CC BY
10
ОБЗОРЫ
УДК 613.26/.29-07 : 543.541
ВОЗМОЖНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ
А. А. Фомин
Кафедра гигиены Алтайского медицинского института, Барнаул
Метод хроматографии, разработанный в начале этого века русским ученым М. А. Цветом, получил широкое распространение во всех областях науки и техники. Преимущество этого метода состоит в том, что для анализа нужно немного исследуемого вещества и реактивов; рабочего времени также требуется мало, хотя хроматография не уступает по точности другим аналитическим способам.
В чем сущность хроматографии на бумаге? В распределении смеси веществ при продвижении растворителя по хроматографической бумаге. В зависимости от адсорбционных свойств исследуемого компонента смеси и растворимости его в используемом растворителе он (компонент) будет продвигаться на определенное расстояние от точки нанесения (линии старта). По степени удаления от линии старта и по специфическим реакциям непосредственно на бумаге можно определить состав компонентов в исследуемой смеси.
Широкое применение нашла хроматография на бумаге и в области изучения пищевых продуктов. Пищевые продукты содержат большое количество разнообразных химических веществ, которые могут оказывать влияние на питательные свойства, полноценность, безвредность и органолептические свойства пищевого продукта. Изучение всех компонентов этого продукта было бы весьма затруднено без применения хроматографии. Она позволяет разделять смеси на компоненты, выделять отдельные составные части в чистом виде, изучать воздействие различных факторов как на продукт в целом, так и на его отдельные составные части. Методом хроматографии на бумаге можно определить аминокислотный состав пищевого продукта, дать характеристику ему по содержанию высших жирных кислот, углеводов, витаминов и некоторых минеральных веществ.
Наибольшее распространение получил метод хроматографии при определении состава аминокислот в белках. Вначале из пищевого продукта выделяется белок. Н. Н. Крылова и Ю. Н. Лясковская выделяют белки из мяса осаждением 20% трихлоруксусной кислотой с последующим отмыванием осадка 5% трихлоруксусной кислотой. Липиды экстрагируются спиртом и эфиром. А. И. Таранова и соавторы использовали другой метод: сначала продукт обезжиривают спиртом, затем кипятят в дистиллированной воде, белки осаждают уксусной кислотой и центрифугируют. Выделенные белки подвергают гидролизу 20% соляной кислотой при 110° в течение 15—16 часов. Гидролизат упаривают под вакуумом. Сухой остаток, состоящий из аминокислот, растворяют в 10% изопропиловом спирте и используют для хроматографии.
Эффективное разделение аминокислот происходит при многократном пропускании различных систем растворителей. Чаще всего используется система н-бутиловый спирт — уксусная кислота — вода в различных соотношениях (С. И. Янков; Read). Т. С. Пасхина рекомендует пропускать растворитель (н-бутанол — уксусная кислота — вода в соотношении 4:1:5) через хроматограмму один раз, а затем дважды пропускать систему из тех же компонентов, но в соотношении 40:15:5. Block применяет растворитель из фенола, насыщенного водой.
Для проявления аминокислот используют любые реактивы, реагирующие на (присутствие кислот, например бромтимоловый синий и бромкрезоловый зеленый (Р. Блок и др.). Лучшие результаты .получают при употреблении специфического реактива на аминокислоты — нингидрина с последующей обработкой хроматограммы раствором сернокислой меди (Т. С. Пасхина).
Для изучения соотношения жирных кислот в пищевом продукте вначале выделяют жир. Ю. Н. Лясковская и В. И. Пиульская дают такую схему извлечения жира: измельчение, взвешивание, экстракция органическим растворителем, фильтробание, отгонка растворителя, подсушка, взвешивание. Экстракцию лучше всего производить в аппарате Сокслета, отгонку растворителя — на водяной бане под током углекислого газа или азота.
Выделенный жир может быть гидролизован по общепринятой методике. Hadorn и Biefer рекомендуют проводить гидролиз нагреванием на водяной бане с обратным холодильником (10 г жира, 3 г едкого кали и 30 мл спирта). В делительной воронке серным эфиром экстрагируют неомыляемые вещества и воздействием 25% серной кислоты высвобождают жирные кислоты. Эфир удаляют, а смесь жирных кислот используют для хроматографии.
Разделение жирных кислот производят на предварительно обработанной бумаге. Для создания стационарной фазы бумагу пропитывают какими-либо гидрофобными веществами, например углеводородами, вазелиновым или парафиновым маслом (Е. К. Алимова и соавторы; А. Г. Верещагин; А. А. Фомин и соавторы; Kaufmann). В качестве растворителя чаще других применяют уксусную кислоту, насыщенную веществом, используемым для создания стационарной фазы.
