CC BY
63
УДК: 619:57.065:578.828
ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВОГО ГЕНОТИПА ВЛКРС
Шаева А.Ю. - м.н.с.;Гараева З.Р. - аспирант; *Вафин Р.Р. - науч.консультант;
Хазипов Н.З. - д.в.н., профессор; Алимов А.М. - д.в.н., профессор, зав. кафедрой
ЦНИЛ ФГБОУ ВПО КГАВМ, e-mail: ajjgul-shaeva@rambler.ru
*ГНУ «ТатНИИСХ РАСХН»
Ключевые слова: ВЛКРС, генотип, идентификация, ПЦР, ПДРФ, филогенетический анализ.
Key words: BLV, genotype, identification, PCR, RFLP,
phylogenetic analysis.
Введение. Лейкоз крупного рогатого скота - инфекционная болезнь опухолевой природы, этиологическим агентом которой является одноименный вирус (ВЛКРС, англ. Bovine leukemia virus, BLV), относящийся к роду Deltaretrovirus семейства Retroviridae [2, 3, 4, 5, 6. 7].
Современный подход оценки генотипического разнообразия ВЛКРС на основе филогенетического анализа локуса env-гена возбудителя является более информативным инструментом идентификации генотипов [6, 7], нежели предложенные ранее стратегии типизации, основанные на интерпретации генерируемых env-ПЦР-ПДРФ-профилей [3, 4, 5].
Дальнейшее же развитие таксономической классификации BLV и совершенствование способов генотипической идентификации напрямую связано с получением новых знаний о генетическом многообразии возбудителя по мере выявления оригинальных изолятов ВЛКРС [1, 2].
Материалы и методы. При постановке ПЦР с выделенными образцами провирусной ДНК BLV использовалась модификация «nested» ПЦР с применением внешних (env5032+env5608) и внутренних (env5099+env5521) праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции амплификацию фрагмента env-гена ВЛКРС длиной 444 п.н. [1, 3].
Секвенирование продуктов амплификации локуса env-гена выявленных изолятов провируса ВЛКРС «N10», «N28», «N72» и «N174» выполнено на приборе ABI-300 в лабораториях НПО «СибЭнзим» с использованием праймеров «env5099» и «env5521» в качестве сиквенсных олигонуклеотидов.
Секвенированные последовательности локуса env-гена изолятов BLV «N10» (GenBank A/N: HM102355), «N28» (GenBank A/N: HM102356), «N72» (GenBank A/N: JF683619) и «N174» (GenBank A/N: JF713455) были выравнены по длине 400 нуклеотидов c соответствующими опубликованными в GenBank нуклеотидными последовательностями известных представителей BLV, используя программы BLAST и MEGA-4 с последующим филогенетическим анализом.
Эндонуклеазы рестрикции, подобранные для ПЦР-ПДРФ-
генотипирования ВЛКРС в соответствии с филогенетической классификацией: PvuII, SspI, HphI, HaeIII, BstYI.
ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0.
ПЦР-ПДРФ-продукты разгоняли в 2,5% агарозном геле (20 В/см, 40 мин) и визуализировали в УФ-трансиллюминаторе (Х=310 нм).
Результаты исследования и их обсуждение. Согласно результатам филогенетического анализа выравненных нуклеотидных
последовательностей локуса env-гена типовых представителей известных генотипов ВЛКРС было установлено, что изолят «N28», выявленный в Спасском районе Республики Татарстан, принадлежал к кластеру 7-го генотипа, а изоляты «N10» и «N72», выявленные соответственно в Мензелинском и Дрожжановском районах Республики Татарстан, относились к 4-му генотипу BLV.
Еще один изолят «N174», выявленный также в Дрожжановском районе Республики Татарстан, характеризовался признаком нового, ранее не обоснованного генотипа ВЛКРС, обозначенного нами «8-й генотип», ввиду формирования на выстраиваемой дендрограмме автономного генотипического кластера, в который также входили, на момент обоснования нами нового генотипа BLV [1], близкородственные изоляты, выявленные в Украине [«4-1» (GenBank A/N: HM563766); «3-41» (GenBank A/N: HM563767]) и Хорватии [«M1/ELG_Cro/08» (GenBank A/N:
GU724606)], соответственно.
