CC BY
103
УДК 57.065,582.282.192.3
Филогенетический анализ и молекулярное типирование трихотеценпродуцирующих грибов рода Fusarium из российских коллекций
А. А. Стахеев1*, Л. В. Самохвалова1, О. Д. Микитюк2, С. К. Завриев1
'Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
2Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии, 143050, Московская обл., Одинцовский р-н, р.п. Большие Вяземы, ул. Институт, влад. 5 *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 26.04.2017 Принята к печати 27.03.2018
РЕФЕРАТ Проведен трехлокусный филогенетический анализ штаммов грибов рода Fusarium, депонированных во всероссийских коллекциях и предположительно способных к синтезу микотоксинов трихоте-ценовой группы. Исследован меж- и внутривидовой полиморфизм фрагментов гена фактора элонгации трансляции 1 альфа (TEF1a) и двух генов, входящих в трихотеценовый кластер - TRI5 и TRI14. Анализ 60 штаммов различного происхождения позволил подтвердить и уточнить таксономическую характеристику некоторых штаммов с помощью ДНК-маркеров. Впервые на территории России идентифицирован штамм F. commune (F-900), а также выявлен штамм (F-846), филогенетически отличный от любого из охарактеризованных на данный момент видов Fusarium. Также показано, что штаммы F. equiseti из северо-западных регионов России относятся к североевропейской (I) группе, а северокавказский изолят - к южноевропейской (II). Частичные последовательности гена TRI14 9 из 12 исследованных видов охарактеризованы впервые. Сравнительный анализ выявил относительно высокий уровень внутривидового полиморфизма этих последовательностей, в частности у видов F. graminearum и F. sporotrichioides, однако не обнаружено какой-либо связи между различиями в структуре гена TRI14 и географическим происхождением либо хемотипом штаммов. С помощью двух систем праймеров проведено молекулярное типирование штаммов-продуцентов трихотеценов типа В, позволившее охарактеризовать их специфические хемотипы. Принадлежность большинства исследованных штаммов к определенному хемотипу подтверждена методом ВЭЖХ. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА ДНК-маркеры, идентификация, род Fusarium, трихотеценовые микотоксины, филогенетический анализ, хемотип.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ПЦР - полимеразная цепная реакция; ТрМТ - трихотеценовые микотоксины; TEF1a - ген фактора элонгации трансляции 1 альфа; TRI5 - ген триходиенсинтетазы.
ВВЕДЕНИЕ
Грибы рода Fusarium, относящегося к классу аско-мицетов, занимают разнообразные экологические ниши и встречаются в различных климатических поясах. На территории России виды Fusarium распространены во всех регионах, в которых выращивают сельскохозяйственные культуры, в первую очередь злаки. Этот гриб причиняет существенный ущерб сельскохозяйственной и пищевой промышленности, исчисляемый сотнями миллионов долларов ежегодно. Кроме того, микотоксины, продуцируемые представителями рода Fusarium, представляют угрозу здоровью человека и животных, а также действуют
как факторы патогенности по отношению к растениям [1].
Наиболее обширной группой токсических метаболитов, продуцируемых грибами рода Fusarium, являются трихотеценовые микотоксины (ТрМТ). Трихотеценовые микотоксины продуцируются не только представителями рода Fusarium, но и родов Myrotecium, Trichoderma, Cephalosporium, Verticimonosporium, Stachybotrys [2]. На сегодняшний день выявлено около 200 трихотеценовых токсинов [3-6]. ТрМТ представляют собой сесквитерпено-вые соединения, состоящие из трех колец, у которых при атомах С-12-С-13 находится эпоксидное кольцо,
а при С-9—С-10 - двойная связь, поэтому группа носит название 12,13-эпокситрихотец-9-ены. В зависимости от структуры боковых групп трихотеценовые токсины делятся на четыре типа (A-D), при этом лишь А и В продуцируются грибами рода Fusarium. К более токсичным представителям трихотеце-нов типа А относятся диацетоксисцирпенол (ДАС), а также токсины Т-2 и НТ-2, а основными продуцентами этих токсинов являются F. sporotrichioides и F. langsethiae. В 2015-2016 гг. была описана новая группа трихотеценовых токсинов типа А, получившая название NX [7, 8]. Интересно, что эти соединения идентифицированы в культурах F. graminearum, традиционного продуцента ТрМТ В-типа. Тип В представлен такими соединениями, как нивале-нол (НИВ), дезоксиниваленол (ДОН), а также их ацетилированными производными (3- и 15-АДОН и 4,15-АНИВ), которые продуцируются F. graminearum, F. culmorum, F. cerealis, а также группой видов, известной под названием F. graminearum species complex (FGSC) [9, 10]. Кроме того, F. poae, F. venenatum и F. equiseti способны продуцировать токсины, относящиеся как к А-, так и к В-типам [11]. Тип токсинов, продуцируемых тем или иным штаммом, определяется структурой и функциями генов, входящих в состав трихотеценового кластера [12, 13]. У большинства трихотеценобразующих видов Fusarium в состав основного кластера входят 12 генов, кодирующих как ферменты, ответственные за различные этапы биосинтеза, так и регуляторные факторы, некоторые из которых контролируют экспрессию большого числа генов, связанных с различными аспектами метаболизма и жизнедеятельности грибов [14]. Трихотеценовые токсины ингибируют синтез белка у эукариот [15], а такие трихотеце-ны, как ДОН, представляют собой важные факторы агрессивности, способствуя распространению гриба по тканям растения-хозяина. Показано, что искусственная инокуляция колоса злаков мутантными штаммами F. graminearum, у которых нарушен синтез ДОН, приводила к поражению меньшего количества зерновок, чем инокуляция штаммами дикого типа [16].
Опасность, которую представляют грибы рода Fusarium и продуцируемые ими микотоксины, делает необходимой разработку методов быстрого и надежного определения видовой принадлежности штаммов, что позволит определять спектр соединений, накапливающихся в культуре или партии зерна. На сегодняшний день важную роль в таксономических исследованиях рода Fusarium и идентификации его представителей играют методы, основанные на анализе полиморфизма ДНК. Применение мо-лекулярно-генетического подхода позволило более
четко установить стандарты и границы видов, а также охарактеризовать целый ряд новых таксонов. В частности, мультилокусный филогенетический анализ с использованием ДНК-маркеров с охарактеризованной последовательностью нуклеотидов (SCAR-маркеры [17]) на основе 13 генов «домашнего хозяйства» позволил выявить 9 новых видов в составе FGSC [10], который ранее считался единым видом F. graminearum. Чуть позднее этот комплекс был дополнен также видами F. vorosii и F. gerlachii [18]. Всего в составе комплекса FGSC выделяют 16 филогенетических видов [19]. Применение филогенетического подхода дало возможность подтвердить статус F. pseudograminearum и F. culmorum как самостоятельных видов [20, 21]. На территории России с помощью анализа полиморфных ДНК-маркеров идентифицированы группы штаммов, впоследствии охарактеризованные как два новых вида - F. ussuria-num, морфологически и фенотипически сходный с F. graminearum [22], и F. sibiricum, близкородственный F. sporotrichioides [23]. Ряд недавних филогенетических исследований позволил установить сложную структуру комплекса видов F. equiseti-F. incarnatum (FIESC) и выделить в его составе несколько новых видов [24]. Кроме того, изучение меж- и внутривидового полиморфизма ДНК позволило разработать ряд высокоспецифичных систем диагностики и идентификации основных возбудителей фузариоза, прежде всего, основанных на ПЦР и ее модификациях [2529]. Применение современных молекулярно-биологи-ческих и биоинформатических методов, в том числе полногеномного секвенирования [30, 31], существенно ускорило изучение генетического разнообразия рода Fusarium и функциональную характеристику элементов геномов, однако поиск эффективных методов молекулярного маркирования и информативных ДНК-баркодов остается по-прежнему актуальным [32, 33].