Жирные кислоты на хроматограмме окрашивают азотнокислым висмутом (Е. К- Алимова и соавторы) или азотнокислым серебром (А. Г. Верещагин). При работе на денситометре более приемлем способ окраски последовательным воздействием на хроматограмму растворами уксуснокислой меди, желтой кровяной соли и хлорного железа (А. А. Фомин и соавторы). Жирные кислоты окрашивают в устойчивый сине-голубой цвет.
При изучении содержания моносахаридов в пищевом продукте полисахариды подвергают гидролизу 2 н. раствором серной кислоты (5 мл кислоты на 100 г препарата). Гидролизат нейтрализуют порошком углекислого бария и центрифугируют. Центрифугат хроматографируют (Н. П. Блинов и Г. А. Витовская).
В качестве растворителя применяют фенол, насыщенный водой, н-бутанол—уксусную кислоту—воду (4:1:5), бутанол—этанол—воду (45:5:50) и др. (Ю. А. Жданов и соавторы). Täufel окрашивает моносахариды раствором азотнокислого серебра в ацетоне с последующей обработкой спиртовым раствором щелочи. Хорошие результаты получают при обработке хроматограмм специальным реактивом, который готовят следующим образом: при постоянном помешивании 20 мл 10% раствора молибдата аммония приливают к 3 мл концентрированной соляной кислоты; сюда же добавляют 5 г хлористого аммония. Обработанную реактивом хроматограмму нагревают 20 мин. при 70°. Моносахариды окрашивают в синий цвет (Ю. А. Жданов и др.).
Определение витаминов методом хроматографии на бумаге начинают с извлечения их из пищевого продукта. Жирорастворимые витамины извлекают из гомогенизированного биоматериала органическими растворителями (ацетон, спирты). Рибофлавин извлекают фенолом. При экстракции других воднорастворимых витаминов белок из водных вытяжек осаждают трихлоруксусной кислотой, метанолом или ацетоном (Crammer; Slavik и Matoulcova). Водные вытяжки, содержащие витамины, хроматографируют.
В качестве растворителя для витаминов группы В Marsh и др. применяли н-бутиловый спирт, насыщенный водой.
Huennekens и соавторы получили хорошие результаты при разделении н-бутанолом — уксусной кислотой — водой (1:1:5). Эту же систему, а также фенол, насыщенный водой, используют для разделения аскорбиновой кислоты и ее аналогов.
Окраску производят 2,6-дихлорфенолиндофенолом или же железо-аммоний сульфатом (В. А. Девятинин).
Жирорастворимые витамины разделяют на предварительно обработанной бумаге (окисью алюминия, парафином, оливковым маслом и т. д.). В качестве растворителей используют петролейный эфир—бензол (50:2); этиловый спирт — воду (8:2) для ретинола и каротинои-дов; этиловый спирт—воду (75:25) для токоферолов; этиловый спирт — уксусную кислоту — воду (75:2,5:22,5) для витамина К; н-пропанол—метанол—воду (15:82:3) для витамина D (И. Н. Гар-кина; В. А. Девятинин; Eggitt и Ward; Green и Dam).
Количественное определение витаминов на хроматограмме может быть осуществлено спектрофотометрией элюатов неокрашенных витаминов или обработанных соответствующими красителями. Применяют также колориметрию элюатов, окрашенных треххлористой сурьмой (И. Н. Гаркина; В. А. Девятинин).
Изучение минерального состава пищевых продуктов с помощью хроматографии на бумаге мало освещено в литературе, хотя методика хроматографического разделения неорганических веществ разработана довольно подробно. Трудность состоит в выделении минеральных компонентов из пищевого продукта. Биологический материал для высвобождения минеральных веществ сжигают с концентрированной серной кислотой и прокаливают при 600°. Остаток растворяют в дистиллированной воде. Мешающие хроматографическому разделению анионы удаляют на катионитовых фильтрах. Сконцентрированные в малом объеме катионы используют для хроматографии (Vender). Растворителем служит этиловый спирт — вода — концентрированная соляная кислота — ацетон в соотношении 6:1,5:3,5:39 (Н. М. Чистяков и 3. И. Благовещенская). Используют и другие системы растворителей: метанол — этанол (1:1), ацетон — воду — концентрированную соляную кислоту (87: 5:8), пиридин — воду (6:4) и др. (Г. Д. Елисеева; Vender).
