CC BY
113
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 578.828.17:578.52].083.2
Вафин Р.Р.1'2, Хазипов Н.З.1, Шаева А.Ю.1, Закирова З.Р.1, Зайнуллин Л.И.2, Тюлькин С.В.3,
Абдулина И.Р.2'3, Алимов А.М.1
генотипическая идентификация вируса бычьего лейкоэа
1ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» Минсельхозпрода РФ, 420074, Казань; 2ФГАОУ «ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет» Минобрнауки РФ, 420008, Казань; 3ФГБУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория» Россельхознадзора РФ, 420087, Казань
На основании филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса env-гена провируса BLV и разработанной нами стратегии ПЦР-ПДРФ-генотипирования, согласующейся с филогенетической классификацией возбудителя, установлена таксономическая принадлежность изолятов ВБЛ, выявленных у крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан Российской Федерации, идентифицированных как представители 4-го, 7-го и 8-го генотипов BLV Из 100 идентифицированных изолятов 64 относились к 4-му генотипу, 28 представителей BLV принадлежали кластеру 7-го генотипа, а остальные 8 исследованных образцов провируса характеризовались признаком нового, недавно обоснованного 8-го генотипа возбудителя. Предложенная нами стратегия ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВБЛ с использованием пяти подобранных эндонуклеаз рестрикций (PvuII, SspI, HphI, HaeIII и BstYI) обеспечила корректную процедуру генотипической идентификации изучаемого вирусного патогена. Ключевые слова: BLV; генотип; идентификация; секве-нирование; филогенетический анализ; ПЦР; ПДРФ.
Лейкоз крупного рогатого скота - опухолевое заболевание инфекционной природы, возбудителем которого является вид Bovine leukemia virus (аббр. - BLV; вирус бычьего лейкоза, сокращ. ВБЛ) рода Deltaret-rovirus семейства Retroviridae, согласно международной вирусной таксономии [6]. Развитию заболевания предшествуют хроническое инфицирование этим вирусом (ВБЛ-инфекция) и устойчивый лейкоцитоз.
Современная оценка генетического разнообразия ВБЛ на основе секвенирования и филогенетического анализа информативного маркерного локуса env-гена с интерпретацией генотипических кластеров построенных дендрограмм [1-3, 8-10], является наиболее действенным подходом к геноидентификации BLV, нежели предложенные ранее стратегии генотипиро-вания на основе полиморфизма длины рестрикци-онных фрагментов, выстроенные исключительно на принципе интерпретации генерируемых env-ПЦР-ПДРФ-профилей [4, 5, 7].
Нынешняя филогенетическая классификация ВБЛ предусматривает наличие 8 генотипов, 7 из которых впервые были описаны в работе S.M. Rodriguez и соавт. [9], а восьмой генотип - в нашей ранней публикации 2011 г. [1], с независимым подтверждением существования нового (8-го) генотипа BLV в статьях зарубежных и отечественных исследователей, чьи оригинальные работы по частичному секвенирова-нию геномов BLV и дальнейшему генотипированию этого вируса также являются приоритетными [3, 10].
Основной задачей исследования являлось установление генотипической принадлежности изолятов BLV, циркулирующих в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан Российской Федерации (РФ), на основе филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса env-гена провируса BLV, с апробацией разработанной нами стратегии ПЦР-ПДРФ-генотипирования, согласующейся с филогенетической классификацией возбудителя.
Материалы и методы
Молекулярно-генетическому исследованию было подвергнуто 100 проб крови BLV-позитивных коров сельхозпредприятий 16 районов Республики Татарстан РФ на предмет идентификации выявленных представителей BLV, как на основе филогенетического анализа секвенированных последовательностей локу-са env-гена возбудителя, так и ПЦР-ПДРФ-генотипирования.
Экстракция тотальной ДНК из цельной крови крупного рогатого скота осуществлена с помощью коммерческого набора «ДНК-сорб Б» согласно инструкции производителя (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ).
