CC BY
2Ветеринарный врач. 2024. № 1. С. 34 - 39 The Veterinarian. 2024; (1): 34 - 39
Научная статья УДК 578.828.11
DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_1_34
СРАВНЕНИЕ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ИНФИЦИРОВАННОГО РАЗЛИЧНЫМИ ПОДГРУППАМИ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА
Мария Евгеньевна Горбунова, кандидат биологических наук, [email protected] Рафкат Искандарович Шангараев, кандидат ветеринарных наук, [email protected] Екатерина Алексеевна Додонова, [email protected] Наиль Ильдарович Хаммадов, кандидат биологических наук, [email protected] Константин Валерьевич Усольцев, кандидат ветеринарных наук, [email protected]
Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности, Казань, Российская Федерация
Автор, ответственный за переписку: Мария Евгеньевна Горбунова
Аннотация. Лейкоз крупного рогатого скота является одним из наиболее распространенных заболеваний среди инфекционных патологий крупного рогатого скота в Российской Федерации. В рамках данной работы проведено исследование по изучению показателей лейкограммы животных, инфицированных различными подгруппами вируса лейкоза крупного рогатого скота. Диагностические исследования крови крупного рогатого скота (n=34) проводили с использованием молекулярно-биологи-ческих (ПЦР, ПЦР-ПДРФ) и гематологических методов. По результатам ПДРФ-анализа, для всех изо-лятов вируса лейкоза крупного рогатого скота установили, распределение на три группы: 1 - бельгийская (n=23), 2 - австралийская (n=7) и 3 - неидентифицированная (n=4). В ходе исследований было выявлено, что по содержанию лейкоцитов животные 1 и 2 групп превосходят показатели 3 группы -на 38 и 42% соответственно. В 1 и 3 группах обнаружено увеличение количества палочкоядерных нейтрофиллов для 70 и 100% животных, соответственно, тогда как во 2 группе наблюдалось снижение по сравнению с физиологической нормой. Также выявлено понижение уровня сегментоядерных нейтрофиллов для всех исследуемых групп. Содержание базофилов у всех животных было практически одинаково и находилось в пределах физиологической нормы. В 78% случаев для 1, 100% - 2 и 86% - 3 групп количество эозинофилов находилось ниже предела нормы. Показатели эозинофилов в крови животных 2 группы были ниже данных 1 и 3 групп - на 62,8 и 64,8% соответственно. Однако уровень моноцитов у 2 группы выше, чем у 1 и 3 групп - на 79 и 86% соответственно. Гематологические изменения у крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза бельгийской и неидентифициро-ванной подгрупп показали на более выраженные нарушения функции кроветворения по сравнению с австралийской подгруппой.
Ключевые слова: вирус лейкоза крупного рогатого скота, изолят, ген env, генотипирование, ПДРФ, лейкограмма
Для цитирования: ГорбуноваМ. Е., Шангараев Р.И., Додонова Е.А., Хаммадов Н.И. Усольцев К.В. Сравнение гематологических показателей крупного рогатого скота, инфицированного различными подгруппами вируса лейкоза // Ветеринарный врач. 2024. № 1. С. 34 - 39. DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_1_34
COMPARISON OF HEMATOLOGICAL PARAMETERS OF CATTLE INFECTED WITH VARIOUS SUBGROUPS OF LEUKEMIA VIRUS
Maria E. Gorbunova, candidate of biological sciences, [email protected] Rafkat I. Shangaraev, candidate of veterinary sciences, [email protected] Ekaterina A. Dodonova, [email protected] Nail I. Khammadov, candidate of biological sciences, [email protected] Konstantin V. Usoltsev, candidate of veterinary sciences, [email protected]
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Security, Kazan, Russian Federation
Corresponding author: Maria E. Gorbunova