Род Fusarium отличается от большинства других таксонов царства Грибы (Fungi). «Золотым стандартом» молекулярной таксономии грибов считается область внутреннего транскрибируемого спейсера рибосомной ДНК (ITS) [34]. Однако в геноме представителей рода Fusarium эти маркеры представлены двумя неортологичными копиями и не обладают достаточным уровнем межвидового полиморфизма [35]. На сегодняшний день в филогенетических и таксономических исследованиях в качестве маркера наиболее часто используется ген TEF1a [36, 37]. Интересным представляется использование в качестве филогенетических маркеров генов, вовлеченных в биосинтез микотоксинов. Так, ген, кодирующий триходиенсинтетазу (TRI5), ранее использовали для разработки систем видоспеци-
фичных праймеров [38] и изучения внутривидового полиморфизма представителей комплекса видов F. equiseti [39, 40]. Однако филогенетические характеристики гена TRI5 не сравнивали с характеристиками «классических» маркеров, таких, как TEF1a. Среди других генов, входящих в состав трихотеце-нового кластера и применяемых в филогенетических исследованиях, необходимо отметить TRI1, кодирующий цитохром-Р450-монооксигеназу, и TRI12, кодирующий белок, участвующий в транспорте токсинов из клетки [41]. Филогенетический анализ гена TRI1 позволил идентифицировать группу штаммов F. graminearum, обладающих способностью к синтезу токсина NX-2 [7]. Полиморфизм гена TRI12 использовали для дизайна праймеров, выявляющих штаммы-продуценты ТрМТ типа B в соответствии с их хемотипом (3/15-АДОН, НИВ) [42]. В состав трихотеценового кластера входит также ряд генов, практически не охарактеризованных ни структурно, ни функционально, таких, как TRI9 и TRI14 [43].
Содержащиеся во всероссийских коллекциях штаммы Fusarium, потенциально способные к синтезу ТрМТ и представляющие различные климатоге-ографические зоны России, практически не охарактеризованы молекулярно-генетическими методами. Поэтому основными целями нашей работы были: (1) анализ корректности таксономической идентификации трихотеценпродуцирующих штаммов Fusarium, депонированных во всероссийских коллекциях, с помощью SCAR-маркеров; (2) изучение молекулярно-генетического разнообразия штаммов различного географического происхождения, выделенных в разные годы и из разных источников; (3) определение меж- и внутривидового полиморфизма гена TRI14, одного из наименее изученных генов трихотецено-вого кластера; (4) определение хемотипов штаммов-продуцентов ТрМТ типа В с помощью известных систем праймеров, с подтверждением полученных результатов методом ВЭЖХ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Штаммы грибов
В работе анализировали 60 штаммов 12 видов грибов рода Fusarium, депонированных во всероссийских коллекциях и предположительно обладающих способностью к биосинтезу ТрМТ. При выборе штаммов исходили из максимального охвата различных природно-географических зон России. Кроме того, в исследование были включены штаммы из ряда сопредельных государств, а также из Молдовы и Германии. Кроме того, изучен штамм F. graminearum F-892 (ВКПМ), депонированный в базе данных Strainlnfo (http://www.straininfo.net)
под номером ATCC 36015. Перечень штаммов с указанием их географического происхождения, видов растений-хозяев, годами сбора и принадлежности к той или иной коллекции приведен в табл. 1. Дополнительно с помощью лабораторного микроскопа МИКМЕД 6 («Ломо», Россия) определяли морфологические характеристики ряда штаммов, первоначальная идентификация которых не подтверждалась молекулярными методами. Для проведения микроскопического анализа штаммы грибов выращивали в течение 10-14 сут на гвоздично-листовом агаре (ГЛА) и синтетической среде Ниренберга (SNA).
Выделение ДНК
Перед выделением ДНК моноспоровые культуры грибов выращивали на картофельно-сахарозном агаре (КСА) в течение 10 сут при комнатной температуре до получения обильного мицелия. ДНК из моноспоровых культур грибов выделяли с помощью метода, основанного на использовании цетил-триметиламмоний бромида в качестве детергента, с учетом модификаций, описанных нами ранее [28]. Концентрацию образцов ДНК и их чистоту оценивали с помощью спектрофотометра NanoVue (GE HealthCare, США).
Дизайн универсальных праймеров, проведение ПЦР, секвенирование
Для амплификации частичных последовательностей генов TEF1a, TRI5 и TRI14 сконструированы пары праймеров TEF50F (5'-CGACT-CTGGCAAGTCGACCAC-3') и TEF59 0R (5'-CTCGGCTTTGAGCTTGTCAAG-3'); TRI5F (5'-ACACTGGTTCTGGACGACAGCA-3') и TRI5R (5'-CCATCCAGTTCTCCATCTGAG-3'); TRI14F (5'-GAAGCTGCCTCGACATGGCTC-3') и TRI14R (5'-AATAATATTATGGGGAACAATCAT-3').
Праймеры подбирали с использованием алгоритма ClustalW [44]. Физико-химические свойства праймеров оценивали с помощью программы Oligo 6.71.
ПЦР проводили с использованием следующих программ амплификации.
Праймеры TEF50F-590R: 93°С, 90 с; 93°С, 20 с; 64°С, 5 с; 67°С, 5 с (5 циклов); 93°С, 1 с; 64°C, 5 с; 67°С, 5 с (40 циклов).
Праймеры TRI5F-R и TRI14F-R: 93°С, 90 с; 93°С, 10 с; 55°С, 15 с; 72°С, 10 с (40 циклов).
ПЦР и электрофоретический анализ проводили согласно [27, 28].