При постановке ПЦР с выделенными образцами провирус-ной ДНК BLV использовали модификацию «nested» ПЦР с применением «внешних» («env5032» и «env5608») и «внутренних» («env5099» и «env5521») праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции амплификацию фрагмента env-гена BLV длиной 444 п.о. [4, 5, 7].
Секвенирование продуктов амплификации локуса env-гена выявленных изолятов провируса BLV выполнено на генетическом анализаторе «ABI PRISM 3100» («Applied. Biosystems», США) в НПК «Синтол» (Россия) с использованием праймеров «env5099» и «env5521» в качестве сиквенсных.
Секвенированные последовательности локуса env-гена изолятов провируса BLV были выравнены по длине 400 нуклео-тидов c соответствующими опубликованными в GenBank ну-клеотидными последовательностями известных представителей BLV, используя программы BLAST и MEGA-4 с последующим филогенетическим анализом.
Номера доступа (Accession Number, A/N) депонированных в GenBank NCBI в 2013 г. нуклеотидных последовательностей локуса env-гена изолятов провируса BLV, выявленных у крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан: KC867136-KC867150, KC886607-KC886634.
Эндонуклеазы рестрикции, подобранные для ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV в соответствии с филогенетической классификацией: PvuII, SspI, HphI (изошизомер ^suHPI), HaeIII, BstYI (изошизомер BstX2I).
ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0.
Детекция результатов ПЦР- и ПЦР-ПДРФ-анализа выполнена методом горизонтального электрофореза в 2,5% агарозном геле в буфере TBE (рН 8,0), содержащем этидий бромид, с последующей визуализацией результатов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (X 310 нм). Размеры фрагментов ДНК оценены по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.
В работе использованы реактивы для молекулярно-биоло-гических исследований производства ООО «СибЭнзим» (Россия).
Результаты и обсуждение
В результате сравнительного филогенетического анализа выравненных нуклеотидных последовательностей локуса env-гена изолятов провируса BLV, выявленных у крупного рогатого скота при ВБЛ-инфекции в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан РФ, установлена их генотипическая принадлежность. Так, из 100 идентифицированных изолятов 64 относились к 4-му генотипу BLV, 28 представителей BLV принадлежали кластеру 7-го генотипа, а остальные 8 исследованных образцов провируса характеризовались признаком нового, недавно обоснованного 8-го генотипа возбудителя.
Рис. 1. Филограмма типовых представителей известных генотипов BLV (env-ген) [MEGA-4: алгоритм NJ, 400 nt, 89 seq.] Черный круг - депонированные в GenBank NCBI в 2013 г. нуклеотидные последовательности локуса env-гена изолятов провируса BLV, выявленных у крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан РФ; черный квадрат -ранее депонированные последовательности.
Следует отметить, что из 100 секвени-рованных образцов в GenBank NCBI были депонированы только 43 уникальные последовательности локуса env-reна BLV, результат генотипической идентификации которых на основе филогенетической классификации отражен на построенной филограмме (рис. 1).
Дополнительно, по результатам анализа гетерогенности представителей BLV по env-гену проведена оценка внутри- и межгенотипической гетерогенности известных генотипов BLV, данные которой представлены в обобщенной табл. 1.
В процессе же изучения внутри- и межгенотипической гетерогенности BLV по env-гену установлено, что исключительно «гетерогенный» критерий оценки генетического разнообразия представителей BLV в контексте определения их таксономической принадлежности на уровне генотипирования не пригоден из-за отсутствия четкого алгоритма идентификации, так как диапазон значений внутригено-типической гетерогенности, выраженный через процентное отношение, не разграничивает интервал значений межгеноти-пической гетерогенности (см. табл. 1).
Также при сравнительной оценке 422 нуклеотидных последовательностей локу-са env-гена представителей BLV на предмет их классификации в зависимости от выбранной стратегии идентификации установлено, что известные ранее способы типизации BLV, разработанные на основе ПЦР-ПДРФ-анализа [4, 5, 7], не согласуются с новым подходом к оценке генотипиче-ского разнообразия ВБЛ на основе филогенетического анализа еот-гена возбудителя.
Подобная несогласованность отражена в табл. 2.
