
Используя эту методику, успешно исследовали пищевую экологию черной казарки номинативного подвида на Западном Таймыре [7]. Тем не менее, хотя результаты кутикулярного анализа пищевых растений широко обсуждаются в литературе [4-5], детальное описание алгоритма исследования, как правило, в статьях опускается.
Мы модифицировали этот метод [3] и с успехом применили его для диагностики растений из экскрементов гусей и казарок, обитающих в Арктике, а также из экскрементов копытных из Монголии и Калмыкии (сайгака, дзерена, домашнего скота), овцебыка и северного оленя с о. Врангеля. Исследования проводили путем сопоставления результатов кутикулярного анализа экскрементов, визуальных наблюдений и геобота-нических описаний мест кормежек. Пробы помёта высушивали до воздушно-сухого состояния, а затем обрабатывали по описанной ниже методике.
Традиционный анализ пищи фитофагов состоит из следующих этапов: 1) пробу замачивают в воде; 2) изготавливают временные микропрепараты, погруженные в воду или глицерол; 3) полученные препараты изучают под бинокуляром или микроскопом в зависимости от целей исследования.
Диагностика растений облегчается сравнением кутикулярного отпечатка орнамента поверхности эпидермиса проглоченных животным растений с рисунками или фотографиями эталонных образцов эпидермиса из базы данных (рис. 1-2).
Рис. 1. Отпечаток орнамента эпидермиса на внутренней поверхности кутикулы у разных видов растений: А - Festuca baffinensis; Б - Potentilla myshkinii; В - Arnica ilyinii; Г - Calamagrostis purpurescens
Однако орнамент эпидермиса может варьировать в разных частях растения. С помощью обычного анализа идентифицируют пищевые виды растений в образцах по особенностям слоистых структур эпидермиса.
Рис. 2. Отпечаток орнамента эпидермиса на внутренней поверхности кутикулы полыни арктической Artemisia arctica (А) и парии голостебельной Parrya nudicaulis (Б):
A - Artemisia arctica; B - Parrya nudicaulis
Эталонные образцы эпидермального орнамента делают из свежесобранных пищевых растений. Препараты погружают в глицерол для просветления. Они очень недолговечны, не выдерживают длительного хранения и перевозки, кроме того, клетки эпидермиса могут деформироваться. Неопытный оператор не в состоянии отделить эпидермис на маленьких и узколистых растениях. Кроме того, полиморфизм орнамента и формы эпидермальных клеток значительно затрудняет диагностику. Собранные образцы замачивают в воде, затем погружают в глицерол, что приводит к разбуханию паренхимальных и мезофильных клеток в частично переваренном животным материале: клетки растения находятся на разных стадиях переваривания, что препятствует точной фокусировке микроскопа и приводит к диагностическим ошибкам.
Метод кутикулярного анализа основан на нескольких положениях:
1. Многим видам растений (вечнозеленых, листопадных психрофитов (растений, произрастающих на влажных и холодных почвах), обитателей хорошо дренированных песчаных почв) свойственен утолщенный кутикулярный слой, который хорошо защищает листья.
2. Отпечаток орнамента эпидермиса растений на внутренней стороне кутикулы видоспецифичен и устойчив (например, не изменяется даже под воздействием пищеварительных энзимов в желудочно-кишечном тракте животных).
3. С биохимической точки зрения кутикула представляет собой аналог воска и в нормальных условиях она устойчива к окислению сильными неорганическими кислотами, но гидролизуется щелочами.
Метод кутикулярного анализа состоит из пяти этапов: 1) составление гербария пищевых растений; 2) изготовление эталонных образцов эпидермиса; 3) составление базы данных в виде атласа рисунков или фотографий внутренней поверхности кутикулярного слоя и орнамента эпидермальных клеток на основе эта-
лонных образцов; 4) предварительная обработка пищевых остатков для микроскопического анализа; 5) микроскопические исследования подготовленного материала.
Для составления гербария необходимо правильно этикетировать каждый образец. Растения собирают целиком, даже если для эталонного образца необходим только небольшой кусочек листа, стебля или цветка.
