CC BY
0
Список литературы
1. Баратов М. О. Эпизоотические особенности туберкулеза крупного рогатого скота в РД / М. О. Баратов, М. М. Ахмедов, О. П. Сакидиби-ров // Мат. Всеросс. научно-практ конф., по-свящ. 75-летию ДГСХА «Образ, наука, инновац. бизнес с/х регионов». - Махачкала - 2007.
2. Биохимия животных - Кононский А. И. -Москва, Колос, 1992 г. - 526 с.
3. Биохимия животных. Фундаментальные и клинические аспекты - Зайцев С.Ю., Коно-патов Ю. В. - Санкт-Петербург-Краснодар. -2004 г. - 384 с.
4. Ветеринарный клинический лексикон / В. Н. Байматов, В. М Мешков, А. П. Жуков, В. А. Ермолаев // М.: Колос С, 2009. - 327 с.
5. Ветеринарная гепатология. Уша Б. В. -Москва. Колос 1979 г. - 263 с.
6. Ермолаев В. А. Динамика морфологических показателей крови телят с гнойными ранами / В. А. Ермолаев, Е. Н. Никулина // Материалы Международной научно-практической конференции «Кадровое и научное обеспечение инновационного развития отрасли жи-
вотноводства»// Учёные записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н. Э. Баумана. - Казань, 2010. - Т. 203. - С. 109-114.
7. Клиническая диагностика внутренних незаразных болезней сельскохозяйственных животных - Смирнов А. М., Конопелько П. Я., Постников В.С. и др. - Ленинград, Колос -1998 г. - 447 с.
8. Клиническая биохимия сельскохозяйственных животных - Васильева Е. А. -Москва. Россельхозиздат - 1982 г. - 254 с.
9. Методические указания по применению унифицированных биохимических методов исследования крови, мочи и молока в ветеринарных лабораториях - Всесоюзная академия сельскохозяйственных наук имени В.И. Ленина - Москва - 1981 г. - 87 с.
10. Трегубов В. И. Клинический анализ крови сельскохозяйственных животных / В. И. Трегубов // Методическое указание для студентов по специальности 111201 «Ветеринария» и ветеринарных врачей ординаторов. -п. Персиановский. - 2006. - С. 17.
001: 10.48612/зЬогшк-2024-1-49 УДК 578.828.11:636.22/.28
ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ВИРУСА ЛЕЙКОЗА ЧЕТВЕРТОГО И СЕДЬМОГО ГЕНОТИПОВ
Горбунова Мария Евгеньевна, канд. биол. наук Усольцев Константин Валерьевич, канд. вет. наук Додонова Екатерина Алексеевна Осянин Константин Анатольевич, канд. биол. наук Хаммадов Наиль Ильдарович, канд. биол. наук
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань, Российская Федерация
В статье приводятся результаты по изучению гематологических показателей крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза четвертого (группа в4) и седьмого (группа G7) генотипа. В ходе исследований было выявлено, что по содержанию лейкоцитов животные группы G4, превосходят показатели G7 - на 35 %. Для обеих групп установлено увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов, понижение уровня сегментоядерных нейтрофиллов, эозинофилов. Количество базофилов у всех животных было практически одинаково и находилось в пределах физиологической нормы. В группе G7 отмечено отсутствие моноцитов для всех исследованных животных. Результатами проведенных гематологических исследований установлено, что гематологические изменения у крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза G4, показали более выраженные нарушения функции кроветворения по сравнению с G7.
Ключевые слова: вирус лейкоза крупного рогатого скота; гематология; генотипирова-ние; ген епу
THE EFFECT OF LEUKEMIA VIRUS OF THE FOURTH AND SEVENTH GENOTYPES ON THE HEMATOLOGICAL PARAMETERS OF CATTLE
Gorbunova Maria Evgenievna, PhD Biol. Sci Usoltsev Konstantin Valeryevich, PhD Vet. Sci Dodonova Ekaterina Alekseevna Osyanin Konstantin Anatolyevich, PhD Biol. Sci Khammadov Nail Ildarovich, PhD Biol. Sci
FSBSI "Federal Center for ToxicologicalRadiation and Biological Safety", Kazan, Russian Federation
The article presents the results of the study of hematological parameters of cattle infected with leukemia virus of the fourth (group G4) and seventh (group G7) genotypes. In the course of research, it was revealed that in terms of leukocyte content, animals of the G4 group exceed G7 indicators by 35%. For both groups, an increase in the number of rod-shaped neutrophils, a decrease in the level of segmented neutrophils, eosinophils were found. The number of basophils in all animals was almost the same and was within the physiological norm. In the G7 group, the absence of monocytes was noted for all the studied animals. The results of the conducted hematological studies found that hematological changes in cattle infected with leukemia virus G4 showed more pronounced disorders of hematopoie-sis compared with G7.