Так, изоляты BLV, идентифицированные по стратегии D. Beier и соавт. [4] как представители австралийской подгруппы, по филогенетической классификации могут принадлежать к 1, 3, 6, 7 или 8-му генотипам; а японской подгруппы - к 1, 6 или 7-му генотипам ВБЛ (табл. 2).
Кроме того, для данной стратегии типизации [4] выявлено дополнительно 9 уникальных комбинаций ПЦР-ПДРФ-профилей, условно тождественных 9 неклассифицированным подгруппам BLV (см. табл. 2).
Руководствуясь принципом совершенствования стратегии ПЦР-ПДРФ-ге-нотипирования, согласующейся с филогенетической классификацией изоля-тов BLV, в ходе системного анализа рестрикционных картирований локуса env-гена известных представителей BLV, нами были предложены новые условия идентификации по 5 эндонуклеазам рестрикции (РтоП, SspI, НрМ, НаеШ и BstYl).
Таблица 1
Внутри- и межгенотипическая гетерогенность представителей BLV по env-гену (отношение в %)
Филогенетическая классификация BLV
Генотип 1-й 2-й 3-й 4-й 5-й 6-й 7-й 8-й
1-й 0-5 3-6 3-7 3-7 3-7 3-6 3-8 2-6
2-й 3-6 0-1 3-4 2-4 4-5 3 3-5 2-4
3-й 3-7 3-4 0-2 3-5 4-5 3-4 3-6 3-4
4-й 3-7 2-4 3-5 0-3 3-5 2-4 2-5 2-4
5-й 3-7 4-5 4-5 3-5 0-2 4-5 3-5 4-5
6-й 3-6 3 3-4 2-4 4-5 0-2 3-5 2-4
7-й 3-8 3-5 3-6 2-5 3-5 3-5 0-4 2-5
8-й 2-6 2-4 3-4 2-4 4-5 2-4 2-5 0-2
Таблица 2
.Env-ПЦР-ЦДРФ-профили BLV (типизация по D. Beier и соавт. [4])
ПЦР-ПДРФ-типирование BLV ПЦР-продукт, п. н. ПДРФ-фрагменты, п. о. Генотип N
PvuII BamHI BclI 1-й 2-й 3-й 4-й 5-й 6-й 7-й 8-й
Подгруппа
Бельгийская 444 280/164 444 225/219 - -- 142 - - -- 142
Австралийская 444 444 316/128 225/219 54 - 4 - - 9 70 21 158
Японская 444 444 316/128 219/121/104 8 -- - - 6 1- 15
? 444 444 444 225/219 43 -- 1 - - 2 - 46
? 444 444 316/128 444 1 -- - - - 2 - 3
? 444 444 316/128 225/191/28 1 -- - - - -- 1
? 444 280/164 316/128 225/219 - 36 - - 10 - 3- 49
? 444 280/164 316/128 444 - 1- - - - -- 1
? 444 280/164 316/128 219/189/36 - - - 1 - -- 1
444 280/164 444 444 - -- 1 - - -- 1
? 444 208/164 253/191 225/219 - -- 1 - - -- 1
? 444 280/164 444 219/121/104 - - - 4 - -
Примечание. N - количество проанализированных представителей BLV с соответствующим ПЦР-ПДРФ-профилем; ? - неклассифицированный таксон BLV.
Рис. 2. Электрофореграмма ПЦР-ПДРФ-профилей изолятов провируса BLV «N067», «N006» и «N142» (предложенная стратегия
генотипирования BLV).
