CC BY
42
УДК: 619:57.065:578.828
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТИПИЗАЦИИ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Шаева А.Ю., Вафин Р.Р.*, Хазипов Н.З., Камалов Б.В.**, Алимов А.М.,
Тагиров М.Ш.*
ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана» ГНУ «ТатНИИСХ РАСХН» (Казань)* Главное управление ветеринарии КМ РТ (Казань)**
Ключевые слова: ВЛКРС, типизация, ПЦР, ПДРФ, филогенетический анализ.
Key words: BLV, typing, PCR, RFLP, phylogenetic analysis.
Лейкоз крупного рогатого скота - инфекционная болезнь опухолевой природы, этиологическим агентом которого является вирус лейкоза кр.рог.ск. (ВЛКРС, англ. Bovine leukemia virus, BLV), относящийся к роду Deltaretrovirus семейства Retroviridae [1, 2, 3, 4, 5].
Вопросы диагностики данного заболевания в контексте изучения генетического многообразия его этиологического агента весьма актуальны.
Ряд разработанных на основе интерпретации env-ПЦР-ПДРФ-профилей стратегий типизации BLV [1, 2, 3] имеют определенную идентификационную ценность, однако не способны охарактеризовать весь спектр генотипического разнообразия ВЛКРС [4, 5].
В 2009 году S.M. Rodriguez et al. [5] была предложена система классификации BLV на основе филогенетического анализа env-гена, предусматривающая наличие 7 генотипов ВЛКРС. Действенность данной концепции типизации BLV отражена в работе другой научной группы [4].
Целью нашего исследования являлось определение таксономической принадлежности изолятов ВЛКРС, выделенных в хозяйствах РТ, в контексте молекулярно-генетических аспектов типизации BLV.
Материалы и методы. В работе были использованы 2 изолята ВЛКРС: «N10» и «N28», выделенные от кр.рог.ск. из Мензелинского и Спасского районов Республики Татарстан, соответственно.
При постановке ПЦР с выделенными образцами провирусной ДНК BLV использовалась модификация «nested» ПЦР с применением внешних (env5032+env5608) и внутренних (env5099+env5521) праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции амплификацию фрагмента env-гена ВЛКРС длиной 444 п.н. [1, 2, 3].
На этапе ПДРФ-анализа амплификаты подвергались гидролизу с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI, PvuII, Ksp22I и HaeIII.
ПЦР-ПДРФ-продукты разгоняли в 2,5% агарозном геле (20 В/см, 40 мин) и визуализировали в УФ-трансиллюминаторе (А=310 нм).
Секвенирование продуктов амплификации локуса env-гена BLV с внутренними праймерами «env5099» и «env5521» изолятов «N10» и «N28» ВЛКРС выполнено на приборе ABI-300 в лабораториях НПО «СибЭнзим».
Изоляты «N10» (GenBank A/N: HM102355) и «N28» (GenBank A/N: HM102356) были выравнены по длине 444 нуклеотидов локуса env-гена c соответствующими опубликованными в GenBank последовательностями представителей известных генотипов BLV, используя программы BLAST и CLUSTAL W (v. 1.83) с последующим филогенетическим анализом.
Результаты исследования и их обсуждение.
Интерпретация ПЦР-ПДРФ-профилей BLV по D. Beier et al. (2001)
В результате реализации стратегии типизации представителей ВЛКРС на основе интерпретации ПЦР-ПДРФ-профилей BLV по D. Beier et al. (2001) [1], установлено, что изолят «N10», выделенный от кр.рог.ск. из Мензелинского района, характеризуется признаком Бельгийского подтипа, а изолят «N28», выделенный от кр.рог.ск. из Спасского района, относится к Австралийскому подтипу. Детальная информация, отражающая характеристику заявленных ПДРФ-вариантов ВЛКРС по протоколу Beier et al. (2001) [1], представлена в табл. 1, а результаты ПЦР-ПДРФ-анализа исследованных нами изолятов «N10» и «N28» ВЛКРС отражены на рис. 1.
1. ^nv-ПЦР-ПДРФ-профили BLV (праймеры env5099-env5521)
ПДРФ-вариант ВЛКРС ПЦР-продукт (п.н.) ПДРФ-фрагменты (п.н.)