Окраска катионов может быть достигнута обработкой хромато-грамм 0,1% спиртовым раствором рубеанводородной кислоты с последующим воздействием паров аммиака. Используют также 1% раствор азотнокислого серебра или 0,5% раствор 8-оксихинолина (Н. М. Чистяков и 3. И. Благовещенская; Vender).
В последние годы значительно возросло производство и применение инсектицидов в сельском хозяйстве. Метод хроматографии на бумаге позволяет с большой достоверностью определить присутствие инсектицидов и измерить остаточное количество их в пищевом продукте. Фос-форорганические инсектициды извлекают из растительного материала органическими растворителями — хлороформом, серным эфиром (Г. Я- Исаева и соавторы). Ф. П. Вайнтрауб экстрагировал ДДТ четы-реххлористым углеродом в течение 18—20 часов.
Разделение гомологов гексахлорана ДДТ Mitchell производил на бумаге со стационарной фазой, созданной пропиткой 1% раствором соевого масла. Растворителем служил 75—80% водный раствор ацетона. Ф. П. Вайнтрауб при тех же условиях разделил ДДТ в виде нитро-соединений, затем элюировал нитросоединения бензолом, добавлял в элюат спиртовой раствор едкого кали или метилата натрия и коло-риметрировал.
Помимо упомянутых выше количественных методов определения компонентов в смеси, существует много других. Так, Jaky для количественного определения жирных кислот применял титрование элюата 0,01—0,005 н. раствором щелочи в присутствии бромфенолового синего. Т. С. Пасхина для определения аминокислот использовала фотоэлек-троколориметр. Хроматограммы по общепринятой методике она обрабатывала нингидрином и сернокислой медью, экстинкцию элюатов комплексов нингидрина с аминокислотами измеряла на фотоэлектроколо-риметре.
Возможно определение меди, включенной в комплекс, полярографическим или спектрографическим путем. Методы количественного определения требуют значительной затраты времени, поэтому часто прибегают к определению вещества непосредственно на хроматограмме. Наиболее простой способ — планиметрия пятна, как это делали Р. М. Мирзакаримов и А. М. Якубов. Следует отметить, что планиметрия пятна дает приближенные результаты.
Более точные результаты можно получить денситометрией, т. е. измерением плотности окраски на хроматограмме денситометром (И. Г. Борисова и Е. В. Будницкая; А. А. Фомин и соавторы).
В. М. Вадимов и Sulser для количественной оценки предлагают фотографировать хроматограмму, а диапозитив промерять на микрофотометре. Иногда для оценки количества вещества применяют радиоавтографию или радиометрию (Б. Н. Смирнов и соавторы; Vogelgsang).
Особую роль может играть хроматография на бумаге при определении доброкачественности пищевых продуктов. Существующие для этого методики основаны на определении конечных продуктов разложения органических веществ. Аммиак и сероводород в мясопродуктах образуются при далеко зашедших процессах распада белков. Начальные стадии порчи мясопродукта по этим реакциям не могут быть установлены. То же можно сказать и о жирах. По свидетельству Burnet и Desnuelle, в прогорклом масле раньше и в большем количестве образуются оксикислоты, нежели перекиси, которые рекомендуется определять для характеристики процессов порчи.
Метод хроматографии выгодно отличается тем, что с помощью его можно определить начальные стадии порчи продуктов. Первые попытки оценки свежести мяса определением свободных аминокислот хроматографией на бумаге сделаны как в СССР (А. Д. Авшалумова), так и за рубежом (Dvorak). А. Д. Авшалумова изучила свободные аминокислоты в свежем мясе, в мясе с начальными признаками порчи и в недоброкачественном. Оказалось, что в начальной стадии порчи в мясе среди свободных аминокислот появляется треонин, не присутствующий в безбелковом фильтрате свежего мяса. Через 96—120 часов хранения количество свободных аминокислот возрастает в 2—4 раза и появляется метионин.
Таким образом, по содержанию свободных аминокислот в фильтрате мяса можно определить начальные стадии его порчи.
Существует метод определения доброкачественности мясопродуктов хроматографией летучих жирных кислот и оснований (Н. Н. Крылова и Ю. Н. Лясковская). Вначале вещества, обусловливающие порчу мяса, извлекают спиртом и ацетоном. Экстракты обрабатывают на анионитах и выделяют фракции летучих жирных кислот и оснований.