Key words: bovine leukemia virus; hematology; genotyping; env gene
Лейкоз крупного рогатого скота (КРС) -хроническое инфекционное заболевание опухолевой природы [4], возбудителем которого является РНК-содержащий онкогенный вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС, англ. Bovine leukemia virus - BLV), относящихся к роду Deltaretrovirus, семейству Retroviri-dae, подсемейству Onkornaviridae.
Несмотря на проведение мероприятий по оздоровлению неблагополучных по лейкозу стад, лейкоз остается сложной проблемой для многих стран мира, в том числе и для Российской Федерации. В структуре инфекционных патологий животных лейкоз крупного рогатого скота занимает лидирующие позиции и составляет около 60 % [9].
На сегодняшний день к наиболее эффективным методам борьбы с лейкозом КРС относят его раннюю диагностику с использованием серологических тестов, таких как РИД и ИФА, изоляцию и выбраковку больных животных. Также от положительно реагирующих в РИД животных отбирают кровь для гематологического анализа и выявления больных животных. При лейкозе в лейкоцитарной формуле отмечается увеличение количества лейкоцитов, в том числе нейтрофилов и лимфоцитов, снижение уровня эритроцитов, гемоглобина. Юные недифференцированные формы клеток составляют более 5 % [6]. Так, при гематологическом исследовании в 1 мкл крови число лейкоцитов может быть более 40 тыс. при максимально допустимом уровне в
12 тысяч.
На сегодняшний день большой интерес вызывает проблема причинно-следственной связи генотипических характеристик возбудителя и особенностей эпизоотологии и морфогенеза болезни [3]. По результатам филогенетического анализа гена env вируса на 2023 г. все выделенные и/или депонированные в базу данных GenBank ^СВ1) изоляты ВЛ КРС разделены на двенадцать циркулирующих в различных географических регионах мира генотипов (от G1 до G12). Представители разных генотипов ВЛ КРС отличаются по некоторым биологическим свойствам (пато-генность, вирулентность, антигенная нагрузка). Есть данные, что наиболее выраженные клинико-гематологические изменения проявляются у животных, зараженных G4 генотипом (бельгийская подгруппа) [3, 8].
Исследование гематологических показателей у инфицированных различными генотипами ВЛ КРС животных даст возможность разработать более эффективные про-тивоэпизоотические мероприятия в животноводческих хозяйствах, а также выявлять патогенетические особенности развития лей-козного процесса. Целью данного исследования являлось изучение гематологических показателей крупного рогатого скота, инфицированного вируса лейкоза четвертого и седьмого генотипа.
Методика исследований. Объектом исследования являлись образцы цельной крови
BLV-положительных (n=11) коров черно-пестрой породы из хозяйств Республики Татарстан. Обнаружение провирусной ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота проводили методом ПЦР-РВ с использованием разработанной ранее комбинацией олигонуклео-тидов (прямой и обратный праймер, TaqMan-зонд) к гену env (область р24) [1] на ампли-фикаторе CFX 96 («BioRad», США).
Для амплификации участка гена env ВЛ КРС проводили «гнездовую» ПЦР по Beier et.al. с применением «внешних»
(«env5032»+«env5608») и «внутренних» («env5099»+«env5521») праймеров [10]. Се-квенирование полученных образцов ДНК выполнили по методу Сэнгера в ЗАО «Евроген» (Москва). Идентификацию полученных нук-леотидных последовательностей проводили с использованием сервиса BLAST и баз данных GenBank [2, 8]. Для выравнивания и филогенетического анализа были отобраны 67 нук-леотидных последовательностей изолятов ВЛ КРС опубликованных в базе данных GenBank: HE967302, AY151262, KJ668809, K02120, KU233528, KU233564, FJ808573, EF065646, KX674367, EF065640, KY421038, KY421038, AB934282, LC080652, FJ808574, AF399704, LC080655, KP201465, EF065647, AF503581, HM563774, M35238, KF801459, HQ902258, LC060794, LC007993, EF065635, EF065645, KU233540, KJ668819, KJ668815, AY185360, LC080656, FJ808582, KJ668817, KU233548, LC080658, KJ668816, KU233530, KF801458, HM563758, EU262555, S83530, JQ686119, JQ675759, HM563764, GU724606, JF713455, LC080666, LC080659, LC154064, KU233561, KU233540, KU764746, KU764747, АР018032, LC577637, LC577640, EF600696, NC_001414, AP018007, АР018012, AP019593, LC552982, MH170028, LC080667, которые также использовали для построения филогенетического дерева по гену env. Данные последовательности для исследования по гену env ограничивали следующими праймерами «evn5099» и «evn5521». Множественное выравнивание и филогенетический анализ гена env проводили в программе Mega 11.