Для приготовления эталонных образцов эпидермис и кутикулу отслаивают от мезофилла (мягких внутренних тканей) путем мацерации по обычной методике ботанической микротехники [1]. Мацерация разрушает межклеточный матрикс, и эпидермис распадается на отдельные клетки. Ее проводят с помощью концентрированной азотной кислоты в фарфоровом тигле при нагревании под вытяжкой следующим образом: 5-10 мм фрагментов разных органов растений помещают в тигль и осторожно нагревают на спиртовке в 3-4-х каплях концентрированной азотной кислоты; работают на асбестовой подставке, чтобы избежать перегрева и нежелательных реакций. Обычно используют реакцию между азотной кислотой (Н1\Юз) и поташом (К2СО3). Однако в нашем случае эта реакция неприменима, поскольку здесь необходима возможность останавливать процесс в любой момент. Ткани нагревают в течение 2-3 мин до тех пор, пока их цвет не поменяется с зеленого на оранжевый. Остатки переносят (обязательно под вытяжкой!) на маленькую чашку Петри, содержащую воду. Фрагменты эпидермиса, всплывшие на поверхность, помещают на предметное стекло и изучают под бинокулярной лупой. Неповрежденные фрагменты для эталонов отбирают препаровальной иглой и переносят на предметное стекло в каплю глицерола. Материал оставляют в глицероле на время от 30 мин до 3 ч.
Дальнейшие действия зависят от цели исследований. Недолговечные препараты могут быть получены просто путем накрывания капли глицерола покровным стеклом. Они не выдерживает длительного хранения и не могут быть использованы как эталонные, поскольку многие детали не различимы. Постоянные же препараты получают путем погружения выбранных частей эпидермиса в глицерол-желатин. Эта стандартная процедура описана в учебниках по ботанической микротехнике и не требует специальных реагентов и оборудования. Приготовленные образцы «запечатывают» путем лакирования краев покровного стекла для предотвращения высыхания. Такие препараты собирают в эталонный банк. Они должны быть зарисованы или сфотографированы на микроскопе с увеличением в 8-10-16-20-40 раз. Необходимо указать масштаб изображения. Каждый препарат снабжают этикеткой, на которой указан вид и орган растения, а также дата изготовления препарата и фамилия препаратора.
Например: _____________________________________________________
Oxytrop^s sordida ^Ш.) Регв.
Остролодочник грязноватый (синецветковая форма)
Цветок Эпидермис Масштаб: ув. Х...
22.10.2000 Иванов И.И.
Приготовление материала для анализа проводят следующим образом. Высушенный до воздушносухого состояния материал перемалывают для получения частиц одинакового размера. Далее его очищают вымыванием на стекло или в чашку Петри, где тяжелые частицы оседают на дно, а эпидермис остается на поверхности. Очищенный материал помещают в каплю глицерола или воды на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом.
Необходимо учитывать критерий репрезентативности образцов. Под термином «образец» или «проба» понимается число образцов вещества, собранных в данное время в данном месте. Число разных видов растений в образцах считают адекватно представленным, если новые виды не идентифицируют в последующих порциях. В каждом образце (капля под покровным стеклом) исследуют минимум 100 фрагментов растений. В каждом поле зрения все фрагменты растений считают и определяют. Наблюдения прекращают только после того, как в последующем перестают встречаться новые виды. Анализ продолжают до тех пор, пока кривая, показывающая кумулятивное число диагностированных видов, не выйдет на плато (рис. 3).
Число видов растений в пробе
Число полей зрения микроскопа
Рис. 3. Иллюстрация метода насыщения пробы. Выход числа видов на плато (для двух проб)
Предложенный метод кутикулярного анализа в нашей модификации может быть использован для диагностики растений по фрагментам в целях биологической экспертизы при условии создания соответствующей базы данных.
Литература
1. Наумов Н.А., Козлов В.Е. Основы ботанической микротехники. - М.: Сов. наука, 1954. - 312 с.
2. Прозина М.Н. Ботаническая микротехника. - М.: Высш. шк., 1960. - 206 с.
3. Розенфельд С.Б. Методика копрологического анализа на примере изучения состава кормов гусей в
тундрах Таймыра II Бюл. рабочей группы по гусям и лебедям Восточной Европы и Северной Азии (казарка). - М., 1997. - № 3. - С. 38-52.
4. Розенфельд С.Б., Кожевникова А.Д. Методика копрологического анализа на примере изучения соста-
ва кормов гусей в тундрах Таймыра II Abstr. Willem Barents mem. Arctic conserv. Symp. - M., 199B.
5. Harwood J. Summer feeding ecology of Lesser Snow Geese II J. Wildl. Manag. - 1977. - Vol. 41. - № 1. -P. 4B-55.
6. Ogilvie M.A. Wild geese. Benkhamsted, UK: T. & A.D. - Poyser, 197B.
7. Owen M. An assessment of fecal analyses technique in waterfowl feeding studies II J. Wildl. Manag. - 1975.
- Vol. 39. - № 2. - Р. 271-279.
B. Spilling E., Bergmann H.-H., Stock M. Progress report. Diet of Dark-bellied Brent Geese (Branta b. bernicla)
in the Piassina Delta, Taimyr, Siberia II IWRB. Goose Research Group Bull. - 1994. - № 5. - P.1B-25.