Abstract. Bovine leukemia is one of the most common diseases among infectious pathologies of cattle in the Russian Federation. Within the framework of this work, a study was conducted to study the leukogram indicators of animals infected with various subgroups of the bovine leukemia virus. Diagnostic studies of cattle blood (n=34) were carried out using molecular biological (PCR, PCR- RFLP) and hematological methods. According to the results of the RFLP analysis, for all isolates of the bovine leukemia virus. The distribution was established into three groups: 1 - belgian (n=23), 2 - australian (n=7) and 3 - unidentified (n=4). In the course of studies, it was revealed that the leukocyte content of animals of groups 1 and 2 surpass the indicators of group 3 - by 38 and 42%, respectively. In groups 1 and 3, a increase in the number of rod-shaped neutrophils was found for 70 and 100% of animals, respectively, while in group 2 there was a decrease compared to the physiological norm. A decrease in the level of segmented neutrophils was also revealed for all the studied groups. The content of basophils in all animals was almost the same and was within the physiological norm. In 78% of cases for groups 1, 100% - 2 and 86% - 3, the number of eosinophils was below the normal limit. Indicators of eosinophils in the blood of animals of group 2 were lower than those of groups 1 and 3 - by 62.8 and 64.8%, respectively. However, the level of monocytes in group 2 is higher than in groups 1 and 3 - by 79 and 86%, respectively. Hematological changes in cattle infected with the leukemia virus of the belgian and unidentified subgroups showed more pronounced disorders of hematopoiesis compared to the australian subgroup.
Keywords: bovine leukemia virus, isolate, env gene, genotyping, RFLP, leukogram
Введение. Лейкоз крупного рогатого скота представляет собой хроническую инфекционную болезнь онкогенной природы, характеризующуюся злокачественным разрастанием недифференцированных клеток крови в различных органах. В течение лейкоза крупного рогатого скота принято различать пять стадий: инкубационная, субклиническое вирусоносительство и синтез специфических антител, гематологическая, опухолевая и терминальная. Согласно официальным данным об эпизоотической ситуаций по социально значимым и особо опасным болезням животных за 2022 год лейкоз является наиболее распространенным заболеванием (75% от общего числа выявленных неблагополучных пунктов) среди инфекционных патологий крупного рогатого скота в Российской Федерации. Так, в 2022 году в Российской Федерации лейкоз был зарегистрирован на территории 64 субъектов и зафиксировано 6668 неблагополучных пунктов по данной инфекции [1]. Эпизоотическая ситуация в Республике Татарстан характеризуется эндемичностью [2].
Диагностические исследования на лейкоз в Российской Федерации проводят гематологическим, серологическими (реакция иммунодиффузии (РИД), иммуноферментный анализ (ИФА)) и моле-кулярно-генетическим (полимеразная цепная реакция (ПЦР)) методами. Основу прижизненной диагностики лейкоза составляет серологический метод РИД. От положительно реагирующих в РИД животных отбирают кровь для гематологического исследования и выявления больных животных. При диагностике крупного рогатого скота гематологическими методами существует понятие «лейкозный ключ», что представляет собой подсчет абсолютного числа и процента лимфоцитов у животных старше трех лет. Гематологические изменения характеризуют развитие воспалительных процессов в организме, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС) животных. У крупного рогатого скота лейкоз проявляется в основном увеличением количества лейкоцитов, в том числе нейтрофилов и лимфоцитов. При гематологическом анализе 1 мкл крови число лейкоцитов может достигать более 40 тыс., при максимально допустимом значении 12 тыс. По данным литературы, у животного, зараженного ВЛ КРС в лейкоцитарной формуле юные недифференцированные формы клеток составляют более 5%, также в крови отмечаются снижение уровня эритроцитов, гемоглобина, повышением числа клеток иммунной системы (лейкоцитов) [3].