Необходимо отметить, что чуть позже выхода нашей предыдущей статьи [1] с обоснованием 8-го генотипа BLV, в другой научной публикации [2] уже хорватских исследователей был отражен результат сравнительного филогенетического анализа выявленных в Хорватии изолятов ВЛКРС, также подтверждающий факт наличия нового генотипа в таксономической классификации BLV.
В настоящей же работе нами представлена дендрограмма типовых представителей известных генотипов ВЛКРС с включением в филогенетическое дерево всех депонированных в GenBank NCBI (по состоянию на май 2012 г.) нуклеотидных последовательностей env-гена изолятов нового 8-го генотипа BLV (рис. 1).
Полученные результаты наглядно демонстрируют присутствие автономного 8-го генотипического кластера (рис. 1).
Дополнительно, в рамках совершенствования схемы ПЦР-ПДРФ-генотипирования, согласующейся с филогенетической классификацией ВЛКРС, в процессе системного анализа рестрикционных картирований локуса env-гена известных представителей BLV, нами подобраны новые условия идентификации по 5 эндонуклеазам рестрикции (PvuII, SspI, HphI, HaeIII и BstYI). Обобщенная информация с интерпретацией полученных env-ПЦР-ПДРФ-профилей BLV представлена в табл. 1.
MD (ИМ! 023551 -----3 ШВ7В72)
Bt](EF065638)
-------->172 (JF6S3619)
4-2 (НМ5&Э7В1)
----t RtK (EF065639)
CKAS-2 (ЕК065636) -------CRUC’ ] (EF065655)
151 tAYI855<tf>) 50 (DQ059421)
PLl2tt (ПМШ) -----12 (SK3530)
30 (lX|0594t7)
N2S (НМ 3023 56)
] (AY5J52Щ
------ 14 (AY515274)
— USC A-1 (EF0(SS647)
USCA-2 (EF06564S) ------■ J],b'L' (BF065 65 0)
АЫ453 (FJBI08577) PL-4960 (FJ8085$0)
AL-EG4 (FJ8D8574)
--------ARGSFS (AF4S5773)
N174 (JF713455J
3-43 (HM563767)
4-1 (HM563766)
ELGCro/MTTW (IN990073)
MI /ELG Cin.m (GU724606) tUG Сгс/ВЕМЮв (JNM0069) tUO СгоЮЙАЛЧ (J N990070)
---------- .ELG СюЛЖАЛ» (JN 990071)
ELG Cm/VRAAK *JN9W072)
ELG Cm/BlO, 1Й (JNM0074)
3
к LU'disfan {EU2660G2)
VdM (М3 52 39)
- Cow 527 (AF007764) 23 (LB7B73)
AL-63 (FJ808?7l)
IAL-2106 (FJS0B57B)
-----UruCOGM (FM95555S)
ОйОБ
Рис. 1/ Дендрограмма типовых представителей известных генотипов BLV (env-ген) [MEGA-4: алгоритм NJ, 400 nt, 40 seq.]