Продукты ПЦР клонировали с использованием системы InstA Clone PCR Cloning Kit (Fermentas, Литва) в соответствии с протоколом производителя. ДНК секвенировали в ЗАО «Евроген» с использованием набора реактивов ABI PRISM BigDye
Таблица 1. Штаммы грибов рода Fusarium, использованные в работе
№ № коллекции Вид Происхождение Источник Год выделения
1 M-99-43* F. culmorum Московская обл. Пшеница 1999
2 09-1/7* F. culmorum Московская обл. Пшеница 2009
3 М-99-9* F. culmorum Московская обл. Пшеница 1999
4 М-10-1* F. culmorum Московская обл. Пшеница 2010
5 BR-03-19* F. culmorum Брянская обл. Пшеница 2003
6 BR-0453* F. culmorum Брянская обл. Пшеница 2004
7 0М-0233* F. culmorum Омская обл. Пшеница 2002
8 0R-02-37* F. culmorum Орловская обл. Пшеница 2002
9 СМ-9864* F. culmorum Смоленская обл. Пшеница 1998
10 КР-1136-66* F. culmorum Кировская обл. Пшеница 1995
11 КР-1599-25/3* F. culmorum Кировская обл. Пшеница 1996
12 KS-1384-1* F. culmorum Кировская обл. Пшеница 2007
13 М-05-111* F. culmorum Московская обл. Пшеница 2005
14 КС-1716-8* F. culmorum Кировская обл. Пшеница 1997
15 58801** F. culmorum Московская обл. Пшеница 2004
16 Kz-27* F. culmorum Костанайская обл., Казахстан Неизвестно 2014
17 74007** F. culmorum Архангельская обл. Картофель Неизвестно
18 58030** F. culmorum Ростовская обл. Бодяк 2004
19 70505** F. culmorum Беларусь Пшеница 2003
20 50106** F. culmorum Ленинградская обл. Бодяк 2006
21 64722** F. cerealis Хабаровский край Пшеница 2006
22 39295** F. cerealis Провинция Хэйлунцзян, Китай Пшеница 2003
23 37032** F. cerealis Провинция Хэйлунцзян, Китай Пшеница 2003
24 39142** F. cerealis Провинция Хэйлунцзян, Китай Пшеница 2003
25 37031** F. cerealis Провинция Хэйлунцзян, Китай Пшеница 2003
26 41727** F. cerealis Северная Осетия Бодяк 2004
27 G.8-8** F. graminearum Германия Пшеница 1998
28 41806** F. graminearum Северная Осетия Пшеница 2004
29 48702** F. graminearum Тульская обл. Пшеница Неизвестно
30 58033** F. graminearum Ленинградская обл. Пшеница 2002
31 70725** F. graminearum Орловская обл. Пшеница 2006
32 58212** F. ussurianum1 Приморский край Пшеница Неизвестно
33 29813** F. ussurianum Еврейская АО Пшеница 2002
34 ММ-7* F. sporotrichioides Московская обл. Пшеница 2010
35 KG-9744* F. sporotrichioides Кировская обл. Пшеница Неизвестно
36 78105** F. sporotrichioides Орловская обл. Пшеница 2006
37 SK-1506* F. sporotrichioides Северная Осетия Пшеница 2010
38 64706** F. sporotrichioides Приморский край Ячмень 2006
39 33100** F. sporotrichioides Приморский край Пшеница 2003
40 74006** F. sporotrichioides Ленинградская обл. Ячмень 2006
41 11007** F. sibiricum Красноярский край Ячмень 2000
42 11014** F. sibiricum Амурская обл. Овёс 2001
43 55201** F. langsethiae Калининградская обл. Овёс 2005
44 82901** F. langsethiae Орловская обл. Овёс 2003
45 47401** F. poae Московская обл. Пшеница 2004
46 61701** F. poae Саратовская обл. Пшеница 2005
47 58242** F. venenatum Германия Неизвестно Неизвестно
48 58514** F. venenatum Ленинградская обл. Овёс 2013
49 58455** F. venenatum Новгородская обл. Пшеница 2001
50 F-842*** F. sambucinum Киевская обл., Украина Картофель 1965
51 F-3966*** F. sambucinum2 Тульская обл. Почва 2006
52 F-4360*** F. sambucinum2 Бурятия Древесина 2005
53 64414** F. equiseti Калининградская обл. Ячмень 2006
54 65901** F. equiseti Ленинградская обл. Ячмень 2006
55 97001** F. equiseti Северная Осетия Пшеница 2007
56 F-3549*** F. equiseti2 Пустыня Негев, Израиль Почва 1995
57 F-2681*** F. incarnatum Московская обл. Неизвестно 1966
58 F-846*** F. sp.3 Молдова Дыня 1958
59 F-892 (ATCC36015)**** F. graminearum США Неизвестно 1977
60 F-900**** F. sambucinum2 Красноярский край Лиственница сиб. Неизвестно
* Штаммы из коллекции ВНИИФ; **штаммы из коллекции ВИЗР; ***штаммы из коллекции ИБФМ; ****штаммы из коллекции ГосНИИГенетика. 'Первоначально идентифицирован как F. дгат/пеатт. 2В ходе работы видовая принадлежность не подтвердилась. 'Первоначально идентифицирован как F. роае.
Terminator v. 3.1. с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3730 Applied Biosystems.
Охарактеризованные в настоящей работе последовательности нуклеотидов депонированы в GenBank NCBI под номерами: MG989711-989751 (TEF1a), MH001611-001651 (TRI5), MH001652-001692 (TRI14).
Филогенетический анализ
ДНК-маркеры с охарактеризованной последовательностью нуклеотидов сравнивали с последовательностями, депонированными в базах данных GenBank NCBI и Fusarium MLST (http://www. westerdijkinstitute.nl/fusarium/) с помощью алгоритма BLAST. Построение филогенетических деревьев проводили с использованием метода максимального правдоподобия (maximum likelihood, ML) и модели нуклеотидных замен GTR+G (General Time Reversible, с гамма-распределением) [45] в программе MEGA5.1 [46]. Помимо исследуемых штаммов в филогенетическом анализе использовали ряд последовательностей соответствующих генов типовых штаммов из международных коллекций, депонированных в базах данных. Достоверность топологий филогенетических деревьев подтверждали с помощью бутстреп-анализа с 1000 повторностей. Инсерции и делеции при проведении анализа не учитывали. Количество вариабельных, филогенетически информативных нуклеотидов и гаплотипов для каждого маркера вычисляли, используя выборку из 41 штамма в программе DnaSP v6 [47].
Молекулярное типирование продуцентов ТрМТ типа В
С целью определения хемотипов продуцентов ТрМТ типа В анализировали штаммы F. gra-minearum, F. culmorum, F. cerealis, F. ussurianum. Хемотип-специфичную ПЦР проводили с использованием трех наборов праймеров: два набора прай-меров на полиморфные участки гена TRI12 [42] (набор обозначен нами как 12-1), [48] (12-2), а также пара праймеров, амплифицирующая фрагменты последовательности гена TRI13 разной длины в зависимости от хемотипа [49] (13-1). Структура праймеров и температура их плавления приведены в табл. 2. При этом в случае системы 12-2 анализ решено проводить с каждой парой праймеров отдельно, а не в формате мультиплексной ПЦР [48], что позволит повысить специфичность анализа, а также избежать образования неспецифических ампликонов.
Полученные результаты подтверждали с помощью количественной ПЦР (кПЦР) с парами прай-меров из систем 12-1 и 12-2. В состав реакционной смеси, помимо стандартных компонентов, добавляли по 1.5 мкл 20х красителя EvaGreen (Biotium, США). Амплификацию и детекцию флуоресцентного сигнала проводили в детектирующем ампли-фикаторе ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия). Результаты ПЦР выражали в значении пороговых циклов (quantification cycle, Cq, [50]). Анализ каждого образца проводили в двух независимых повтор-ностях.