На сегодняшний день большой интерес вызывет проблема причинно-следственной связи генотипических характеристик возбудителя и особенностей эпизоотологии и морфогенеза болезни. Оценка генетического разнообразия ВЛ КРС преимущественно основана на методах ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длинн рестрикционных фрагментов), секвенирования и филогенетического анализа гена env возбудителя. По результатам филогенетического анализа на 2023 г все выделенные и/или депанированные в базу данных GenBank (NCBI) изоляты ВЛ КРС классифицированы на двенадцать циркулирующих в различных географических регионах мира генотипов (от G1 до G12). Для классификации ВЛ КРС на основе ПЦР-ПДРФ-анализа учеными всего мира предложены различные диагностические подходы [4]. Однако наиболее широкое примениение нашел способ определения генотипической принадлежности изолятов ВЛ КРС с разделением по трем подгруппам согласно географическому распределению - бельгийская, австралийская и японская предложенный D. Beier
et.al., в 2001 г. Представители разных генотипов ВЛ КРС отличаются по некторым биологическим свойствам (патогенность, вирулентность, антигенная нагрузка). Наиболее выраженные клинико-гематологические изменения проявляются у животных, инфицированных G4 генотипом (бельгийская подгруппа) [5]. Исследование гематологических показателей у инфицированных различными генетическими группами ВЛ КРС животных даст возможность разработать более эффективные противоэпи-зоотические мероприятия в животноводческих хозяйствах и объективно оценивать эпизоотическую ситуацию по лейкозу крупного рогатого скота. Целью данного исследования являлось изучение гематологических показателей крупного рогатого скота, инфицированного различными подгруппами вируса лейкоза.
Материалы и методы. Объектом исследования являлись образцы цельной крови BLV (bovine leukemia virus) - позитивных голов крупного рогатого скота (n= 34) черно-пестрой породы в возрасте старше четырех лет из пяти хозяйств Республики Татарстан. Индикацию генетического материала ВЛ КРС проводили с использованием разработанной ранее праймерной комбинацией к гену env (область р24) ВЛ КРС с соответствующим ей протоколом постановки ПЦР-РВ [6, 7] на амплификаторе CFX 96 («BioRad», США). Для получения ПЦР-ПДРФ фрагментов гена env ВЛ КРС использовали следующие эндонуклеазы рестрикции: PvuII, BamHI, BclI (Ksp221) (ООО «СибЭнзайм», Россия). Амплификацию исследуемого участка гена env проводили методом «гнездовой» ПЦР с применением «внешних» («env5032» + «env5608») и «внутренних» («env5099» + «env5521») праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции амплификацию ПЦР-продукта размером 444 п.н. (пар нуклеотидов). ПЦР-ПДРФ продукты разделяли электрофорезом в 1,8% агарозном геле (20 в/см, 50 мин) и детектировали на UV-трансиллюминаторе при длине волны ^=310 нм. Определение генотипической принадлежности представителей ВЛ КРС по гену env проводили на основе интерпретации ПЦР-ПДРФ фрагментов по D. Beier et al. (таблица 1) [4].
Таблица 1 - Env-ПЦР-ПДРФ фрагменты вируса лейкоза крупного рогатого скота (типизация по D. Beier et al., 2001)
Подгруппа ПЦР-продукт (п.н.) Длина сайтов рестрикции (п.н.)
BamHI PvuII BclI (Ksp22I)
Бельгийская 444 444 280/164 225/219
Австралийская 128/316 444 225/219
Японская 128/316 444 219/121/104
Гематологические показатели определяли в мазках крови, окрашенных по методу У.Б Лейшмана. Подсчет лейкоцитов проводили с использованием камеры для счета форменных элементов крови (Камера Горяева) (ООО "МиниМед", Россия). Для определения физиологической нормы исследуемых гематологических показателей использовали данные О.Н. Полозюк [8]. Статистическую обработку полученных в ходе выполнения работы цифровых данных проводили по общепринятым методикам с использованием стандартных программ Microsoft Office.
Результаты исследований. Выделенные в настоящее время и опубликованные в базе данных GenBank (NCBI) изоляты ВЛ КРС из Республики Татарстан классифицированны в генотипах - G4 (бельгийская подгруппа), G7 (австралийская подгруппа) и G8 (австралийская подгруппа).