Примечание. 1, 7, 13 - ДНК-маркеры 100 п. о. + 50 п. о. (СибЭнзим); 2—6 - ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса BLV «N067» (К41, 7-й генотип): 2 - PvuII-ПДРФ (444 п. о.); 3 - SspI-ПДРФ (444 п. о.); 4 - HphI-ПДРФ (224/137/44/39 п. о.); 5 - HaeIII-ПДРФ (198/94/87/32/27/6 п. о.); 6 - BsfFI-ПДРФ (316/128 п. о.); 8-12 - ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса BLV «N006» (К43, 8-й генотип): 8 - PvuII-ПДРФ (444 п.о.); 9 - SspI-ПДРФ (399/45 п. о.); 10 - HphI-ПДРФ (224/220 п. о.); 11 - HaeIII-ПДРФ (225/94/87/32/6 п. о.); 12 - BsfFI-ПДРФ (198/128/118 п. о.); 14-18 - ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса BLV «N142» (К44, 8-й генотип): 14 - PvuII-ПДРФ (444 п. о.); 15 - SspI-ПДРФ (399/45 п. о.); 16 - HphI-ПДРФ (224/220 п. о.); 17 - HaeIII-ПДРФ (225/94/87/32/6 п. о.); 18 - BsfFI-ПДРФ (316/128 п. о.).
Таблица 3
Стратегия ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV в соответствии с филогенетической классификацией
Гено- Изолят GenBank ПЦР- ПДРФ-фрагменты (bp) K N
тип A/N продукт (bp) PvuII SspI HphI HaeIII BstYI
1 AL-63 FJ808571 444 444 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 198/128/118 1 53
1 Cow 527 AF007764 444 444 399/45 224/220 285/94/32/27/6 198/128/118 2 8
1 23 U87873 444 444 399/45 224/220 312/94/32/6 198/128/118 3 1
1 AL-2106 FJ808578 444 444 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 246/198 4 42
1 UruC06II FM955558 444 444 399/45 224/220 285/94/32/27/6 246/198 5 1
1 VdM M35239 444 444 399/45 224/181/39 198/94/87/32/27/6 316/128 6 1
1 Kurdistan EU266062 444 444 399/45 220/196/28 198/119/94/27/6 198/128/118 7 1
2 AL-164 FJ808574 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 198/128/118 8 34
2 PL-4960 FJ808590 444 280/164 399/45 224/220 198/87/49/45/32/27/6 198/128/118 9 1
2 ARGSF8 AF485773 444 280/164 399/45 444 198/94/87/32/27/6 198/128/118 10 1
2 AL-1453 FJ808577 444 280/164 444 224/220 198/94/87/32/27/6 198/128/118 11 1
3 USCA-1 EF065647 444 444 399/45 444 285/94/32/21/6/6 198/128/96/22 12 1
3 USCA-2 EF065648 444 444 399/45 444 285/94/32/27/6 198/128/96/22 13 2
3 JPFU EF065650 444 444 399/45 444 285/94/32/27/6 198/128/118 14 1
4 BG EF065638 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 115
4 3 U87872 444 444 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 16 1
4 1S-c16 JQ353652 444 280/164 399/45 444 198/94/87/32/27/6 444 17 16
4 N023 KC867149 444 280.164 399.45 224.220 198/94/87/32/27/6 253/191 18 1
4 1_BY HQ902258 444 280/164 444 224/220 198/94/87/32/27/6 444 19 7
4 N034 KC886611 444 280/164 399/45 224/220 198/121/87/32/6 444 20 1
4 1S-c9 JQ353640 444 280/164 399/45 224/220 198/119/94/27/6 444 21 1
4 NK11 JQ686117 444 280/164 399/45 224/220 285/94/32/27/6 444 22 6
4 1S-c10 JQ353650 444 280/164 399/45 220/145/79 198/94/87/32/27/6 444 23 1
5 CRAS-1 EF065635 444 280/164 399/45 224/181/39 198/94/87/32/27/6 316/128 24 8
5 CRGC EF065639 444 280/164 399/45 224/181/39 285/94/32/27/6 316/128 25 1
5 CRLC-1 EF065655 444 280/164 444 224/181/39 198/94/87/32/27/6 316/128 26 2
6 PL-1238 FJ808582 444 444 399/45 224/220 285/94/32/27/6 316/128 27 7
6 151 AY185360 444 444 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 316/128 28 8
7 N28 HM102356 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 294/128/22 29 7
7 176 AY515276 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 30 53
7 I2 S83530 444 444 444 224/220 285/94/32/27/6 316/128 31 1
7 14 AY515274 444 444 444 145/137/83/79 198/94/87/32/27/6 316/128 32 1
7 30 DQ059417 444 444 444 444 198/87/49/45/32/27/6 316/128 33 1
7 3S JF720351 444 280/164 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 34 3
7 4T-c19 JQ353655 444 444 399/45 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 35 3
7 1S-c4 JQ353651 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/79/49 36 1
7 NK17 JQ686120 444 444 444 224/137/83 198/87/49/45/32/27/6 316/128 37 2
7 4S JF720352 444 444 444 224/137/83 198/119/94/27/6 316/128 38 1
7 1S-c6 JQ353633 444 444 444 224/137/83 198/121/87/32/6 316/128 39 1
7 4T-c11 JQ353656 444 444 444 224/137/83 285/94/32/27/6 316/128 40 1
7 N067 KC886618 444 444 444 224/137/44/39 198/94/87/32/27/6 316/128 41 1
7 1S-c1 JQ353649 444 444 444 224/220 198/94/87/32/27/6 444 42 2
8 M1/ELG_Cro/08 GU724606 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 198/128/118 43 13
8 N174 JF713455 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 316/128 44 4
