CC BY
102
УДК 615.322
ИЗУЧЕНИЕ ЛИПИДНОГО СОСТАВА НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ ДОННИКА ЛЕКАРСТВЕННОГО (MELILOTUS OFFICINALIS L.),
ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО В АЛТАЙСКОМ КРАЕ
© Л.М. Федосеева , Т.А. Харлампович
Алтайский государственный медицинский университет, пр. Ленина, 40,
Барнаул, 656038 (Россия)
Хроматографическими методами исследован компонентный состав липидной фракции, выделенной из травы донника лекарственного. Установлено содержание в растительном сырье общих и нейтральных липидов, хлорофилла, В -каротина, лютеина, витамина Е, Определен жирно-кислотный состав.
Ключевые слова: донник лекарственный, полярные и нейтральные липиды, жироподобные вещества, хлорофилл, В -каротин, лютеин, витамин Е, жирно-кислотный состав,
Введение
Заготовленная во время цветения и высушенная надземная часть донника лекарственного (Melilotus officinalis) сем. Fabaceae используется в качестве лекарственного растительного сырья. Обладает противовоспалительным, венотонизирующим, анальгезирующим, антикоагулянтным, спазмолитическим, а также мягчительным, раздражающим и отвлекающим действием. В медицинской практике в основном используется в составе травяных сборов [1, 2].
Широкий спектр фармакологической активности обусловлен содержанием комплекса биологически активных веществ. Из литературных источников известно, что трава донника лекарственного содержит кумарины (0,4-0,9%), эфирное масло, полисахариды (слизь), сапонины, аминокислоты, дубильные вещества, каротин, витамин Е, аскорбиновую кислоту. Лекарственное сырье классифицируется как кумариносодержащее, и основное действие его обусловлено высоким содержанием кумаринов [1, 2].
Сопутствующие вещества, к которым можно отнести жироподобные вещества травы донника лекарственного, играют важную роль в составе растений, оказывая влияние на фармакологическую активность и побочные действия, снижая или усиливая их [3]. Таким образом, изучение липидов травы донника лекарственного целесообразно для расширения сведений о его химическом составе и получения экстракта с ожидаемым комплексом биологически активных, сопутствующих и балластных веществ.
Экспериментальная часть
В качестве объекта исследований использовались образцы надземной части донника лекарственного, произрастающего на территории Алтайского края. Сырье заготавливали в период цветения, проводили естественную сушку, измельчали.
Содержание общих липидов определяли гравиметрически после непрерывной экстракции смесью хлороформ - метанол (2 : 1) в аппарате Сокслета в течение 12 ч. Полученное извлечение обрабатывали раствором натрия хлорида 1% для удаления веществ не липидной природы [4, 5].
Содержание нейтральных липидов определяли гравиметрически, после непрерывной экстракции гексаном в аппарате Сокслета в течение 12 ч [4, 5].
Содержание хлорофилла устанавливали спектрофотометрически. Интенсивность окраски ацетоновых извлечений измеряли на спектрофотометре «Cary 300» (Varian) при длинах волн, соответствующих
* Автор, с которым следует вести переписку,
максимумам поглощения хлорофиллов a и b, с последующим расчетом концентрации по уравнениям Вет-штейна и Хольма для 100% ацетона [4].
Для изучения качественного состава липидной фракции проводили экстракцию смесью хлороформ -метанол (2:1) в соотношении сырье - экстрагент 1:10 при комнатной температуре, три раза по 30 мин [4].
Для разделения на нейтральные и полярные липиды извлечение наносили на колонку, заполненную силикагелем. Элюировали сначала хлороформом, затем метанолом, получая фракции нейтральных и полярных липидов соответственно [5-7].
Качественный состав полученных фракций изучали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с использованием пластинок HPTLC Silica gel 60 F 254 (Merck).
Нейтральные липиды разделяли в системе растворителей гексан - диэтиловый эфир - уксусная кислота ледяная (35 : 15 : 2) [6]. В качестве стандартных образцов использовали Р-каротин, лютеин, р-сито-стерин (Sigma). Полученные хроматограммы обрабатывали спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты 10% и нагревали при 140 °С [6].