Таблица 2. Праймеры, использованные для хемотипирования штаммов, продуцирующих ТрМТ типа В
Набор праймеров Структура праймеров Длина продукта, п.н. T , °С пл' Хемотип Ссылка
12-1 12CON (унив.): 5'-CATGAGCATGGTGATGTC- 3' [48]
12 NF: 5'-TCTCCTCGTTGTATCTGG-3' 840 60 НИВ
12-15F: 5'-TACAGCGGTCGCAACTTC-3' 670 60 15-АДОН
12-3F: 5'-CTTTGGCAAGCCCGTGCA-3' 410 60 3-АДОН
12-2 3ADONf: 5'-AACATGATCGGTGAGGTATCGA-3' 3ADONr: 5'-CCATGGCGCTGGGAGTT-3' 60 60 3-АДОН [42]
15ADONf: 5'-GTTTCGATATTCATTGGAAAGCTAC-3' 15ADONr: 5'-CAAATAAGTATCGTCTGAAATTGGAAA-5' 57 60 15-АДОН
NIVf: 5'-GCCCATATTCGCGACAATGT-5' NIVr: 5'-GGCGAACTGATGAGTAACAAAACC-3' 77 60 НИВ
13-1 Tri13P1: 5'-CTCSACCGCATCGAAGASTCTC-3' Tri13P2: 5'-GAASGTCGCARGACCTTGTTTC-3' 859 644 583 62 15-АДОН 3-АДОН НИВ [49]
Примечание: унив. - универсальный праймер.
Анализ токсинообразования штаммов-продуцентов ТрМТ типа В методом ВЭЖХ
Для определения типа ТрМТ, продуцируемых исследуемыми штаммами, культуры грибов выращивали на жидкой среде MYRO [51] при 25°С, 220 об/мин в течение 5 сут. Способность изолятов продуцировать ДОН и его моноацетилированные производные определяли, анализируя отделенный от мицелия центрифугированием супернатант культурально-го фильтрата, с помощью жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой [52, 53]. Аликвоту супернатанта культуральной жидкости объемом 8 мл разбавляли смесью ацетонитрил : вода (1 : 1) до 10 мл, пропускали через мембранный фильтр Millipore с диаметром пор 0.22 мкм и вводили 10 мкл образца в инжектор жидкостного хроматографа Waters 1525 Breeze, снабженного УФ-детектором Waters 2487 (Waters, США). Разделение проводили на колонке Symmetry C18 (150 х 4.6 мм), которую термостатировали при 27°С. Микотоксины элюиро-вали смесью ацетонитрил : метанол : вода (1 : 1 : 8 об/об/об - подвижная фаза) со скоростью потока 0.5 мл/мин и детектировали при 254 нм. В качестве стандартов использовали коммерческие препараты ДОН, 3-АцДОН и 15-АцДОН (Sigma-Aldrich, США), а в качестве контроля - фильтрат неинокулирован-ной среды MYRO, которую инкубировали одновременно с выращиванием погруженных культур грибов в указанных выше условиях.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Филогенетические свойства генов, анализ их частичных последовательностей с помощью алгоритма BLAST, микроскопический анализ морфологии штаммов со спорной идентификацией
Основные филогенетические свойства анализируемых генов приведены в табл. 3. ДНК всех штаммов при амплификации с парой праймеров 50F-590R образовывала единственный продукт амплификации размером от 452 до 483 п.о., содержащего два интрона
длиной от 80 до 100 и от 236 до 254 п.н. За вычетом инсерций и делеций, не учитываемых при оценке филогенетических свойств, длина анализируемых последовательностей составила 392 п.н., включая 129 (32.9%) вариабельных нуклеотидов. Число филогенетически информативных позиций - 115 (29.3%), число гаплотипов - 17. Анализ последовательностей гена TEFla с применением алгоритма BLAST подтвердил первоначальную видовую идентификацию 54 штаммов. Из шести штаммов, идентификация которых не была подтверждена, три были изначально охарактеризованы как F. sambucinum. Показано, что последовательности TEFla штаммов F-3966 (№ 51, см. табл. 1), NRRL 52726, относящегося к комплексу F. tricinctum species, и NRRL 52727 (F. avenaceum), сходны на 99.3%. Сходство штамма F-4360 (№ 52) со штаммом F. acuminatum NRRL 52789 составляет 99.545%. Последовательность гена TEFla штамма F-900 (№ 60) на 100% сходна с последовательностью фрагмента этого гена штамма NRRL 52764 F. commune. Не подтверждена первоначальная видовая принадлежность штамма F-3549 (№ 56), морфологически идентифицированного как F. equiseti: BLAST-анализ выявил 99% сходство с последовательностью штамма NRRL 34033 относительно редкого вида F. brachygibbosum. Штамм 58212 (№ 32), первоначально идентифицированный как F. graminearum, показал 100% сходство последовательности TEFla со штаммами CBS 123751-123745, типовыми для F. ussurianum. Наиболее интересный результат получен при анализе результатов секве-нирования маркерной последовательности штамма F-846, первоначально идентифицированного как F. poae. Сравнение с последовательностями TEFla типовых штаммов, депонированными в базах данных, не выявило 100% сходства ни с одной из них. Наиболее близкой была последовательность штамма F-0016 вида F. polyphialidicum (DQ295144, сходство 97%).
Пара праймеров TRI5F-R обеспечивала амплификацию ДНК всех исследуемых штаммов, за исклю-
Таблица 3. Филогенетические характеристики анализируемых последовательностей нуклеотидов
Локус ДП, п.н. GC, % ВП, % ФИП, % Число ГТ Hd P.
TEFla 392 53.2 32.9 29.3 17 0.933 0.08872
TRI5 379 48.5 37.2 36.1 13 0.907 0.13586
TRIl4 650 49.1 36.8 34.5 23 0.96 0.13510
TEFla + TRI5+TRIl4 1421 50 35.9 33.5 28 0.976 0.1233
Примечание. ДП - длины анализируемых последовательностей, GC - GC-состав, ВП - вариабельные позиции (variable sites), ФИП - филогенетически информативные позиции (parsimony informative sites), ГТ - гаплотипы, Hd - гаплотипическое разнообразие, P, - нуклеотидное разнообразие.
чением № 51, 52, 56 и 60. Продукт амплификации гена TRI5 длиной 431-440 п.н. содержал один интрон длиной 52-61 п.н. Длина анализируемых последовательностей составила 379 п.н., в том числе 141 (37.2%) вариабельная позиция и 137 (36.1%) филогенетически информативных, число гаплотипов - 13. Анализ последовательностей с помощью BLAST подтвердил корректность видовой идентификации 54 штаммов. Продукт амплификации ДНК штамма 58212 показал 99% сходство с последовательностью фрагмента гена TRI5 F. asiaticum (штаммы NRRL 26156, 28720). Необходимо отметить, что ни одна из баз данных не содержала записей о полных или частичных структурах этого гена у штаммов F. ussurianum, однако, принимая во внимание близкое родство F. asiaticum и F. ussurianum [7], этот результат представляется достоверным. Продукт амплификации ДНК штамма F-846 был на 98% сходным с частичной последовательностью гена TRI5 штамма F. langsethiae KF2640 (JF966259).