В настоящем исследовании генотипирование изолятов ВЛ КРС (n=34), выделенных на территории Республики Татарстан, осуществляли с помощью ПДРФ-анализа. Для исследуемых изолятов № 1, 2, 3 ПДРФ-фрагменты локуса гена env провирусной ДНК представлены на рисунке 1.
Рисунок 1 - Электрофореграмма распределения продуктов рестрикции при ПЦР-ПДРФ анализе. Обозначения: М - ДНК маркер «1000/10C»; 1, 2, 3 - образцы ДНК длиной 444 п.н., после наработки целевого фрагмента методом «гнездовой» ПЦР
Бельгийская подгруппа
Австралппская подгруппа
Неилентифкикрова! подгруппа
1 PvuII BamHI Bell 2 PvuII BamHt Bell 3 PvuII BamHI Bell
(Ksp22!) (Ksp22l) (Ksp22l)
Полученный ампликон длиной 444 п.н. от изолята провируса ВЛ КРС № 1 при обработке эндо-нуклеазой рестрикции BamHI фрагментов не образует. Рестриктазы PvuII и BclI (Ksp22I) расщепляют исследуемый участок гена env на два фрагмента размерами 280/164 п.н, и на 225/319 п.н., соответственно. Аналогичные картины ожидаемых ПДРФ-фрагментов локуса гена env провирусной ДНК были получены для 23 исследуемых изолятов ВЛ КРС. Согласно классификации типов вируса лейкоза по D. Beier et а1 (таблица 1), данные образцы принадлежали бельгийской подгруппе. Исследуемый участок гена env длиной 444 п.н. от изолята № 2 при использовании эндонуклеазы рестрикции PvuII фрагментов не образует. Ферменты BamHI и BclI (Ksp22I) образовывали по два паттерна размерами 128/316 и 225/219 п.н., соответственно. Аналогичные картины ожидаемых ПДРФ-фрагментов локуса гена env провирусной ДНК были получены для семи исследуемых образцов ВЛ КРС. В соответствии с используемой стратегией типизации данные представители принадлежали к австралийской подгруппе вируса лейкоза. Также в ходе исследований нами были выявлены изоляты, которые невозможно было классифицировать ни по одной из подгрупп согласно представленной схеме (таблица 1). При ПДРФ анализе участка гена env длиной 444 п.н. от четырех изолятов в том числе и № 3 обнаружили следующие показатели длин ДНК после рестрикции: BamHI - 444 п.н., PvuII - 280/164 п.н., BclI - 444 п.н. Данные представители ВЛ КРС были объединены в одну подгруппу и обозначены нами как неидентифициро-ванная. Японской подгруппы обнаружено не было.
Таким образом, по результатам проведенного генотипирования было установлено распределение всех исследуемых образцов на три группы: 1 - бельгийская (п=24), 2 - неидентифицированная (п=4), 3 - австралийская (п=7). Гематологические показатели крови крупного рогатого скота в зависимости от заражения различными подгруппами приведены в таблице 2. Исследуемые показатели крови у крупного рогатого скота представлены в виде количественных показателей в среднем по каждой группе.