Жирные кислоты и основания разделяют на бумаге и оценивают количественно на спектрофотометре СФ-4. В мясе с признаками порчи хроматографией выделяют следующие основания: аммиак, триметил-амин, пиперидин, пиридин и др. В свежем мясе обнаружен только аммиак.
Во фракции летучих кислот свежего мяса присутствуют муравьиная и уксусная кислоты, в мясе с признаками порчи — муравьиная, уксусная, масляная, валерьяновая, капроновая и каприновая кислоты.
Методом распределительной хроматографии на бумаге можно установить начальные стадии порчи жиров. Burnet и Desnuelle предлагают методику определения прогорклости жира графического разделения оксикислот. Бумагу пропитывают каучуком и газолином. Растворителем служит водный ацетон. Окраску осуществляют любым кислотным индикатором, например бромфеноловым синим.
В санитарной практике для характеристики процессов порчи жира наряду с другими методами используют определение кислотного числа Следует отметить, что к изменению органолеп-тических свойств жира ведет не любое увеличение кислотности, а накопление в жирах свободных жирных кислот с числом углеродных атомов от 4 до 8. Существующие методы выявления кислотного числа не позволяют установить количество низших жирных кислот в жире. Для этой цели с успехом может быть использован метод хроматографии на бумаге. Низшие жирные кислоты Brown разделял н-бутиловым спиртом, насыщенным 1,5 н. раствором аммиака. Окраска производилась щелочным раствором бромфенолового синего.
Появление альдегидов в жирах предшествует изменению органо-лептических свойств жира. При исследовании жира, окисленного воздействием ионизирующей радиации, методом распределительной хроматографии на бумаге было выделено 7 ненасыщенных и 3 насыщенных альдегида: пропионовый, масляный, валерьяновый, капроновый, пеллар-гоновый, каприновый, кротоновый, 2,4-ундециловый альдегид и акролеин (Witting и Schweigert). Следует отметить, что в недоброкачественных мясопродуктах тоже могут накапливаться карбонильные соединения.
Альдегиды и кетоны разделяют в виде 2,4-динитрофенилгидразонов на бумаге, пропитанной 5% раствором оливкового масла в четырех-хлористом углероде. В опытах Seligman и Edmonds растворителем для высших альдегидов и кетонов служила смесь изопропанол — вода (2:1), для низших — метилацетат — вода (10:7). Динитрофенилгидразоны в проявлении не нуждаются, так как они окрашены в желтый цвет.
Методика количественного определения карбонильных соединений описана в работе Schulte и Storp. Альдегиды и кетоны разделяются в виде нитрофенилгидразонов петролейным эфиром в смеси с серным эфиром (95:5). Ulman сделал попытку определить доброкачественность хлеба хроматографией углеводов. Установлено, что когда черствеет хлеб, происходит расщепление амилопектина и амилазы с образованием декстринов, но заметное увеличение количества декстринов отмечено только при длительном хранении хлеба.
Хроматография на бумаге имеет большие возможности для выявления фальсификации продукта. Для этой цели удобно использовать так называемую сравнительную хроматографию, которую разработал Sul-ser. Автор предлагает использовать круговую хроматограмму с некоторыми видоизменениями. Мостик хроматограммы, приготовленный по методу Maltias, разделяют щелью шириной 2 мм и длиной 5—6 мм на
с помощью хромато-
Форма хроматограммы для проведения сравнительной хроматографии.
2 равные части (см. рисунок). По одну сторону щели наносят контрольное вещество, по другую — исследуемое. Затем производят разделение компонентов (аминокислот, жирных кислот или углеводов) по обычной методике. Компоненты распределяют в виде концентрических полукругов, соприкасающихся по средней линии. В случае фальсификации или несоответствии сравниваемых продуктов будет отмечена разница по количеству компонентов или по интенсивности окраски отдельных фракций. Преимущество метода состоит в том, что условия разделения сравниваемых веществ (бумага, время, растворитель, температура и т. д.) тождественны.
Упомянутые выше работы далеко не исчерпывают всех возможностей хроматографического анализа в области исследования пищевых продуктов. Метод хроматографии на бумаге с успехом может быть использован для разделения нуклеиновых кислот, липидов и фосфолипи-дов, триглицеридов, антиокислителей и красящих веществ.
С развитием и упрощением техники и методики хроматографии, с разработкой и внедрением новых, более совершенных приборов для количественной оценки вещества непосредственно на хроматограмме метод, несомненно, получит более широкое распространение не только для научных исследований, но и в санитарной практике.