При проведении ПЦР с парой праймеров TRI14F-R не были выявлены продукты амплификации ДНК образцов № 51, 52, 56, 60 (как и в случае пары TRI5F-R), а также № 58 (F-846). ДНК остальных штаммов амплифицировалась с образованием продуктов размером от 698 до 705 п.н., содержащих один интрон длиной от 50 до 59 п.н. Длина анализируемой последовательности (без учета вставок и делеций) составила 650 п.н., из которых 239 (36.8%) вариабельные, а 224 (34.5%) - филогенетически информативные, число гаплотипов - 23. Поиск сходных последовательностей в базах данных GenBank и Fusarium MLST показал, что исследованные штаммы F. graminearum составляют две группы: первая, в которую входят № 30 и 58, показала 100% сходство с последовательностью TRI14 штамма CBS 138562 (KU572434.1), в то время как вторая (№ 27-29, 31) полностью идентична последовательности штамма CBS 138561 (KU572429.1), при этом сходство последовательностей в этих двух группах составляло 97%.
Проведен микроскопический анализ основных морфологических структур штаммов, первоначальная идентификация которых не была подтверждена при анализе маркерных последовательностей. У штаммов F-3966 и F-4360, растущих на ГЛА, выявлены удлиненные изогнутые макроконидии с тремя-четырьмя перегородками, характерными для F. av-enaceum, F. tricinctum и F. acuminatum [54]. Штамм F-900 также формировал изогнутые макроконидии с четырьмя перегородками и микроконидии овальной формы размером порядка 10 мкм - признаки, соответствующие характеристикам вида F. commune [55]. У штамма F-846 обнаружены толстостенные микроконидии с четырьмя-пятью перегородками, а также
овальные и булавовидные микроконидии. Этот результат подтверждает предположение об ошибочности первоначальной идентификации штамма как F. poae, поскольку для этого вида характерны шаровидные или остроконечные микроконидии, а также редко формирующиеся макроконидии, как правило, с тремя перегородками [54].
Анализ топологии филогенетических деревьев
Филогенетические деревья, построенные на основе структур трех изучаемых генов, имели как сходство, так и ряд существенных топологических различий. На дендрограмме гена TEFla (рис. 1) присутствуют четыре крупных кластера, поддержанных высокими значениями бутстрепа (98-99%). Каждый кластер включал штаммы видов, характеризующихся сходными спектрами продуцируемых микотоксинов. Кластер I (бутстреп-поддержка 98%) представлен видами, продуцирующими ТрМТ типа В (в том числе F. pseudograminearum CBS109954, номер KM434220), кластер II (99%) сформирован продуцентами ТрМТ типа А, кластер III (98%) представлен видами, образующими оба типа ТрМТ, а кластер IV (99%) - видами F. equiseti и F. incarnatum, также способными продуцировать токсины как типа А, так и В, однако, в отличие от F. poae и близкородственных видов, они обладают также способностью к синтезу зеараленона и некоторых других микотоксинов. Необходимо отметить, что кластеры I-III и IV формировали отдельные группы, поддержанные высокими значениями бутстрепа (99%), а «F. sp.» (штамм F-846 Fusarium sp.) занимал промежуточное положение между этими двумя группами. Кластеры I и II включали в себя по две подгруппы: первую подгруппу кластера I (поддержка 99%) составили штаммы видов F. culmorum и F. cerealis, а вторую (98%) - F. graminearum и F. ussurianum. В кластере II подгруппы были представлены видами F. langsethiae и F. sporotrichioides/F. sibiricum (бутстреп-поддержка по 99% каждая). Наиболее неоднородным был кластер IV, представленный видами F. equiseti и F. incarnatum. Два типовых штамма F. incarnatum (NRRL 22244 и NRRL 34059) формировали отдельную группу, поддержанную значением бутстрепа 59%, в которую, однако, не вошел штамм F-2681, исследованный в настоящей работе. Штамм F. equiseti 97001 сформировал подгруппу (90%) вместе со штаммами H2-2-5B (JF496575) и 10393 (LN901566), а штаммы 65901 и 64414 вошли в состав другой подгруппы (99%), куда также входили штаммы VI01095 (AJ543560), VI01070 (AJ543562) и 10675 (LN901573).
Бутстреп-поддержка основных кластеров, соответствующих токсигенным профилям исследуемых видов, на дендрограмме гена TRI5 (рис. 2) состав-
Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнения частичных последовательностей нукле-отидов гена TEF1a видов-продуцентов ТрМТ с помощью метода максимального правдоподобия (74 последовательности). Показаны значения бутстрепа более 50% для 1000 повторностей. В анализ включена 21 последовательность типовых штаммов, депонированных в GenBank NCBI
63
99
97
98
99
62
99
98
F.culmorum 1136-66 F.culmorum БМ9864 F.culmorum КБ-1384-1 F.culmorum ОЮ237 F.culmorum К227 F.culmorum 0М0233 F.culmorum 58801 F.culmorum В||-03-19 F.culmorum 74007 F.culmorum 70505 F.culmorum 58030 F.culmorum 50106 F.culmorum 0917 F.culmorum КБ-1716-8 F.culmorum М-10-1 F.culmorum М-9943 F.culmorum 05-111 F.culmorum 3288 - F.culmorum 25475 F.cerealis 37031 F.cerealis 41727 F.cerealis 64722 F.cerealis 39295 F.cerealis 39142 F.cerealis 37032 F.cerealis 25805 F.cerealis 13721 92 F.ussurianum 29813 : F.ussurianum 58212 F.graminearum 58033 F.graminearum 13383 F.graminearum 48702 F.graminearum 6394 F.graminearum 28063 F.graminearum 41806 F.graminearum 70725 F.graminearum G.8-8 F.graminearum F-892 F.pseudograminearum СВБ 10995 75 ¡F.langsethiae 55201 F.langsethiae 82901
langsethiae 34176 F.sporotrichioides 33100 F.sporotrichioides 64706 ■ F.sibiricum 11007 I F.sibiricum 11014 F.sporotrichioides 74006 F.sporotrichioides 78105 F.sporotrichioides KG9744 F.sporotrichioides ММ-7 F.sporotrichioides БК-1506 F.sporotrichioides 26863 F.sporotrichioides 26924 75| F.poae 61701 99 П F.poae LMSA 1.09.1 F.poae 47401
98
85
64
99
I (В)
100
75 _99П F.