Табл. 1. Усовершенствованная схема ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV
Г Изолят GenBank A/N ПЦР- продукт (п.н.) ПДРФ-фрагменты (п.н.) К N
PvuII SspI HphI HaeIII BstYI
i-й AL-63 FJ808571 444 444 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 198/128/118 1 50
i-й Cow 527 AF007764 444 444 399/45 224/220 285/94/32/27/6 198/128/118 2 8
i-й 23 U87873 444 444 399/45 224/220 312/94/32/6 198/128/118 3 1
i-й AL-2106 FJ808578 444 444 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 246/198 4 39
i-й UruC06II FM955558 444 444 399/45 224/220 285/94/32/27/6 246/198 5 1
i-й VdM M35239 444 444 399/45 224/181/39 198/94/87/32/27/6 316/128 6 1
i-й Kurdistan EU266062 444 444 399/45 220/196/28 198/119/94/27/6 198/128/118 7 1
2-й AL-164 FJ808574 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 198/128/118 8 34
2-й PL-4960 FJ808590 444 280/164 399/45 224/220 198/87/49/45/32/27/6 198/128/118 9 1
2-й ARGSFS AF485773 444 280/164 399/45 444 198/94/87/32/27/6 198/128/118 10 1
2-й AL-1453 FJ808577 444 280/164 444 224/220 198/94/87/32/27/6 198/128/118 11 1
3-й USCA-i EF065647 444 444 399/45 444 285/94/32/21/6/6 198/128/96/22 12 1
3-й USCA-2 EF065648 444 444 399/45 444 285/94/32/27/6 198/128/96/22 13 2
3-й JPFU EF065650 444 444 399/45 444 285/94/32/27/6 198/128/118 14 1
4-й N10 HM102355 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 25
4-й 3 U87872 444 444 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 16 1
5-й CRAS-2 EF065636 444 280/164 399/45 224/181/39 198/94/87/32/27/6 316/128 17 7
5-й CRGC EF065639 444 280/164 399/45 224/181/39 285/94/32/27/6 316/128 18 1
5-й CRLC-1 EF065655 444 280/164 444 224/181/39 198/94/87/32/27/6 316/128 19 2
б-й PL-1238 FJ808582 444 444 399/45 224/220 285/94/32/27/6 316/128 20 3
б-й 151 AY185360 444 444 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 316/128 21 7
7-й N2S HM102356 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 294/128/22 22 1
7-й i AY515280 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 23 16
7-й I2 S83530 444 444 444 224/220 285/94/32/27/6 316/128 24 1
7-й 14 AY515274 444 444 444 145/137/83/79 198/94/87/32/27/6 316/128 25 1
7-й 3G DQ059417 444 444 444 444 198/87/49/45/32/27/6 316/128 26 1
8-й N174 JF713455 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 316/128 27 1
8-й 3-43 HM563767 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 198/128/118 28 7
8-й ELG Cro/VRA/09 JN990072 444 444 444 224/220 225/94/87/32/6 198/128/118 29 2
Обозначения: Г - генотип; профилей, чьи нуклеотидные
К - комбинация; N - количество проанализированных изолятов BLV с соответствующей комбинацией ПЦР-ПДРФ-последовательности локуса env-гена депонированы в базу данных GenBank (по состоянию на май 2012 г).
i95
Так, 1-ый генотип BLV характеризуется наличием 7 комбинаций env-ПЦР-ПДРФ-профилей (К1-7), 2-ой генотип - четырёх комбинаций (К8-11), 3-ий генотип - наличием трёх комбинаций (К12-14); 4-ый генотип - двух комбинаций (К15-16); 5-ый генотип - трех комбинаций (К17-19); 6-ой генотип - двух комбинаций (К20-21), 7-ой генотип - пяти комбинаций (К22-26) и 8 генотип ВЛКРС - наличием трех комбинации (К27-29) env-ПЦР-ПДРФ-профилей BLV (табл. 1).
Следует подчеркнуть, что целый ряд комбинаций env-ПЦР-ПДРФ-профилей на данный момент представлен единственными нуклеотидными последовательностями локуса env-гена изолятов ВЛКРС,
депонированными в GenBank NCBI, в числе которых и выявленные нами изоляты N28 (22 комбинация, 7-ой генотип) и N174 (27 комбинация, 8-ой генотип), соответственно (табл. 1).
Примечательно, что для идентификации 4-го генотипа ВЛКРС достаточно даже одной эндонуклеазы рестрикции - BstYI. Охарактеризованный в нашей работе новый 8-ой генотип ВЛКРС также может быть идентифицирован с использованием одной единственной рестриктазы - HaeIII. С применением двух ферментов могут быть определены представители 2-го [PvuII и BstYI], 3-го [HphI и HaeIII] и 5-го [PvuII и BstYI] генотипов BLV (табл. 1).