Таблица 2 - Гематологические показатели крови крупного рогатого в зависимости от заражения различными генотипами вируса лейкоза крупного рогатого скота
Показатели Фи- зиол.нор ма Группа 1 ср. знач ^т-max) Группа 2 ср. знач (тт-max) Группа 3 ср. знач (min-max)
Лейкоциты, 109/л 4-12 19,9 (14,5-23,7) 20,5 (18,7-22,2) 14,4 (13,2-16,2)
Лимфоциты, 109/л 45-75 85,12 (80-93) 95,3 (93-97) 83,4 (77-87)
ы юные, % 0-1 0,04 (0-1) 0,25 (0-1) 0
« -е о палочкоядерные, % 2-5 8 (3-15) 1.5 (0-3) 10 (7-15)
1 еН сегментоядерные, % 15-45 5 (0-11) 1,5 (1-2) 4,3 (0-6)
Эозинофилы, % 2-20 1,35 (0-5) 0,5 (0-1) 1,43 (0-4)
Базофилы, % 0-2 0,3 (0-2) 0 0,72 (0-2)
Моноциты, % 2-7 0,22 (0-3) 1 (0-2) 0,14 (0-1)
Лейкоциты абсолютное кол-во 16,9 (11,6-21,39) 19,5 (18,1-21,3) 11,9 (11,08-12,8)
Анализируя содержание в крови лейкоцитов, можно отметить, что данные показатели у коров всех групп находились выше физиологической нормы. По данным литературы, установлено, что лей-копеническим уровень крови считают при содержании в 1 мкл крови от 1 до 4 тыс. лейкоцитов; алей-кемическим - от 4 до 10 тыс.; сублейкемическим - от 10 до 40 тыс.; лейкемическим - свыше 40 тыс. [9]. Согласно данным, представленным выше, можно констатировать, что все исследуемые животные находились на сублейкемической стадии лейкозного процесса. Также в ходе исследований было выявлено, что по содержанию лейкоцитов животные 1 и 2 групп превосходят показатели 3 группы - на 38 и 42% соответственно. Высокий уровень лейкоцитов указывает на интенсивность течения патологического процесса.
В 1 и 3 группах обнаружено резкое увеличение количества палочкоядерных нейтрофиллов для 70 и 100% животных соответственно, тогда как во 2 группе в 90% случаев наблюдалось снижение по
сравнению с физиологической нормой. Повышение палочкоядерных нейтрофилов может указывать на наличие инфекционного процесса, а снижение на нарушение функционирования иммунной системы. Также выявлено понижение уровня сегментоядерных нейтрофиллов для всех исследуемых групп. Снижение сегментоядерных нейтрофилов может происходить в результате нарушения процесса созревания клеток.
Содержание базофилов у всех животных было практически одинаково и находилось в пределах физиологической нормы. В 78% случаев для 1, 100% - 2 и 86% - 3 групп количество эозинофилов находилось ниже предела нормы. Следует отметить, что показатели эозинофилов в крови животных 2 группы ниже данных 1 и 3 групп - на 62,8 и 64,8% соответственно. Однако уровень моноцитов у 2 группы выше, чем у 1 и 3 групп - на 79 и 86% соответственно. Эозинофиллы и моноциты участвуют в фагоцитозе, что позволяет организму бороться с чужеродными антигенами, исключая элементы патологической микрофлоры, а также злокачественные атипичные клетки.
Таким образом, анализ исследуемых гематологических показателей показал некоторые различия по составу крови у инфицированных различными подгруппами ВЛ КРС животных. Следует отметить, что определение гематологических изменений крови имеет важное значение как для понимания процессов, происходящих в организме животных, так и для разработки характерных методов терапии.
Заключение. С помощью ПДРФ-анализа для 34 изолятов вируса лейкоза крупного рогатого скота установили, распределение по трем группам: бельгийской, австралийской и неидентифициро-ванной. Результатами проведенных гематологических исследований установлено, что во всех группах оцениваемые клетки иммунной системы имели характерные для лейкоза отклонения от физиологической нормы. Однако следует отметить, что гематологические изменения у крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза бельгийской и неидентифицированной подгрупп показали на более выраженные нарушения функции кроветворения по сравнению с австралийской подгруппой. По данным литературы, также описывается, что генотип G4 (бельгийская подгруппа) может являться потенциально опасным для животноводства и создавать проблемы при проведении оздоровительных проти-волейкозных мероприятий за счет увеличения вирусной нагрузки, скорости перехода заболевания в гематологическую и терминальные стадии [5].
Список источников
1. Эпизоотическая ситуация в Российской Федерации 2022 год. ФГБУ ВНИИЗЖ АИЦ Управления ветнадзора г. Владимир. [Электронный ресурс]. - Режим доступа: URL: -https://fsvps.gov.ru/sites/default/files/files/iac/iac_epizooticheskaya_situaciya_v_rf_2022_god.pdf, свободный. - (дата обращения: 2.08.2023).