Гематологические показатели опреде-
ляли в мазках крови, окрашенных по методу У.Б Лейшмана. Для подсчета лейкоцитов использовали камеру для счета форменных элементов крови (Камера Горяева) (ООО «Ми-ниМед», Россия). Физиологическую норму изучаемых гематологических показателей определяли по данным О. Н. Полозюк [5]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартных программ Microsoft Office (Microsoft Excel).
Результаты исследований и их обсуждение. На первом этапе настоящей работы провели секвенирование полученных после амплификации фрагментов гена env. После секвенирования исследуемые нуклео-тидные последовательности были выровнены относительно 67 нуклеотидных последовательностей гена env изолятов ВЛ КРС. Соответствие к тому или иному генотипу анализируемых нуклеотидных последовательностей определили по степени гомологии между анализируемой и референсными последовательностями. На основании филогенетического анализа гена env построили дендро-грамму, состоящую из семи клад (рисунок 1).
Из представленных на рисунке 1 данных видно, что каждая клада сформирована определенными генотипами. Ветвь I клады состоит из представителей, принадлежащих к первому (G1), II клады - к восьмому (G8) и четвертому (G4), III клады - ко второму (G2), девятому (G9) и третьему (G3), IV клады - к шестому (G6), десятому (G10), одиннадцатому (G11), V клады - к седьмому (G7), VI - к пятому (G5), VII клады - к четвертому (G4) и третьему (G3) генотипам. Анализируемые изоляты № 1, 2, 4, 5, 9-12 относятся к четвертому генотипу (G4), а № 3 и № 8 - к седьмому генотипу (G7). Таким образом выявлено, что девять исследуемых голов крупного рогатого скота инфицированы вирусом лейкоза КРС G4 (далее -группа G4), два - G7 (далее - группа G7).
Следующим этапом данной работы явилось изучение гематологических показателей крови исследуемых животных. Анализируемые показатели крови представлены в виде количественных данных в среднем по каждой группе (таблица 1).
Рисунок 1 - Филогенетическое дерево изолятов вируса лейкоза, построенное на основании
секвенирования гена env
Таблица 1 - Гематологические показатели крови крупного рогатого в зависимости от заражения G4 и G7 генотипами вируса лейкоза крупного рогатого скота_
Показатели Границы ре-ференсной нормы Группа G4 ср. знач (min-max) Группа G7 ср. знач (min-max)
Лейкоциты, 109/л 4-12 20,5 (17,5-23,7) 13,35 (13,2-13,5)
Лимфоциты, 109/л 45-75 84,2 (80-89) 83,5 (83-84)
Нейтрофилы, %: юные 0-1 0 0
палочкоядерные 2-5 8,2 (4-15) 8 (7-9)
сегментоядерные 15-45 6 (0-11) 5,5 (5-6)
Эозинофилы, % 2-20 1,1 (0-3) 2,5 (1-4)
Базофилы, % 0-2 0,33 (0-2) 0,5 (0-1)
Моноциты, % 2-7 0,14 (0-1) 0
Лейкоциты (абсолютное кол-во) 17,46 (14,74-20,75) 11,14 (11,08-11,2)
Как видно из таблицы 1, содержание в крови лейкоцитов у обоих групп находились выше физиологической нормы. Все исследуемые животные находились на сублейкемиче-ской стадии лейкозного процесса, т.к. по данным литературы, при лейкопеническом уровне в 1 мкл крови содержится от 1 до 4 тыс. лейкоцитов; алейкемическом - от 4 до 10 тыс.; сублейкемическом - от 10 до 40 тыс.;
лейкемическом - свыше 40 тыс. [7]. Также было установлено, что по содержанию лейкоцитов животные группы G4 превосходят показатели группы G7 на 35 %. Высокий уровень лейкоцитов указывает на интенсивность течения патологического процесса. В обоих группах установлено увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов, что может указывать на наличие инфекционного про-
цесса в организме животного. Выявлено понижение уровня сегментоядерных нейтро-филлов для всех исследуемых групп, что может наблюдаться при нарушении процесса созревания клеток.