В качестве детектирующего раствора для обнаружения стеринов и их эфиров использовали смесь серной кислоты концентрированной и уксусной кислоты ледяной в соотношении 1 : 1 [5].
Для разделения полярных липидов использовали систему растворителей хлороформ - метанол -вода (65 : 35 : 5) [5]. Обнаружение полярных липидов проводили после обработки хроматограммы парами йода. Для обнаружения аминофосфолипидов хроматограмму обрабатывали раствором нингидрина. Для обнаружения гликолипидов в качестве детектирующего раствора использовали раствор а-нафтола.
Для идентификации ксантофиллов хлороформную фракцию, содержащую пигменты, анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в нормально-фазном режиме. Анализ проводили на хроматографическом модуле «Alliance» (Waters), оснащенном спектрофотометрическим детектором с диодной матрицей в следующих условиях: колонка - LiChrosorb® Si60, (250*4) мм, 5 цм; элю-ент: гексан - ацетон - этилдиизопропиламин (809 : 190 : 1); скорость потока - 1,5 мл/мин. В качестве внешнего стандарта использовали смесь ксантофиллов с известным составом (DSM). Идентификацию компонентов проводили по спектрам поглощения и временам удерживания [8, 9].
Количественное содержание Р-каротина и лютеина определяли методами ТСХ и спектрофотомет-рии. Зоны, соответствующие Р-каротину и лютеину снимали скальпелем и элюировали. Количественное содержание пигментов определяли на cпeктpoфoтoмeтpe«Cary 300», используя специфическое для каждого пигмента значение коэффициента удельного поглощения [4].
Анализ жирно-кислотного состава проводили методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Исследовали фракцию общих, полярных и нейтральных липидов. Образцы после дериватизации анализировали на газовом хроматографе «СР-3800» (Varian), оснащенном пламенно-ионизационным детектором. Условия хроматографирования: колонка CP-Select CB for FAME, 100 м; температура инжектора - 270 °С; деление потока - 100; температура детектора - 300 °С; температура в термостате колонок - 200 °С; скорость потока газа носителя (азот) - 1 мл/мин. В качестве стандартов для идентификации компонентов использовали смесь метиловых эфиров жирных кислот (Sigma), а также кедровое, льняное и арахисовое масла, полученные в условиях лаборатории из семян и орехов экстракцией гексаном и подготовленные соответствующим образом [4, 6, 10, 11].
В неомыляемой фракции методом ВЭЖХ по временам удерживания и спектрам поглощения идентифицировали витамин Е и установили его количественное содержание. Условия хроматографирования: диодно-матричный детектор; аналитическая длина волны - 290 нм; колонка Wakosil C18HG (250*4,6) мм, 5цм; элюент - ацетонитрил - пропанол-2 - вода (55 : 50 : 2); скорость потока - 1 мл/мин. В качестве внешнего стандарта использовали токоферола ацетат (Sigma), а также кедровое масло.
Обсуждениерезулътатов
В результате проведенных исследований установлено, что суммарное содержание жироподобных веществ, извлекаемых смесью хлороформ - метанол (2 : 1), в траве донника лекарственного составляет около 5%. Сравнительно высокое содержание нейтральных липидов (около 2%) обусловлено, по всей видимости, образованием плодов, которое начинается во второй декаде июля и сочетается с бурным цветением и бутонизацией.
Качественный анализ липидов травы донника лекарственного проводили методом ТСХ, позволяющим селективно визуализировать анализируемые компоненты посредством дериватизации.
На хроматограмме хлороформного извлечения, обработанной раствором фосфорномолибденовой кислоты, наблюдалось 11 пятен синего цвета, в том числе пятна, соответствующие по Р-ситостерину, Р-каротину, лютеину (табл. 1).
Для визуализации стеринов и их эфиров обработку проводили смесью серной и уксусной кислот. На хроматограмме обнаруживалось 3 зоны красного цвета, одна из которых по соответствует Р-ситостерину.
На хроматограмме полярных липидов (метанольное извлечение) после обработки парами йода проявлялось 12 зон желтого цвета разной интенсивности (табл. 2).
