CC BY
17УДК 577.21:620.193.82
внутривидовое типирование
stachybotrys spp.
молекулярно-
биологическими
методами
руднева м.В. (м.н.с.)*, Доршакова Е.В. (н.с.), лавникевич Д.м. (аспирант), игнатьева с.м. (в.н.с.), тараскина А.Е. (зав. лаб.), Елинов н.П. (профессор кафедры)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, СевероЗападный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
©Коллектив авторов, 2015
Stachybotrys spp. относят к наиболее опасным токсинообразую-щим микромицетам - биодеструкторам с доказанными межштам-мовыми вариациями в продуцировании микотоксинов. На основании изучения нуклеотидных последовательностей можно предсказывать токсигенные свойства стахиботрисов. Цель работы заключалась в разработке методики мультилокусного типирования Stachybotrys spp. по локусам триходиен-синтазы и хитин-синтазы. Показано, что с помощью молекулярно-биологического метода можно выделять группы штаммов разной степени токсичности, а также однозначно идентифицировать стахиботрисы до вида.
Ключевые слова: микотоксины, молекулярная идентификация, мультилокусное типирование, Stachybotrys spp.
intraspecies typing of
stachybotrys spp. by the
methods of molecular genetics
Rudneva M.v. (junior scientific collaborator), Dorshakova E.v. (scientific collaborator), Lavnikevich D.M. (postgraduate student), ignatieva s.M. (leading scientific collaborator), Taraskina A.E. (head of the laboratory), elinov N.P. (professor of the chair) Kashkin Research Institute of Medical Mycology of NorthWest State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
©Collective of authors, 2015
Stachybotrys spp. are known to produce mycotoxins that have been associated with a number of human and veterinary health problems. Many investigators notice variation in the levels of toxin production among Stachybotrys individuals that can be predicted by nucleotide analysis. The aim of this study is intraspecies typing of Stachybotrys spp. by multilocus sequencing of the trichodiene synthase gene and the chitin synthase gene. This method can be used for discriminating toxic and nontoxic strains and for the identification of Stachybotrys species.
Key words: molecular identification, multilocus sequence typing, mycotoxins, Stachybotrys spp.
введение
Stachybotrys spp. достаточно широко распространены в природе и, будучи контаминантами жилых помещений при избыточной влажности, являются «индикаторами» состояния зданий. В то же время, стахиботрисы способны выделять опасные для человека микотоксины, при этом их количество варьирует в зависимости от штамма. Исследователи, изучающие токсичные свойства Stachybotrys spp., прибегают к определению их нуклеотидных последовательностей. При этом установлено, что только при типировании по нескольким локусам удается выявить различия между штаммами [1-3]. Локусы, выбираемые для молекулярно-генетиче-ской идентификации, должны присутствовать у всех видов изучаемого рода и при этом отличаться вариабельностью между видами и штаммами. Наибольшей вариабельностью у стахиботрисов обладают гены три-ходиен-синтазы (TRI5) и хитин-синтазы (CHS) [Cruse M., et al. //Mycologia. - 2002. - Vol. 94]. Ген TRI5 кодирует фермент триходиен-синтазу, который участвует в превращении фарнезил пирофосфата в триходиены, являющиеся начальным звеном синтеза трихотице-новых микотоксинов (Рис.1). Ген TRI5 имеет в своем составе высоко-консервативные участки, а также ин-трон, обеспечивающий значительную вариабельность между различными видами. Таким образом, этот ген может быть использован в качестве маркера для оценки потенциальной продукции микотоксинов и представляет интерес для идентификации видов, таксономических анализов и анализов географического распространения штаммов [4].
Рис. 1. Синтез трихотиценовых микотоксинов, катализируемый ферментом триходиен-синтазой
Ген хитин-синтазы (CHS) кодирует энзим, отвечающий за образование клеточной стенки (Рис. 2).
но
но но
^O-UDP ———* Chitin
МНАс Synthase
U О Р -ft-acetylg lucos a m in е
но-i КО^ НО—\
NHAc NHAe ™АС Chitin
Контактное лицо: Руднева Мария Владимировна, тел. (812) 303-51-40
Рис. 2. Синтез хитина при участии фермента хитин-синтазы
Цель исследования - проведение внутривидового типирования для выделения генетически обусловленных токсигенных и нетоксигенных штаммов Stachybotrys spp.
материалы и методы
Коллекция штаммов Stachybotrys spp. включала 16 изолятов, выделенных в чистые культуры из образцов строительных и отделочных материалов жилых, офисных и больничных помещений. Культуральным методом 15 образцов были определены как Stachybotrys chartarum, 1 образец - S. chlorochalonata. У всех штаммов биохимическим методом определяли количество продуцируемых микотоксинов с помощью коммерческой иммуноферментной тест-системы ELISA (США) в соответствии с инструкцией производителя.
■
ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2015. Т.17. №4
Для выделения ДНК использовали десятидневные культуры. Фрагменты мицелия измельчали с помощью гомогенизатора Precellys. Измельчённый мицелий инкубировали с экстракционным буфером SDS 1% (5 mM ЭДТА, 0,1 M NaCl, 1% SDS, 20mM Tris) в течение ночи при 65 оС. Далее проводили экстракцию хлоро-форм-изоамиловой (24:1) смесью в течение 15 мин, после чего центрифугировали 10 мин при 12 000 об/ мин на микроцентрифуге MiniSpin (Eppendorf). ДНК осаждали этанолом при -20 оС, после чего концентрировали центрифугированием в течение 10 мин при 15 000 об/мин. Полученный осадок дважды промывали 70% спиртом, высушивали и растворяли в буфере ТЕ (10mM Tris, 1mM ЭДТА). Концентрацию выделенной ДНК измеряли на флуориметре Qubit (Invitrogen, США).