8 ELG_Cro/VRA/09 JN990072 444 444 444 224/220 225/94/87/32/6 198/128/118 45 2
8 4-6 HM563764 444 444 399/45 224/137/83 225/94/87/32/6 198/128/118 46 1
8 MKC2137 JQ675759 444 444 399/45 444 225/94/87/32/6 198/128/118 47 1
Примечание. Здесь и в табл. 4: К - комбинация; N - количество проанализированных изолятов с соответствующей комбинацией ПЦР-ПДРФ-профилей.
Таблица 4
Стратегия ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV в соответствии с филогенетической классификацией
Гено- Изолят GenBank ПЦР- ПДРФ-фрагменты (п. о.) К Идентичные изоляты
тип Д/Ы продукт (п. н.) РуиП SspI HphI НаеШ BstYI
4 N097 КС886628 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15
4 N025 КС867150 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N026, N096
4 N069 КС886619 444 280.164 399.45 224.220 198/94/87/32/27/6 444 15 N072
4 N001 КС867136 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15
4 N002 КС867137 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N004
4 N007 КС867141 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15
4 N018 КС867145 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15
4 N019 КС867146 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15
4 N022 КС867148 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15
4 N027 КС886607 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N033
4 N031 КС886610 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N028
4 N050 КС886613 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N053, N056
4 N054 КС886614 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15
4 N074 КС886620 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N075
4 N078 КС886621 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N079, N080
4 N082 КС886622 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15
4 N084 КС886623 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N086, N087
4 N090 КС886625 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N110, N111, N113, N114, N124
4 N092 КС886626 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N095
4 N094 КС886627 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15
4 N100 КС886630 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15
4 N122 КС886632 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15
4 N123 КС886633 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15
4 N015 КС867143 444 280/164 399/45 444 198/94/87/32/26/6 444 17 N016
4 N062 КС886615 444 280/164 399/45 444 198/94/87/32/26/6 444 17 Ш27-Ш32, N136-N140, N134
4 N023 КС867149 444 280.164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 253/191 18
4 N029 КС886608 444 280/164 444 224/220 198/94/87/32/27/6 444 19 N083, N085, N091
4 N030 КС886609 444 280/164 444 224/220 198/94/87/32/27/6 444 19
4 N034 КС886611 444 280/164 399/45 224/220 198/121/87/32/6 444 20
7 N013 КС867142 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 294/128/22 29 N014, N057, N058, N060, N061
7 N035 КС886612 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 30 N064, N081, N108, N116, N118, N120, N125, N133
7 N003 КС867138 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 30 N008
7 N005 КС867139 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 30
7 N017 КС867144 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 30
7 N021 КС867147 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 30
7 N066 КС886617 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 30
7 N099 КС886629 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 30 N101, N102, N104-N106
7 N067 КС886618 444 444 444 224/137/44/39 198/94/87/32/27/6 316/128 41
8 N063 КС886616 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 198/128/118 43 N068
8 N006 КС867140 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 198/128/118 43 N009
8 N089 КС886624 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 198/128/118 43
8 N121 КС886631 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 316/128 44
8 N142 КС886634 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 316/128 44
8 N174 JF713455 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 316/128 N174
Информация с интерпретацией полученных ет>-ПЦР-ПДрФ-профилей 422 проанализированных представителей BLV, фактически отражающей стратегию ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV в соответствии с филогенетической классификацией возбудителя, представлена в табл.3.