Количество базофилов у всех животных было практически одинаковым и находилось в пределах физиологической нормы. В обоих группах содержание эозинофилов регистрировалось ниже нормы, однако для группы G4 установлено увеличение данного показателя на 56 % по сравнению с G7. В группе G7 отмечено отсутствие моноцитов для всех исследованных животных. Эозинофилы и моноциты участвуют в фагоцитозе, что позволяет организму бороться с чужеродными антигенами, исключая элементы патологической микрофлоры, а также злокачественные атипичные клетки.
Выводы. По результатам филогененти-ческого анализа генотипический состав изо-лятов вируса лейкоза, выделенных на территории Республики Татарстан, представлен как минимум двумя из двенадцати известных генотипов ВЛ КРС по гену env (G4 и G7). Гематологические показатели крови животных, инфицированных вирусом лейкоза данных генотипов, показали выраженные отклонения по сравнению с физиологической нормой. К тому же гематологические изменения у крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза G4 указывают на более выраженные нарушения функции кроветворения по сравнению с G7.
Список литературы
1. Горбунова М. Е. Разработка способа экспресс диагностики лейкоза крупного рогатого скота, основанного на обнаружении гена нук-леокапсидного белка р24 методом ПЦР в режиме реального времени / М. Е. Горбунова // Ветеринарный врач. - 2016. - № 6. - С. 3-7.
2. Дифференциация штаммов Bacillus anthracis методом анализа температур плавления продуктов ПЦР, полученных после амплификации VNTR локусов / Н. А. Фахрутди-нов, Е. А. Анисимова, Д. А. Миргазов [и др.] // Ветеринарный врач. - 2023. - № 2. - С. 41-46.
3. Изучение особенностей клинико-
гематологического проявления лейкоза крупного рогатого скота в зависимости от мутационных изменений в генотипе BLV / С. С. Абакин, Т. Л. Красовская, Д. Г. Пономаренко, В. А. Оробец // Вестник АПК Ставрополья. -2016. - № 1(21). - С. 55-60.
4. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса лейкоза крупного рогатого скота, идентифицированных в Камско-Устьинском районе Республики Татарстан / М. Е. Семенова, Т. Х. Фаизов, К. В. Усольцев [и др.] // Ветеринарный врач. - 2014. - № 1. - С. 29-32.
5. Полозюк О. Н. Гематология: учебное пособие / О. Н. Полозюк, Т. М. Ушакова. - Донской ГАУ. Персиановский: Донской ГАУ, 2019. - 159 с.
6. Симонян Г. А. Особенности гематологического проявления лейкоза крупного рогатого скота / Г. А. Симонян // Труды Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. - 2013. - Т. 77. - С. 160-166.
7. Сравнение гематологических показателей крупного рогатого скота, инфицированного различными подгруппами вируса лейкоза / М. Е. Горбунова, Р. И. Шангараев, Е. А. До-донова [и др.] // Ветеринарный врач. - 2024. -№ 1. - С. 34-39.
8. Структура геномов (фенотип популяций), доминирующих на территории УрФО генетических групп возбудителя лейкоза крупного рогатого скота / И. М. Донник А. П. Порываева, М. В. Петропавловский, [и др.] // Ветеринарный врач. - 2023. - № 5. - С. 30-36.
9. Эпизоотическая ситуация в Российской Федерации 2022 год. ФГБУ ВНИИЗЖ АИЦ Управления ветнадзора г. Владимир. [Электронный ресурс]. - Режим доступа: URL: -https://fsvps.gov.ru/sites/default/files/files/iac / iac_epizooticheskaya_situaciya_v_rf_2022_god.pdf , свободный. - (дата обращения: 2.08.2023).
10. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA a DNA sequencing / D. Beier, P Blankenstein, O Marquardt, J Kuzmak // P. Munch. Tierarztl.Wochenschr. - 2001. - Vol. 114, № 7(8). - P. 252-256.