PvuII BamHI BclI (Ksp22I)
Бельгийский подтип 444 280/164 444 225/219
Австралийский подтип 444 444 316/128 225/219
Японский подтип 444 444 316/128 219/121/104
1.0 1.1 1.2 1.3 М 2.0 2.1 2.2 2.3
1. Электрофореграмма env-ПЦР-ПДРФ-профилей изолятов N10 и N28 BLV
Обозначения: 1.0-1.3) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята N10 БЬУ: 1.0) ПЦР-продукт (444 Ьр); 1.1) PvuII-ПДРФ (280/164 Ьр); 1.2) BamHI-ПДРФ (444 Ьр); 1.3) ^22ШДРФ (225/219 Ьр). М) ДНК-маркеры 100-1000 Ьр (СибЭнзим). 2.0-2.3) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята N28 БЬУ: 2.0) ПЦР-продукт (444 Ьр): 2.1) PvuII-ПДРФ (444 Ьр); 2.2) BamHI-ПДРФ (316/128 Ьр); 2.3) Ksp22I-ПДРФ (225/219 Ьр).
Однако, разработанная Б. Бе1ег е! а1. (2001) [1] типизация ВЛКРС, а также ранее предложенная Н/ БесИпег е! а1 (1997) [2] классификация не позволяют охватить весь спектр генетического многообразия БЬУ [4, 5].
Интерпретация ПЦР-ПДРФ-профилей BLV по M. Licursi et al. (2002)
В результате реализации стратегии типизации представителей ВЛКРС на основе интерпретации ПЦР-ПДРФ-профилей БЬУ по М. Ысига е! а1. (2002) [3], установлено, что изолят «N10» относится к 6-му генотипу, а изолят «N28» - к 1-му генотипу.
Детальная информация, отражающая характеристику заявленных генотипов ВЛКРС по протоколу М. Ысига е! а1. (2002) [3], представлена в табл. 2, а результаты ПЦР-ПДРФ-анализа исследованных нами изолятов «N10» и «N28» ВЛКРС отражены на рис. 2.
2. £^-ПЦР-ПДРФ-профили БЬУ (праймеры епу5099-епу5521)
Генотип ПЦР-продукт (п.н.) ПДРФ-фрагменты (п.н.)
BclI ^р22Г) Наеш Г^иП
1 444 225/219 198/94/87/32/27/6 444
2 444 219/121/104 312/94/32/6 444
3 444 219/121/104 285/94/32/27/6 444
4 444 219/121/104 198/94/87/32/27/6 444
5 444 225/219 285/94/32/27/6 444
6 444 225/219 198/94/87/32/27/6 280/164
1.0 1.1 1.2 1.3 М 2.0 2.1 2.2 2.3
444 Ьр
280 Ьр
225/219 Ьр 198 Ьр 164 Ьр
94/87 Ьр 32/27 Ьр
2. Электрофореграмма еяу-ПЦР-ПДРФ-профилей изолятов N10 и N28 БЬУ
Обозначения: 1.0-1.3) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята N10 БЬУ: 1.0) ПЦР-продукт (444 Ьр); 1.1) Ksp22I-ЦДРФ (225/219 Ьр); 1.2) HaeIII-ЦДРФ (198/94/87/32/27/6 Ьр); 1.3) PvuII-ПДРФ (280/164 Ьр). М) ДНК-маркеры 100-1000 Ьр (СибЭнзим). 2.0-2.3) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята N28 БЬУ: 2.0) ПЦР-продукт (444 Ьр): 2.1) Ksp22I-ПДРФ (225/219 Ьр); 2.2) HaeIII-ПДРФ (198/94/87/32/27/6 Ьр); 2.3) PvuII-ПДРФ (444 Ьр).
Следует отметить, что разработанная М. Ьюшга е! а1. (2002) [3] система генотипирования представителей ВЛКРС также не позволяет охарактеризовать весь спектр генотипического разнообразия БЬУ, в отличие от филогенетической классификации, предложенной 8.М. Rodгigшez е! а1. (2009) [5], регламентирующей наличие 7 генотипов (рис. 3).
3. Дендрограмма типовых представителей известных генотипов BLV (env-ген) [CLUSTAL W (v. 1.83); алгоритм NJ]
По результатам филогенетического анализа выравненных нуклеотидных последовательностей локуса env-гена типовых представителей известных генотипов ВЛРКС установлено, что изолят «N10» принадлежит к кластеру 4-го генотипа, а изолят «N28» - 7-го генотипа BLV (рис. 3).