. FЛ
65 99
67
II (А)
89
99
F.sambucinum М123 F.venena1um FRC |-09186 F.venena1um 58514 F.venena1um 58242 F.venena1um 58455 -F.sp F-846
100
F.culmorum 0М0233 F.culmorum NRRL 3288 F.culmorum Кг27 F.culmorum В|-03-19 F.culmorum 74007 F.culmorum 70505 F.culmorum 58030 F.culmorum 50106 — F.culmorum 9Р F.culmorum 05-111 F.culmorum 0917 и F.culmorum 1ВТ2303 F.cerealis 37031 F.cerealis 41727 F.cerealis 64722 F.cerealis NRRL 13721 F.cerealis FRC |-09624 1F.ussurianum 29813 0 F.l
97
100 F.ussurianum 58212 F.graminearum 41806 F.graminearum 48702
- F.graminearum G.8-8 F.graminearum 58033 F.graminearum 70725
- F.graminearum 1ВТ1958 F.graminearum F-892 F.graminearum NRRL 6394 F.graminearum W8
F.pseudograminearum NRRL 28334 F.venenatum 58514
99
95
94
75
F.venenatum FRC |-09186 F.venenatum 58455 F.venenatum 58242 ^F.sambucinum F-842
100
sambucinum FRC |-07843 . F.poae 47401 F.poae 61701
98
92
100
55
100 ' F.poae DDPP07410 -F.sp. F-846 F.sibiricum 11014
I (В)
III (А+В)
83
100
F.sporotrichioides 33100 F.sibiricum 11007 F.langsethiae 82901 F.langsethiae NRRL 53410 F.langsethiae 55201 — F.sporotrichioides иАМН5334 F.sporotrichioides 64706 F.sporotrichioides 74006 F.sporotrichioides 78105 F.sporotrichioides 1^9744 F.sporofrichioides ММ-7 F.sporotrichioides SK1506 F.sporotrichioides NRRL 29978 _F.incarna1um 311
II (А)
70
III
(А+В)
77
- F.equiseti 97001 -F.equiseti 1^2652
84
F.equiseti 64414 F.equiseti 65901 F.incarnatum F-2681 -F.equiseti KF98
IV
(A+B+Z)
0.05
59
99
89 F. 9,0' F.sp
85
99 70
-F.incarna1um NRRL 22244
-F.incarnatum NRRL 34059
equiseti Н2-2-5В . FIESC5 ITEM 10393 - F.equiseti 97001 F.equiseti VЮ1095 F.equiseti 65901 F.equiseti 64414 F.incarnatum F-2681 F.equiseti VЮ1070 F.sp. FIESC14 ITEM 10675
IV (A+B+Z)
Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнения частичных последовательностей нуклеотидов гена TRI5 видов-продуцентов ТрМТ с помощью метода максимального правдоподобия (60 последовательностей). Показаны значения бутстрепа более 50% для 1000 повторностей. В анализ включены 18 последовательностей типовых штаммов, депонированных в GenBank КЮВ!
0.02
99^F.sambucinum F-842
100
100
91
F.s
90
F.culmorum 0M-0233 F.culmorum CBS173.31 F.culmorum Kz-27 F.culmorum 0917 F.culmorum 05-111 F.culmorum BR-03-19 F.culmorum 50106 • F.culmorum 58030 F.culmorum 70505 F.culmorum 74007 F.ussurianum 29813 ussurianum 58212 F.cerealis 64722 cerealis 37031 cerealis 41727
п.F.graminearum 58033 F.graminearum CBS 138562 F.graminearum F-892 F.graminearum 48702 F.graminearum 70725 F.graminearum 41806 F.graminearum G.8-8 F.graminearum CBS138561 F.venenatum 58455 venenatum 58514 venenatum 58242 sambucinum F-842
99 F.u
F.u F.c F.c 00 FF..cc
100
I (B)
.F.poae 47401 0 F.p
III (A+B)
100 - F.poae 61701
98 F.langsethiae 55201 _'— F.langsethiae 82901 95,— F.sibiricum 11007 F.sibiricum 11014
Î- F.sporotrichioides SK-15-06 F.sporotrichioides MM-7 F.sporotrichioides GB AF326571 • F.sporotrichioides 33100 F.sporotrichioides 74006 F.sporotrichioides 64706 F.sporotrichioides 78105 F.sporotrichioides KG-9744 — F.equiseti 97001
- F.equiseti 65901
-i F.equiseti 64414
100 iF.incarnatum F-2681
100 57
91
65
II (A)
100
IV (A+B+Z)
0.05
100
100
100
F.culmorum 0917 F.culmorum 50106 F.culmorum 05-111 F.culmorum 58030 F.culmorum Kz-27 F.culmorum OM-0233 F.culmorum BR-03-19 F.culmorum 70505 F.culmorum 74007 F.cerealis 37031 F.cerealis 41727 F.cerealis 64722 F.ussurianum 29813
100
96
100 F.ussurianum 58212 99 F.graminearum 58033 F.graminearum F-892 97 F.graminearum 48702 F.graminearum G.8-8 F.graminearum 41??? F.graminearum 70725 F.venenatum 58242 venenatum 58455 venenatum 58514
sambucinum F-842 F.poae 47401 F.poae 61701
F.vene 100 FF..vveennee
I (B)
III (A+B)
100
100
100
99 F.langsethiae 55201 F.langsethiae 82901 99- F.sibiricum 11007 F.sibiricum 11014 - F.sporotrichioides 33100 F.sporotrichioides MM-7 . F.sporotrichioides SK-1506 F.sporotrichioides 64706 F.sporotrichioides 74006 F.sporotrichioides 78105 F.sporotrichioides KG-9744 F.equiseti 97001 - F.equiseti 65901 F.equiseti 64414
II (A)
100
F.incarnatum F-2681
IV (A+B+Z)
0.05
Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнения частичных последовательностей нуклеотидов гена TRI14 видов-продуцентов ТрМТ с помощью метода максимального правдоподобия (45 последовательностей). Показаны значения бутстрепа более 50% для 1000 повторностей. В анализ включены четыре последовательности типовых штаммов, депонированных в GenBank NCBI
ляла от 94 (кластер III) до 100% (кластеры I, II, IV). В отличие от дендрограммы гена TEFla, «F. sp.» занимал промежуточное положение между кластерами II и III. Кроме того, штаммы F. sporotrichioides не формировали единой группы, а были распределены по кластеру II, в частности, штамм 33100 оказался в одной подгруппе со штаммами F. sibiricum (поддержка 98%). В составе кластера I отсутствовала подгруппа F. graminearum-ussurianum, характерная для дендрограммы TEFla. На филогенетическом дереве гена TRI14 (рис. 3) штаммы F. ussurianum сфор-
Рис. 4. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнения комбинированной последовательности нуклеотидов генов TEF1 a+TRI5+TRI14 видов-продуцентов ТрМТ с помощью метода максимального правдоподобия (41 последовательность). Показаны значения бутстрепа более 50% для 1000 повторностей
мировали подгруппу со штаммами F. cerealis (бут-стреп-поддержка 95%), в то время как штаммы F. graminearum разделились на две подгруппы, поддержанные значениями бутстрепа 99 и 100%. В состав кластера II входят подгруппы F. langsethiae (98%) и F. sporotrichioides/sibiricum (91%); таким образом, топология этого кластера на дендрограмме TRI14 соответствовала скорее топологии дендрограммы TEFla, чем TRI5. Необходимо отметить, что в составе кластера IV штаммы F. equiseti 64414, 65901 и F. incarnatum F-2681, с одной стороны, и штамм F. equiseti 97001, с другой, формировали отдельные ветви на дендрограммах обоих TRI-генов.
В структуре филогенетического дерева, построенного на основе анализа комбинированной последовательности генов TEFla, TRI5 и TRI14 (рис. 4), можно
выделить четыре крупных кластера, поддержанных значениями бутстрепа 100%. Обращает на себя внимание существование общей группы, включающей кластеры II и III (бутстреп-поддержка 96%).