Так, 1-й генотип BLV характеризуется наличием 7 комбинаций еяу-ПЦР-ПДРФ-профилей (К1-7), 2-й генотип - 4 комбинаций (К8-11), 3-й генотип - наличием 3 комбинаций (К12-14); 4-й генотип - 9 комбинаций (К15-23); 5-й генотип - 3 комбинаций (К24-26); 6-й генотип - 2 комбинаций (К27-28), 7-й генотип - 14 комбинаций (К29-42) и 8-й генотип BLV - 5 комбинаций (К43-47) еяу-ПЦР-ПДРФ-профилей BLV (см. табл. 3).
Причем 25 из 47 установленных комбинаций ет>-ПЦР-ПДРФ-профилей представлены единственными нуклеотидными последовательностями локуса ет>-гена изолятов BLV, депонированными в Ое^апк КС-BI на данный момент, в числе которых и выявленные нами изоляты: N023 (К18, 4-й генотип), N034 (К20, 4-й генотип) и N067 (К41, 7-й генотип) соответственно (см. табл. 3).
Следует подчеркнуть, что недавно выявленный 8-й генотип ВБЛ может быть успешно идентифицирован даже с использованием одной единственной ре-стриктазы ИаеШ, генерирующей ПДРФ-фрагменты (225/94/87/32/6 Ьр), характерные только для этих представителей. А с применением двух ферментов могут быть определены представители 2-го (РгаП и BstYI), 3-го (ИрИ1 и ИаеШ) и 5-го генотипов (РуиП и ИрМ) BLV (см. табл. 3).
Пример реализации стратегии ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV, согласующейся с филогенетической классификацией данного возбудителя, представлен на рис. 2.
Сводная информация по генотипической идентификации 100 выявленных на территории Республики Татарстан РФ изолятов ВБЛ отражена в табл. 4.
Диагностика лейкоза крупного рогатого скота в контексте изучения генетического разнообразия его этиологического агента весьма актуальна, учитывая факт невозможности типирования возбудителя серологическими методами, и принимая во внимание аргументы в пользу существования представителей BLV, возможно, не выявляемых иммунологическими тестами в силу своей генетической природы, с перспективой установления возможной связи генотипа вируса с его серологической специфичностью и развитием клинического лейкоза в будущем.
Таким образом, установлено, что в популяциях крупного рогатого скота на территории Республики Татарстан циркулируют изоляты BLV, идентифицированные на основе интерпретации результатов филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса еяу-гена как представители 4, 7-го и нового, недавно обоснованного 8-го генотипов BLV, соответственно.
По результатам сравнительной оценки 422 нуклео-тидных последовательностей локуса еяу-гена представителей BLV на предмет их классификации в зависимости от выбранной стратегии идентификации установлено, что известные ранее способы типизации BLV, разработанные на основе ПЦР-ПДРФ-анализа, не
согласуются с позднее предложенной филогенетической классификацией данного инфекционного агента.
Предложенная нами стратегия ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV с подобранными условиями идентификации 8 генотипов BLV по 5 эндонуклеазам рестрикции (PvuII, SspI, HphI, HaeIII и BstYI) согласована с современным подходом к оценке его геноти-пического разнообразия, основанным на филогенетическом анализе env-гена возбудителя.
БЛАГОДАРНОСТИ: работа выполнена при финансовой поддержке Академии наук Республики Татарстан в рамках реализации государственного контракта №13-32/2013 (Г) на выполнение научно-исследовательской работы по молодежным грантам; за счет средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров.