Амплификацию гена триходиен-синтазы проводили по участку TRI5, присутствующему у всех грибов, продуцирующих микотоксины, и локусу STOX, являющимся таксон-специфичным для рода Stachybotrys. Ген хитин-синтазы был амплифицирован по локусу CHS. Для ПЦР по локусу TRI5 применяли праймеры TRI5-5'(5'-CAT CAA TCC AAC AGT TTC AC-3') и TRI5-3' (5'-GCA ACC TTC AAA GAC TAT TG-3') [Cruse M., et al. //Mycologia. - 2002. - Vol. 94]. Участок STOX был амплифицирован с помощью праймеров STOX5-1 (5'-GTC TAT ACT CGA CAA TAG TCC-3') и STOX5-4 (5'-GTC CTT CTG AGA GAA CAC TA-3') [Petrola J., et al. // Can. J. Microbiol. - 2002. - Vol. 48]. Для ПЦР по локусу CHS использовали праймеры Chs1-5' (5'-ATC TCA CCA CAA GCA CCG CCA CAC A-3') и chs1-3' (5'-GGA AGA AGA TCG TTG TGT GCG TGG T-3') [Cruse M., et al. //Mycologia. - 2002. - Vol. 94].
Нами был модифицирован протокол амплификации, предложенный Sodipe A. [1]. ПЦР проводили в 50 мкл смеси, содержащей 0,2 мМ дНТФ (Синтол, Москва), 10 пкмоль каждого праймера (Синтол, Москва), 0,9 е.а. Tаq-полимеразы (Синтол, Москва), 2,5 мМ MgCl2 (Синтол, Москва) и 0,5 нг геномной ДНК. Амплификацию осуществляли при следующем режиме: стартовая денатурация 5 мин. - 95 "С; 34 цикла, включающих денатурацию 30 сек. - 95 "С, отжиг 30 сек. -52 "С, элонгацию 1 мин.- 72 "С; финальная элонгация 10 мин. - 72 "С.
Полученные ПЦР фрагменты разделяли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле в трис-борат-ЭДТА буфере в присутствии бромистого этидия и визуализировали в УФ-свете. Очистку продуктов амплификации осуществляли осаждением этанолом в присутствии ЭДТА.
Определение нуклеотидных последовательностей выполняли по методу Сэнджера на генетическом анализаторе ABI Prizm 3500 (Applied Btosystems, США). Реакцию проводили с использованием набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) в объеме 10 мкл, согласно рекомендациям производителя. Очистку от терминирующих аналогов нуклеотидов осуществляли набором BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems, США). Полученные последовательности сравнивали с базой данных GenBank.
На основании полученных последовательностей нуклеотидов были построены филогенетические дендрограммы, отражающие степень родства между
штаммами. Филогенетический анализ, основанный на числе пар общих оснований, выполняли в программе MEGA 5.03.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Подобрана оптимальная программа амплификации стахиботрисов для локусов TRI5, STOX и CHS. Показано, что ПЦР идет наиболее эффективно при температуре отжига 52 оС, с количеством ДНК 0,5 нг на реакцию. Биохимическим методом выявили 10 высокотоксичных штаммов, продуцирующих микотоксины в высоких концентрациях, и 6 - средней токсичности.
С помощью мультилокусного типирования по локусам триходиен-синтазы и хитин-синтазы мы провели точную видовую идентификацию изолятов Stachybotrys spp., что невозможно при стандартном определении по локусу ITS. Молекулярно-генети-ческим методом выявлено 15 образцов Stachybotrys chartarum, 1 образец - S. chlorochalonata, что на 100% соответствует культуральному определению.
Во всех исследуемых образцах мы обнаружили ген триходиен-синтазы и этим доказали токсичность образцов. Построены филогенетические дендрограммы, отражающие степень сходства между штаммами. На основании анализа дендрограмм можно выделить несколько групп штаммов с близкими нуклеотидными последовательностями, которые сходны также по количеству продуцируемых микотоксинов. Дендрограммы по каждому локусу представлены на рисунках 3-5. Кружками выделены группы штаммов высокой токсичности.
Рис. 3. Филогенетическая дендрограмма по локусу STOX
Рис. 4. Филогенетическая дендрограмма по локусу TRI
ВЫВОДЫ
1. Подобран оптимальный метод молекулярно-ге-нетической идентификации Stachybotrys зрр. по генам триходиен-синтазы и хитин-синтазы
2. Методом мультилокусного типирования удается точно определять вид Stachybotrys зрр.
3. Метод мультилокусного типирования можно обоснованно применять для оценки токсигенных свойств Stachybotrys зрр.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Sodipe A., Ogbonnia F. Amplification of Stachybotrys gene using PCR// Eur. Intern. J. of Sci. and Technol. - 2013. - Vol. 2, №2. - P. 52-62.
2. Black J. Detection of Stachybotrys chartarum using rRNA, tri5, and b-tubulin primers and determining their relative copy number by real-time PCR// Mycological Research. - 2008. - Vol. 12. - P. 845-851.
3. Koster B. A multi-gene phylogeny for Stachybotrys evidences lack of trichodiene synthase (tri5) gene for isolates of one of three intrageneric lineages// Mycological Research. - 2009. - Vol. 113. - P. 877-886.
4. Semeiks J., Borek D. Comparative genome sequencing reveals chemotype-specific gene clusters in the toxigenic black mold Stachybotrys// BMC Genomics. - 2014. - Vol.15, №590. - P.1-16.
Поступила в редакцию журнала 11.12.2015 Рецензент: А.А. Степанова
Рис. 5. Филогенетическая дендрограмма по локусу CHS