После обработки раствором нингидрина наблюдалось 5 интенсивных зон розового цвета - амино-фосфолипиды, после обработки раствором а-нафтола - 2 зоны синего цвета - гликолипиды и 3 зоны серовато-красного цвета - гликостерины.
В результате ВЭЖХ-анализа было установлено наличие в траве донника лекарственного стереоизомеров лютеина и зеаксантина (рис. 1).
Таблица 1. Результаты ТСХ нейтральныхлипидов травы донника лекарственного
№ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
ЯГ пятен на хроматограмме извлечения после обработки раствором фосфорномолибденовой кислоты Пятно на хроматограмме раствора СО лютеина Пятно на хроматограмме раствора СО В-ситостерина Пятно на хроматограмме растора СО В-каротина Пятна фитостеринов, окрасившиеся в красный цвет после обработки смесью серной и уксусной кислот 0,03 0,09 0,19 0,26 + 0,40 0,51 + + 0,63 + 0,74 + 0,86 0,96 1,00 +
Таблица 2. Результаты ТСХ полярных липидов травы донника лекарственного
№ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
М" пятен на хроматограмме извлече- 0,0 0,1 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 0,4 0,4 0,5 0,6 0,7
ния после обработки парами йода 6 0 0 3 5 7 9 2 4 2 6 5
Пятна аминофосфолипидов + + + + +
Пятна гликолипидов + +
Пятна гликостеринов + + +
Рис. 1. Хроматограмма хлороформного элюата травы донника лекарственного
Доминирующим является Е-лютеин (пик с времением удерживания 13,935 мин). Его количество, вычисленное методом нормирования, составило около 80% от суммы ксантофиллов. Результаты хроматографического анализа приведены в таблице 3.
В ходе дальнейшего исследования было проведено количественное определение пигментных веществ и витамина Е. Содержание хлорофилла в траве донника лекарственного составило 100 мг %, лютеина - 58 мг%, Р-каротина - 111 мг % (табл. 4).
Витамин Е в неомыляемой фракции определяли методом ВЭЖХ (рис. 2). Были идентифицированы 5-, у- и а-изомеры, основным из которых является а-токоферол (пик с временем удерживания 5,943 мин). Содержание витамина Е в траве донника лекарственного составляет около 4 мг % (табл. 4).
Таблица 3. Результаты идентификации ксантофиллов травы донника лекарственного.
Название компонента Время удерживания компонента на хроматограмме стандартного образца, мин Время удерживания компонента на хроматограмме анализируемого образца, мин Содержание компонента в анализируемом образце, % от суммы
7-изомер лютеина 13,394 13,438 1,2
Все Е-изомеры лютеина 14,001 13,935 77,0
Все Е-изомеры зеаксантина 14,687 14,776 7,4
Ксантофилл - 16,601 3,6
Ксантофилл - 17,281 4,4
97-зеаксантин 19,788 19,814 4,2
137-зеаксантин 21,390 21,539 0,6
157-зеаксантин 21,883 22,177 1,7
Таблица 4. Результаты количественного определения жироподобных веществ надземной части донника
лекарственного
Название компонента Содержание компонента в пересчете на абсолютно сухое сырье, %
Общие липиды 5,1±0,3
Нейтральные липиды 2,3±0,2
Хлорофилл 0,100±0,010
Р-каротин 0,058±0,006
Лютеин 0,111±0,010
Витамин Е 0,0037±0,0004
Рис. 2. Хроматограмма неомыляемой липидной фракции, выделенной из травы донника лекарственного. Пик с временем удерживания: 5,274 - 5-токоферол; 5,573 - у-токоферол; 5,943 -а-токоферол
В результате исследования жирно-кислотного состава травы донника лекарственного было идентифицировано 10 высших жирных кислот (рис. 3), содержащихся преимущественно в составе нейтральных липидов. Основными являются полиненасыщенные кислоты: а-линоленовая (до 50%) и линолевая (до 19%). Из насыщенных превалирует пальмитиновая кислота (22%). Результаты анализа представлены в таблице 5.