Сведения об авторах:
Вафин Рамиль Ришадович - д-р биол.наук, научный консультант ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» Минсельхозпрода РФ, 420074, Казань, e-mail: vafin-ramil@mail.ru
Хазипов Нариман Залилович - д-р вет.наук, проф. каф. биол.и неорг.химии; e-mail: nariman.xazipov@ mail.ru
Шаева Айгуль Юсуповна - канд.биол.наук; e-mail: a-shaeva@mail.ru
Закирова Зухра Рустамовна -- аспирант; e-mail: zuhr89@mail.ru
Зайнуллин Ленар Ильзизарович - канд.биол.наук, доц. каф. биохимии и биотехнологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета; e-mail: lenarilgizayn@mail.ru
Тюлькин Сергей Владимирович - канд.с/х наук, зав. отд. вирусологии и генно-молекулярной диагностики ФГБУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория» Россельхознадзора РФ; e-mail: tulsv@mail.ru
Абдулина Индира Рамильевна- микробиолог; e-mail: indira-abdulina87@yandex.ru
Алимов Азат Миргасимович - д-р вет.наук, проф. каф.биол. и неорг.химии Каз. академии вет.медицины; e-mail: study@ksavm.senet.ru
ЛИТЕ РА Т У РА/REFERENCES
1. Шаева А.Ю., Вафин Р.Р., Хазипов Н.З., Камалов Б.В., Алимов А.М., Тагиров М.Ш. Генотипическая идентификация изолятов ВЛКРС, выявленных в хозяйствах Республика Татарстан. Ученые записки КГАВМ. 2011; 208: 330-7.
Shaeva A.Yu., Vafin R.R., Khazipov N.Z., Kamalov B.V., Alimov A.M., Tagirov M.Sh. Genotypic identification of BLV isolates detected in livestock farms of the Republic of Tatarstan. Uchenye zapiski KGAVM. 2011; 208: 330-7. (in Russian)
2. Шаева А.Ю., Гараева З.Р., Вафин Р.Р., Хазипов Н.З., Алимов А.М. Идентификация нового генотипа ВЛКРС. Ученые записка КГАВМ. 2012; 211: 192-7.
Shaeva A.Yu., Garaeva Z.R., Vafin R.R., Khazipov N.Z., Alimov A.M. Identification of a new BLV genotype. Uchenye zapiski KGAVM. 2012; 211: 192-197 (in Russian).
3. Balic D., Lojkic I., Periskic M., Bedekovic T., Jungic A., Lemo N. et al. Identification of a new genotype of bovine leukemia virus. Arch. Virol. 2012; 157 (7): 1281-90.
4. Beier D., Blankenstein P., Marquardt O., Kuzmak J. Identification of
different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA and DNA sequencing Berl. Munch Tierarztl Wochenschr. 2001; 114 (7-8): 252-6.
5. Fechner H., Blankenstein P., Looman A.C., Elwert J., Geue L., Albrecht C. et al. Provirus variants of the bovine leukemia virus and their relation to the serological status of naturally infected cattle. Virology. 1997; 237 (2): 261-9.
6. King A.M.Q., Adams J., Carstens E.B., Lefkowitz E.J. Virus Taxonomy: classification and nomenclature of viruses: Ninth Report of the ICTV. Amsterdam: Elsevier, Academic Press; 2012.
7. Licursi M., Inoshima Y., Wu D., Yokoyama T., González E.T., Sent-sui H. Genetic heterogeneity among bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts. Virus Res. 2002; 86 (1-2): 101-10.
8. Moratorio G., Obal G., Dubra A., Correa A., Bianchi S., Buschiazzo A. et al. Phylogenetic analysis of bovine leukemia viruses isolated in South America reveals diversification in seven distinct genotypes. Arch. Virol. 2010; 155 (4): 481-9.
9. Rodriguez S.M., Golemba M.D., Campos R.H., Trono K.., Jones L.R. Bovine leukemia virus can be classified into seven genotypes: evidence for the existence of two novel clades. J. Gen. Virol. 2009; 90 (11): 2788-97.