2. Мониторинг эпизоотической ситуации лейкоза крупного рогатого скота в Республике Татарстан с применением молекулярно-генетических и серологических методов диагностики / Р.И. Шангараев, [и др.] // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2023. № 1(219). С. 58-64.
3. Симонян Г.А. Особенности гематологического проявления лейкоза крупного рогатого скота // Труды Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. 2013. Т. 77. С. 160-166.
4. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA a DNA sequencing / D. Beier, [et al.] // P. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 2001. Vol. 114, No 7-8. P. 252-256.
5. Изучение генетической вариабельности выделенных изолятов вируса лейкоза крупного рогатого скота в Белгородской области / М.В. Петропавловский [и др.] // Аграрный вестник Урала. 2022. № S14. С. 33-43.
6. Горбунова М.Е. Разработка способа экспресс диагностики лейкоза крупного рогатого скота, основанного на обнаружении гена нуклеокапсидного белка р24 методом ПЦР в режиме реального времени // Ветеринарный врач. 2016. № 6. С. 3-7.
7. A new approach to the diagnosis of enzootic leukosis by genetic markers of bovine leukemia virus / M.E. Gorbunova [et al.] // Biointerface Research in Applied Chemistry. 2022. Vol. 12, No. 4. P. 4448-4462.
8. Полозюк О.Н., Ушакова Т.М. Гематология: учебное пособие / Донской ГАУ. Персиановский: Донской ГАУ, 2019. 159 с.
9. Симонян Г.А. Хисамутдинов Ф.Ф. Ветеринарная гематология. М: Колос, 1995. 256 с.
References
1. Epizootic situation in the Russian Federation 2022. FSBI VNIIZH AIC of the Veterinary Supervision Department of Vladimir. [electronic resource]. - Access mode: URL: - https://fsvps.gov.ru/sites/de-fault/files/files/iac/iac_epizooticheskaya_situaciya_v_rf_2022_god.pdf, free. - (date of application: 2.08.2023).
2. Monitoring of the epizootic situation of bovine leukemia in the Republic of Tatarstan using molecular genetic and serological diagnostic methods / R.I. Shangaraev [et al.] // Bulletin of the Altai State Agrarian university. 2023. No. 1 (219). Р. 58-64.
3. Simonyan G.A. Features of the hematological manifestation of bovine leukemia // Proceedings of the All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine. Ya.R. Kovalenko. 2013. T. 77. P. 160166.
4. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA a DNA sequencing / D. Beier [et al.] // P. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 2001. Vol. 114, No 7-8. P. 252-256.
5. Study of genetic diversity of bovine leukemia virus isolates obtained in the Belgorod region / M.V. Petro-pavlovsky [et al.] // Agrarian Bulletin of the Urals. 2022. No. S14. P. 33-43.
6. Gorbunova M.E. Development of a method of express diagnostics of bovine leukemia, based on the detection of p24 gene nucleocapsid protein by real-time pcr // Veterinarian. 2016. No. 6. P. 3-7.
7. A new approach to the diagnosis of enzootic leukosis by genetic markers of bovine leukemia virus / M.E. Gorbunova [et al.] // Biointerface Research in Applied Chemistry. 2022. Vol. 12, No. 4. P. 4448-4462.
8. Polozyuk O.N., Ushakova T.M. Hematology: textbook / Donskoy GAU. Persianovsk: Donskoy GAU, 2019.159 p.
9. Simonyan G.A., Khisamutdinov F.F. Veterinary hematology. M: Kolos, 1995. 256 p.
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с
написанием статьи.
All authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication.
The authors declare that there is no conflict of interest.
Принята к публикации / accepted for publication 18.10.2023;
© Горбунова М.Е., Шангараев Р.И., Додонова Е.А., Хаммадов Н.И., Усольцев К.В. 2024