Хемотипирование штаммов-продуцентов ТрМТ типа В, определение микотоксинов методом ВЭЖХ
В табл. 4 приведены результаты анализа 33 штаммов-продуцентов ТрМТ типа В методом кПЦР с наборами праймеров 12-1 и 12-2. От использования
набора 3-1 в ходе исследования было решено отказаться, поскольку при электрофоретическом анализе продуктов амплификации во всех образцах выявлены две специфические полосы (данные не приведены), т.е. не удавалось разделить хемотипы 3-АДОН и 15-АДОН F. дтаттватит. Согласно результатам хемотипирования, все проанализированные штаммы F. си1тогит и F. ussurianum принадлежат к хемотипу 3-АДОН, к нему же относятся штаммы F. дгаттвагит 58033 и 70725. ДНК штаммов F.
Таблица 4. Результаты кПЦР ДНК 33 штаммов рода Fusarium, относящихся к продуцентам ТрМТ типа В, с использованием наборов праймеров 12-1 и 12-2
Штамм 3-АДОН 15-АДОН НИВ ВЭЖХ
Набор праймеров 12-1 12-2 12-1 12-2 12-1 12-2
F. culmorum M-99-43 + + - - - - 3-АДОН
F. culmorum 09-1/7 + + - - - - 3-АДОН
F. culmorum М-99-9 + + - ? - - 3-АДОН
F. culmorum M-10-1 + + - - - - н/а
F. culmorum BR-03-19 + + - - - - н/а
F. culmorum BR-0453 + + - - - - н/а
F. culmorum OM-0233 + + - - - - н/а
F. culmorum OR-02-37 + + - - - - 3-АДОН
F. culmorum CM-9864 + + - - - - 3-АДОН
F. culmorum KP-1136-66 + + - - - - н/а
F. culmorum KP-1599-25/3 + + - - - - ДОН
F. culmorum KS-1384-1 + + - - - - ДОН
F. culmorum M-05-111 + + - - - - 3-АДОН
F. culmorum KC-1716-8 + + - - - - н/а
F. culmorum 58801 + + - - - - 3-АДОН
F. culmorum Kz-27 + + - - - - н/а
F. culmorum 74007 + + - - - - 3-АДОН
F. culmorum 58030 + + - - - - 3-АДОН
F. culmorum 70505 + + - - - - 3-АДОН
F. culmorum 50106 + + - - - - 3-АДОН
F. cerealis 64722 - - - - + + н/а
F. cerealis 39295 - - - - + + н/а
F. cerealis 37032 - - - - + + н/а
F. cerealis 39142 - - - - + + н/а
F. cerealis 37031 - - - - + + н/а
F. cerealis 41727 - - - - + + н/а
F. graminearum G.8-8 - - + + - - ДОН
F. graminearum 41806 ? ? + + - - 15-АДОН
F. graminearum 48702 - ? + + - - 15-АДОН
F. graminearum 58033 + + - - - - 3-АДОН
F. graminearum 70725 + + - - - - 3-АДОН
F. ussurianum 58212 + + - - - - ДОН
F. ussurianum 29813 + + - - - - 3-АДОН
Примечание. ВЭЖХ - результаты анализа методом ВЭЖХ. «?» - минорные полосы детектированы при электрофоретическом анализе либо амплификация на последних циклах кПЦР; «н/а» - не анализировали.
graminearum G.8-8, 41806, 48702 амплифицировалась с парой праймеров 12CON-12-15F, что свидетельствует об их принадлежности к 15-АДОН-хемотипу (однако в образцах F. graminearum 14-17 выявлены также минорные полосы, что, вероятно, связано с условиями проведения ПЦР).
Анализ токсинообразующей способности штаммов методом ВЭЖХ подтвердил данные молекулярного типирования большей части образцов (табл. 4). В большинстве культур ДОН количественно преобладал над ацетилированными производными, в культурах штаммов F. graminearum G.8-8, F. culmorum KP-1599-25/3, KS-1384-1, F. ussurianum 58212 производные обнаружены не были. На рис. 5 в качестве примера изображена хроматограмма культуральной жидкости штамма F. ussurianum 29813, содержащая пики, соответствующие ДОН (время удерживания 4.453) и 3-АДОН (время удерживания 5.483).
ОБСУЖДЕНИЕ
Основной задачей настоящей работы было изучение генетического разнообразия и токсигенных характеристик выделенных в разные годы в разных регионах России и депонированных во всероссийских коллекциях штаммов грибов рода Fusarium, потенциально способных к синтезу ТрМТ. Другой важный аспект исследования - расширение сведений о структурных особенностях генов, относящихся к основному трихо-теценовому кластеру, связанных с синтезом токсинов и патогенными свойствами гриба.
Поскольку ген TEFla на сегодняшний день считается наиболее изученным и наиболее филогенетически информативным SCAR-маркером представителей рода Fusarium, анализ его последовательностей стал основой для верификации таксономического статуса коллекционных штаммов. Первоначальная идентификация шести из 60 образцов не была подтверждена. Использование комбинации молеку-лярно-генетического и морфологического подходов позволило с высокой достоверностью определить видовую принадлежность «спорных» штаммов. Штамм 58212 (первоначально F. graminearum) был идентифицирован как F. ussurianum, что хорошо согласуется с его географическим происхождением (Приморский край) и с тем фактом, что виды F. graminearum и F. ussurianum практически невозможно отличить по морфологическим признакам. Штаммы F-3966 и F-4360, депонированные в коллекциях как F. sambucinum, идентифицированы как F. avenaceum и F. acuminatum соответственно. Виды F. acuminatum и F. avenaceum не продуцируют три-хотеценовые микотоксины, однако по занимаемым экологическим нишам и характеру роста на карто-фельно-сахарозном агаре сходны с F. sambucinum.
0.0035
0.0030
0.0005-
0.0000-
0.00
2.00
4.00 мин
6.00
8.00
Рис. 5. Хроматограмма культуральной жидкости штамма F. ussurianum 29813. Пик, охарактеризованный временем удерживания 4.453 - ДОН; пик, охарактеризованный временем удерживания 5.483 (красный) - 3-АДОН
Данные о подобных ошибках отсутствуют, однако утверждается, что распространена неверная идентификация близкородственного к этим двум видам F. torulosum как F. sambucinum [54]. Штамм F-900, выделенный из почвы лесопитомника в Красноярском крае, по результатам комплексного исследования идентифицирован как F. commune. Вид F. commune, описанный в 2003 г. [55], до настоящего времени не выявлялся на территории России. Согласно имеющимся данным, F. commune может быть как почвенным сапрофитом, так и поражать различные растения, в том числе важные в хозяйственном отношении культуры. F. commune считается таксономически близким к комплексу видов F. oxysporum, он не способен к синтезу ТрМТ [56], что подтверждается отсутствием продуктов ПЦР-амплификации с парами праймеров к генам TRI5 и TRI14. Штамм F-846, выделенный из дыни (Молдова, 1958), который по данным Всероссийской коллекции микроорганизмов представляет собой F. poae, при анализе последовательностей генов TEFla и TRI5 не показал 100% сходства ни с одной из последовательностей, депонированных в базах данных. По структуре маркерных генов наиболее близкими к нему оказались штаммы F. polyphi-alidicum F-0016 (TEFla) и F. langsethiae F2640 (TRI5). Родство F-846 с F. polyphialidicum не подтверждено анализом морфологических структур. Что же касает-
ся штамма F2640, депонированного в GenBank, то существуют сомнения в правильности его отнесения к F. langsethiae, что подтверждается значительными различиями в структуре гена TRI5 этого штамма и типовых штаммов F. langsethiae. На дендрограммах генов TEFla и TRI5 F-846 занимал промежуточное положение и не был отнесен ни к одному из крупных кластеров. Можно осторожно предположить, что штамм F-846 представляет собой отдельный филогенетический вид, однако для подтверждения этого предположения необходим дополнительный анализ с использованием большего спектра ДНК-маркеров, исследование токсинообразующей способности, а также дополнительных морфологических и физиологических данных.