10. Rola-Luszczak M., Pluta A., Olech M., Donnik I., Petropavlovskiy M., Gerilovych A. et al. The molecular characterization of bovine leukaemia virus isolates from Eastern Europe and Siberia and its impaction phylogeny. PLoS One. 2013; 8 (3). Available at: http:// dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0058705
Поступила 12.11.13 Received 12.11.13
GENOTYPIC IDENTIFICATION OF THE BOVINE LEUKEMIA VIRUS
R. R. Vafin1-2, N. Z. Khazipov1, A. Y. Shaeva1, Z. R. Zakirova1, L. I. Zaynullin2, S. V. Tyulkin3,I. R. Abdulina2,3, A. M. Alimov1 1Kazan State Academy of Veterinary Medicine, Ministry of Agriculture of the Russian Federation, Kazan, Russia; 2Kazan
Federal University, Ministry of Education and Science of the Russian Federation, Kazan, Russia; 3Tatar Trans-regional Veterinarian Laboratory, Federal Service for Veterinary and Phytosanitary Surveillance, Kazan, Russia
Phylogenetic analysis of the sequenced segments of the provirus BLV locus env-gene and the strategy of the PCR-PDRF-genotyping consistent with phylogenetic classification of pathogenic agent and suggested in our works provided taxonomic identification of BLV isolates identified in cattle in Tatarstan (Russian Federation) as representatives of the 4th, 7th, and 8th BLV genotypes. Of 100 identified isolates, 64 represent the 4th BLV genotype, 28 representatives of BLV belong to cluster of the 7th genotype, whereas the other 8 samples of the provirus belong to the new 8th genotype of pathologic agent. The strategy VBL PCR-PDRF-genotyping suggested in our work on the basis of 5 restriction endonucleases (PvuII, SspI, HphI, HaeIII, and BstYI) provided correct genotyping identification of the viral pathogen.
Key words: BLV, genotype, identification, sequencing, phylogenetic analysis, PCR, PDRF
В 2014 г. отметили юбилеи члены редакционной коллегии журнала профессор Вадим Израилевич Агол и профессор Владимир Наумович Гершанович!
Поздравляем юбиляров и желаем им здоровья и новых научных побед!
алфавитный указатель статей, опубликованных в журнале
«молекулярная генетика, микробиология и вирусология» в 2014 г.
обзоры
Давыдова Д.Ю., Зигангирова Н.А. Протеасомный белок Chlamydia trachomatis как один из основных факторов патогенности возбудителя. № 2, стр. 3-8.
Тиганова И.Г., Ильина Т.С., Романова Ю.М. Двухкомпо-нентные системы регуляции бактерий - мишени для поиска новых антибактериальных препаратов. № 3, стр. 3-12.
Федорова Е.А., Киселева И.В., Auewarakul P., Suptawiwat O., Руденко Л.Г. Оптимизация кодонного состава ге-магглютинина как перспективный способ повышения иммуногенности гриппозных вакцин. № 4, стр. 3-9
экспериментальные статьи
Антоненко П.Б., КресюнВ.И. Полиморфизм гена биотрансформации цитохрома-450 2С9 у больных туберкулезом. № 3, стр. 18-22.
Aфaнacьев M.B., Кравец E.B., Дугаржапова З.Ф., Такайш-вили B.E., Половинкина B.C., Балахонов C.B. Сравнительный мультилокусный VNTR- и SNP-анализ вакцинных штаммов Bacillus anthracis. № 2, стр. 36-40.
Aфaнacьев M.B., Миронова Л.B., Басов E.A., Остяк A.C., Куликалова E.C., Урбанович Л.Я., Балахонов C.B. MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ в ускоренной идентификации микроорганизмов рода Vibrio. № 3, стр. 22-29.
Булгаков A.Д., Гребенникова T.B., Южаков A.F., Aлunер Т.И., Непоклонов E.A. Молекулярно-генетический анализ геномов вирусов респираторно-репродуктивного синдрома свиней и цирковируса 2-го типа, циркулирующих на территории Российской Федерации. № 4, стр.
Быстрицкая Е.П., Cтенковa A.M., Портнягина О.Ю., Ра-кин A.B., Рассказов B.A., Исаева М.П. Регуляция экспрессии главного порина yersinia pseudotuberculosis в условиях антибиотикового стресса. № 2, Стр. 1Т-21.