ЛИТЕРАТУРА
Авшалумова А. Д. Вопр. пит., 1962. № 3, стр. 22. — Алимова Е. К., Болотова Г. Д., Пустовойтова О. И. Биохимия, 1960, т. 25, № 5, стр. 773.— Блок Р. и др. Хроматография на бумаге. М., 1954. — Борисова И. Г., Будниц-1 а я Е. В. Биохимия, 1963, т. 28, в. 3, стр. 497. — Вадимов В. М. Лабор. дело, 1957, № 5, стр. 54. — Вайнтрауб Ф. П. Вопр. пит., 1962, № 4, стр. 55. — Верещагин А. Г. Биохимия, 1958, т. 23, № 5, стр. 721. — Гаркина И. Н. В кн.: Витаминные ресурсы и их использование. М., 1955, ст. 3, стр. 5.—Девятинин В. А. В кн.: Витамины. М., 1959, сб. 5, сто. 190. — Елисеева Г. Д. Труды Комиссии по аналитической химии, 1955, АН СССР, М., т. 6, стр. 439. — Блинов Н. П., Витовская Г. А. Биохимия, 1963, т. 28, в. 2, стр. 312. — Жданов Ю. А. и др. Практикум по химии углеводов. М., 1963. — Исаева Г. Я. и др. Вопр. пит, 1962, № 6, стр. 64. — Крылова H. Н., Лясковская Ю. Н. Физико-химические методы исследования продуктов животного происхождения. М., 1961. — Лясковская Ю. Н., Пиуль-
окая В. И. Методы исследования окислительной порчи жиров. М., 1960. _ Мирза-
каримов Р. М., Якубов А. М. Докл. АН Уз. ССР, 1958, № 3, стр. 29,—Пасх и-н а Т. С. Количественное определение аминокислот при помощи хроматографии на бумаге методом образования медных производных аминокислот с нингидрином. M., 1959,-— Смирнов Б. Н. и др. Биохимия. 1960, т. 25, № 2, стр. 368. — Таранова А. И. и др. Вопр. пит., 1955, № 5, стр. 27. — Фомин А. А. и др. Вопр. мед. химии, 1963. № I, стр. 76.—Ч истяков H. М., Благовещенская 3. И. Гиг. и сан., 1963, К< 5, стр. 58. _ Я н к о в С. И. Вопр. пит., 1962, № 2, стр. 39. — В 1 о с k R. J., Analyt. Chem., 1950, v. 22, p. 1327. — В г о w n F. et al., Nature, L„ 1950, v. 166, p. 66. — В u r n e t M., Desnuelle P., Olii miner., grassi e saponi, Colori e. Vernici, 1957, v. 34, p 321.— G ram mer J. I., Nature, 1948, v. 161, p. 349. — Dvorak Z., Csl Biol., 1956 т 5, стр. 235. — Eggitt P. W. R., Ward L. D., J. Sei. and Agrie., 1953, v. 4, p. 569,— Green J P., D a m H., Acta ehem. Scand., 1954, v. 8, p. 1341. — Had orn H., Bie-fer K. W., Lebensmitt. Hyg., 1956, Bd. 47, S. 75. — Huennekes F. M. a. oth., J. Amer. chem. Soc., 1953, v. 75, p. 3611,—Ja к y M., Fette, Seifen Anstrichmittel, 1959, v. 61, p. 6. — Kaufmann H. P., Analyse der Fette und Fettprodukte, Berlin, 1958.— Marsh M. M. a. oth., Analyt. Chem.. 1955, v. 27, p. 654. — Mathias W., Naturwissenschaften, 1954, Bd. 41, S 17. — Mitchell L. C., J. Ass. Offic. Agrie. Chem., 1954, v. 37, p. 216. — Read L. J„ J. biol. Chem., 1950, v. 183, p 451. — S с h u 11 e К E., Storp С. В., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 1955, 57, 1, 36.—S 1 a v i к К., Matoulco-va V., Chem. Listy, 1954, т. 48, стр. 765,—S u 1 s e r H., Mitt. Lebensmitt. u Hyg. 1959, Bd. 50, S. 287, — Täufel К. et al., Nahrung, 1960, v. 4, p. 295. — U 1 m a n M. Ernährungsforschung, 1962, 7, 1, 123,—Vender M., Chem. Listy, 1955, т. 49, стр. 771.— V о с e 1 g s a n g K-, Versuche zur Papierchromatographie freier Fettsäuren, München, I960—Witting L., Schwei gert B. S., J. Am. Oil. Chem. Soc., 1958, v. 35, p. 413.
Поступила 14/X 1963 r.