В целях же исчерпывающей идентификации генотипов ВЛКРС целесообразно руководствоваться полной картиной env-ПЦР-ПДРФ-профилей с сопоставлением полученных данных с результатами секвенирования ПЦР-продуктов и последующим филогенетическим анализом представителей BLV по локусу env-гена.
ЛИТЕРАТУРА. 1. Шаева, А.Ю. Генотипическая идентификация изолятов ВЛКРС, выявленных в хозяйствах Республики Татарстан / А.Ю. Шаева, Р.Р. Вафин, Н.З. Хазипов, Б.В. Камалов, А.М. Алимов, М.Ш. Тагиров // Ученые записки КГАВМ. - Казань, 2011. - Т. 208. - С. 330-337.
2. Balic, D. Identification of a new genotype of bovine leukemia virus / D. Balic, I. Lojkic, M. Periskic, T. Bedekovic, A. Jungic, N. Lemo, B. Roic, Z. Cac, L. Barbic, J. Madic // Arch. Virol. - 2012 - Apr 10 [Epub ahead of print].
3. Beier, D. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA and DNA sequencing / D. Beier, P. Blankenstein, O. Marquardt, J. Kuzmak // Berl Munch Tierarztl Wochenschr - 2001. - V. 114. - № 7-8. - P. 252-256. 4. Fechner, H. Provirus variants of the bovine leukemia virus and their relation to the serological status of naturally infected cattle / H. Fechner, P. Blankenstein, A.C. Looman, J. Elwert, L. Geue, C. Albrecht, A. Kurg, D. Beier, O. Marquardt,
D. Ebner // Virology -1997. - V. 237. - № 2. - P. 261-269. 5. Licursi, M. Genetic heterogeneity among bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts / M. Licursi, Y. Inoshima, D. Wu, T. Yokoyama,
E.T. Gonzalez, H. Sentsui // Virus Res. - 2002. - V. 86. - № 1-2. - P. 101-110. 6. Moratorio, G. Phylogenetic analysis of bovine leukemia viruses isolated in
South America reveals diversification in seven distinct genotypes / G. Moratorio, G. Obal, A. Dubra, A. Correa, S. Bianchi, A. Buschiazzo, J. Cristina, O. Pritsch // Arch. Virol. - 2010. - V. 155. - № 4. - P. 481-489. 7. Rodriguez, S.M. Bovine leukemia virus can be classified into seven genotypes: evidence for the existence of two novel clades / S.M. Rodriguez, M.D. Golemba, R.H. Campos, K. Trono, L.R. Jones //J Gen Virol. - 2009. - V. 90. - № 11. - P. 2788-2797.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВОГО ГЕНОТИПА ВЛКРС
Шаева А.Ю., Гараева З.Р., Вафин Р.Р., Хазипов Н.З., Алимов А.М.
Резюме
На основании филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса env-гена провируса BLV охарактеризован новый генотип ВЛКРС, факт существования которого также подтвержден хорватскими исследователями. Усовершенствована схема ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV в соответствии с филогенетической классификацией данного возбудителя.
IDENTIFICATION OF A NEW BLV GENOTYPE
Shaeva A.Y., Garaeva Z.R., Vafin R.R., Khazipov N.Z., Alimov A.M.
Summary
Based on phylogenetic analysis of the BLV env-gene sequences was characterized a new genotype of bovine leukemia virus, the existence of which is also confirmed by Croatian researchers. A scheme of PCR-RFLP-genotyping of BLV in accordance with the phylogenetic classification of this pathogen was improved.
УДК 619:615.372:616.981.51
СОСТАВ ПОЧВЫ И ЕЕ РОЛЬ В СОХРАНЕНИИ ПОЧВЕННЫХ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ ОЧАГОВ В РЕСПУБЛИКЕ ЧАД
Шериф Л.А. - аспирант; Галиуллин А.К. - д.в.н., профессор, зав. кафедрой ФГБОУ ВПО КГАВМ, тел.: (843) 2739785
Ключевые слова: почва, сибирская язва, стационарно
неблагополучный пункт, анализ эпизоотической ситуации.
Key words: soil, anthrax, fixed point to a dysfunctional, analysis of the epizootic situation.