Заключение. Системный мониторинг инфицированности стад ВЛКРС на генотипическом уровне идентификации возбудителя будет способствовать повышению эффективности противолейкозных мероприятий.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Beier, D. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA and DNA sequencing / D. Beier, P. Blankenstein, O. Marquardt, J. Kuzmak // Berl Munch Tierarztl Wochenschr - 2001. - V. 114. -№ 7-8. - P. 252-256. 2. Fechner, H. Provirus variants of the bovine leukemia virus and their relation to the serological status of naturally infected cattle / H. Fechner, P. Blankenstein, A.C. Looman, J. Elwert, L. Geue, C. Albrecht, A. Kurg, D. Beier, O. Marquardt, D. Ebner // Virology -1997. - V. 237. - № 2. -P. 261-269. 3. Licursi, M. Genetic heterogeneity among bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts / M. Licursi, Y. Inoshima, D. Wu, T. Yokoyama, E.T. González, H. Sentsui // Virus Res. - 2002. - V. 86. - № 1-2. - P. 101-110. 4. Moratorio, G. Phylogenetic analysis of bovine leukemia viruses isolated in South America reveals diversification in seven distinct genotypes / G. Moratorio, G. Obal, A. Dubra, A. Correa, S. Bianchi, A. Buschiazzo, J. Cristina, O. Pritsch // Arch. Virol. - 2010. - V. 155. -№ 4. - P. 481-489. 5. Rodriguez, S.M. Bovine leukemia virus can be classified into seven genotypes: evidence for the existence of two novel clades / S.M. Rodriguez, M.D. Golemba, R.H. Campos, K. Trono, L.R. Jones //J Gen Virol. -2009. - V. 90. - № 11. - P. 2788-2797.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТИПИЗАЦИИ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Шаева А.Ю., Вафин Р.Р., Хазипов Н.З., Камалов Б.В., Алимов А.М.,
Тагиров М.Ш.
Резюме
Целью нашего исследования являлось определение таксономической принадлежности изолятов ВЛКРС, выделенных в хозяйствах РТ, в контексте молекулярно-генетических аспектов типизации BLV. Системный мониторинг инфицированности стад ВЛКРС на генотипическом уровне идентификации возбудителя будет способствовать повышению эффективности противолейкозных мероприятий.
MOLECULAR-GENETIC ASPECTS OF BOVINE LEUKEMIA VIRUS TYPING
Shaeva A.Y., Vafin R.R., Khazipov N.Z., Kamalov B.V., Alimov A.M.,
Tagirov M.Sh.
Summary
The aim of our study was to determine the taxonomic affiliation of BLV isolated from the livestock farms of the Republic of Tatarstan, in the context of molecular-genetic aspects of BLV typing. The systematic herd monitoring on the genotypic level of BLV identification, will enhance the efficiency of anti-epizootic events.
УДК: 619:57.065:578.828
РАЗРАБОТКА СХЕМЫ ПЦР-ПДРФ-ГЕНОТИПИРОВАНИЯ BLV В СООТВЕТСТВИИ С ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЙ КЛАССИФИКАЦИЕЙ
Шаева А.Ю., Вафин Р.Р.*, Хазипов Н.З., Камалов Б.В.**, Алимов А.М.,
Тагиров М.Ш.*
ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» ГНУ «ТатНИИСХ РАСХН» (Казань)* Главное управление ветеринарии КМ РТ (Казань)**
Ключевые слова: ВЛКРС, классификация, генотипирование, ПЦР, ПДРФ.
Key words: BLV, classification, genotyping, PCR, RFLP.
Лейкоз крупного рогатого скота, имеющий повсеместное широкое распространение, остается одной из наиболее актуальных проблем животноводства в виду нанесения данной отрасли сельского хозяйства ощутимого экономического ущерба [1, 2, 3, 4, 5].
Лабораторно-диагностические исследования в системе мониторинга инфицированности стад Bovine Leukemia virus (BLV) являются неразрывным звеном противолейкозных мероприятий [4, 5].
Ранее разработанные способы типизации ВЛКРС на основе ПЦР-ПДРФ-анализа [1, 2, 3], несмотря на определенную идентификационную ценность, всё же не позволяют охарактеризовать весь спектр генетического многообразия BLV, нежели филогенетическая классификация, предложенная S.M. Rodriguez et al. (2009) [5], и регламентирующая наличие 7 генотипов у данного инфекционного агента.
Целью данной работы являлся сравнительный анализ представителей ВЛКРС на предмет их классификации в контексте предложенных стратегий типизации с дальнейшим усовершенствованием