Рис. 3. Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот травы донника лекарственного Таблица 5. Жирно-кислотный состав надземной части травы донника лекарственного.
Жирные кислоты В составе общих, % от суммы В составе нейтральных, % от суммы В составе полярных, % от суммы
С8:0 0,2 Ниже предела обнаружения Ниже предела обнаружения
С10:0 0,6 0,8 (92%)* 0,1
С12:0 2,9 4,1 (94%) 0,З
С14:0 2,4 3,8 (87%) 1,0
С16:0 22,0 26,7 (60%) 32,6
С18:0 4,3 З,З (64%) З,6
С 18:1 1,8 2,2 (72%) и
С18:2 10,7 12,2 (66%) 11,2
С18:3 альфа З0,8 41,3 (61%) 47,4
С20:1 1,6 3,1 (100%) -
* В скобках указано содержание компонента в составе нейтральных липидов от его общего количества в растительном сырье.
Выводы
1. В результате проведенных исследований установлено, что общее содержание жиро подобных веществ в траве донника лекарственного составляет около 5%, массовая доля нейтральных липидов - до 2,5%.
2. Методом ТСХ с применением детектирующих реагентов обнаружены эфиры стеринов, гликосте-рины, гликолипиды, аминофосфолипиды.
3. Хроматографическими методами (ВЭЖХ, ТСХ) с применением стандартных образцов идентифицированы Р-каротин, зеаксантин, лютеин, р-ситостерин, витамин Е.
4. Содержание хлорофилла в траве донника лекарственного составляет 100 мг%, лютеина - 58 мг%, Р-каротина - 111 мг%, витамина Е - 4 мг%.
5. Методом ГЖХ идентифицировано десять высших жирных кислот, из которых основная доля приходится на пальмитиновую (более 20%) и а -линоленовую (более 40%).
Список литературы
1.
2.
3.
European Medicines Agency Evaluation of Medicines for Human Use, Melilotus officinalis (L.) Lam., herba, Assessment report for the development of community monographs and for inclusion of herbal substance(s), preparation^) or combinations thereof in the list / Doc. Ref. EMEA/HMPC354183/2007. London, 2008. 38 c.
Универсальная энциклопедия лекарственных растений / сост. И.Н. Путырский, В.Н. Прохоров. М., 2000. 656 с. Гаммерман А.Ф., Кадаев Г.Н., Яценко-Хмелевский А.А. Лекарственные растения. 4-е изд., исп. и доп. М., 1990. 543 с.
4. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П. Методы биохимического исследования растений I под ред.
А.И. Ермакова. 3-є изд., перераб. и доп. Л., 1987. 430 с.
З. Кейтс М. Техника липидологии. М., 197З. 321 с.
6. Ширшова Т.И., Волкова Г.А., Матистов Н.В. Липиды и высшие жирные кислоты в Allium Strictum (Alliaceae)II Растительные ресурсы. 2010. Т. 46. Вып. 2. С. 10З-109.
7. Ширшова Т.И., Скупченко Л.А.,Груздев И.В. Липиды и высшие жирные кислоты в некоторых видах рода Berberis (Berberidaceae) II Растительные ресурсы. 2010. Т. 46. Вып. 1. С. 72-76.
8. Schierle, J., J. D. Klipfel, and B. Pietsch. Determination of added lutein and zeaxanthin in foods. Version 1.4 II DSM Nutritional Products, Basel. Switzerland, 2004. 4 c.
9. Xiu-Xia Li, Lu-Jia Han. Iron(II) - induced isomerization of (all-E)- xanthophylls pigments lutein, zeaxanthin, and P-cryptoxanthin in acetone II Eur. Food Res. Technol. 2008. C. 1307-1313.
10. Бергельсон Л.Д., Дягловицкая Э.В., Молотковский Ю.Г. Препаративная биохимия липидов. М., 1981. 2З6 с.
11. ГОСТ 30623 «Масла растительные и маргариновая продукция. Метод обнаружения фальсификации». Минск, 1998. 1Зс.
Поступило в редакцию 7 октября 2010 г.
После переработи 18 ноября 2010 г.