В последние годы показано, что вид F. equiseti вместе с близкородственным F. incarnatum обладает сложной филогенетической структурой, формируя неоднородную группу, называемую «F. incarnatum-equiseti species complex» (FIESC). Штаммы F. equiseti из северной и южной Европы образуют две разные группы, названные типами I и II [57]. В настоящей работе маркерные последовательности гена TEFla штаммов из различных регионов России сравнивали с последовательностями этого гена штаммов VI01070 и VI01095, относящихся к типу I, штамма H2-2-5B, относящегося к типу II, а также штаммов 10675 и 10393, проанализированных в [40]. Сравнение последовательностей и филогенетический анализ TEFla показали, что штамм 97001, по всей видимости, принадлежит к типу II (южная Европа), что коррелирует с его географическим происхождением (Сев. Осетия), в то время как штаммы 64414 и 65901 (Калининградская и Ленинградская обл. соответственно) относятся к североевропейскому типу I. Исключением из этого правила стал штамм 10675 (LN901573), выделенный в 2009 г. из пшеницы в Испании, отнесенный, однако, согласно топологии сконструированного дерева, к типу I. К типу I также принадлежал штамм F-2681 F. incarnatum.
Использование в филогенетических исследованиях структур генов, ответственных за различные этапы биосинтеза микотоксинов, является дискуссионным, поскольку большая часть этих генов приобретена в результате горизонтального переноса. Сравнительный анализ таких маркеров, как правило, не вполне корректно отражает эволюционные отношения между таксонами, однако может быть полезен при выявлении особенностей токсинообразова-ния либо патогенных свойств штаммов. В настоящей работе нами исследованы частичные структуры двух входящих в трихотеценовый кластер генов - TRI5, кодирующего триходиенсинтетазу, ответственную за первый этап биосинтеза ТрМТ, и TRI14, точ-
ная функция которого неизвестна, однако предположительно связана с регуляцией биосинтеза ДОН или его транспортом за пределы клетки в процессе развития гриба в тканях зараженного растения [16]. Представленная в базах данных информация о последовательностях генов трихотеценового кластера достаточно ограничена. Так, депонировано по одной последовательности гена TRI5 F. venenatum и F. incarnatum и две - F. sambucinum. Найдены лишь три аннотации гена TRI14 F. sporotrichioides, одна - F. pseudograminearum, а также семь и четыре - в составе полных последовательностей трихо-теценового кластера F. graminearum и F. culmorum соответственно. Таким образом, впервые определены и депонированы в базу данных GenBank частичные последовательности гена TRI14 9 из 12 исследованных видов. Характерной особенностью генов TRI5 и TRI14 стал тот факт, что значительная часть вариабельных позиций у них сосредоточена в кодирующей части, что отражается и на различиях в аминокислотных последовательностях соответствующих белков между и внутри видов. Обратная картина наблюдается в случае гена TEFla, у которого все вариабельные позиции находятся в интронах, а кодирующая часть отличается высокой консервативностью. Как мы полагаем, такой характер различий может быть следствием разной эволюционной истории этих генов, а также того, что фактор элонгации трансляции не относится к белкам, специфичным для рода Fusarium, в то время как полиморфизм аминокислотных последовательностей белков, кодируемых генами TRI, имеет важное адаптивное значение. Этим же можно объяснить различия в топологии филогенетических деревьев, построенных на основе TEFla, TRI5 и TRI14. Одно из таких различий - формирование кластерами II (продуценты ТрМТ типа А) и III (ТрМТ А+В) общих ветвей, поддержанных высокими значениями бутстрепа (90 и 75%), на дендрограммах генов TRI5 и TRI14 соответственно. В свою очередь, на дендрограмме гена TEFla кластер II формирует общую ветвь с кластером I (продуценты ТрМТ типа В), хотя бутстреп-поддержка этой ветви была низкой (менее 50%). Также на ден-дрограммах генов TRI5 и TRI14 штаммы F. ussuria-num формировали единые кластеры со штаммами видов F. culmorum и F. cerealis, что противоречит эволюционным данным, согласно которым F. ussu-rianum наиболее близок к виду F. graminearum [22], что подтверждено при филогенетическом анализе TEFla. На дендрограмме гена TRI14 исследованные штаммы F. graminearum были разделены на два кластера с высокой бутстреп-поддержкой, однако нам не удалось связать эту группировку ни с хемотипом штаммов, ни с их географическим происхождением.
Можно предположить существование связи между полиморфизмом гена TRI14 и различиями в агрессивности разных штаммов по отношению к растению-хозяину. Однако в рамках настоящей работы таких исследований не проводилось. Для гена TRI5 также не выявлено корреляции между хемотипами F. graminearum (3/15-АДОН) и филогенетической структурой вида. Кроме того, ни один из проанализированных штаммов F. graminearum и F. culmorum не содержал 8-нуклеотидной делеции (TGGAACAA), маркерной для слаботоксигенных штаммов этих видов [58].
Несмотря на приблизительно одинаковое содержание вариабельных и филогенетически информативных позиций, а также гаплотипическое разнообразие трех генов, анализ TEFla более точно отражал филогенетическую структуру и предполагаемое эволюционное развитие группы видов рода Fusarium - продуцентов ТрМТ. Этот результат согласуется с данными, полученными ранее при исследовании полиморфизма других генов, вовлеченных в биосинтез микотоксинов, например TRI1 [7], или гена энниатин-синтазы (Esynl) - ключевого фермента биосинтеза энниатинов у F. avenaceum и близкородственных видов [28, 59].
Принадлежность к тому или иному хемотипу является специфической характеристикой штамма, продуцирующего В-трихотецены. В последние годы опубликованы работы, посвященные встречаемости хемотипов продуцентов В-трихотеценов (прежде всего, F. graminearum) в различных регионах мира, например в Южной Америке [60], Африке [61] и Европе [62, 63]. В 2016 г. были опубликованы результаты обширного исследования, проведенного специалистами из 17 стран Европы, в том числе из России [64], практическим результатом которого стало создание европейской базы данных (www.cata-logueeu.luxmcc.lu). В этой базе данных содержится информация о 187 штаммах, выделенных на территории России, при этом нет упоминания о штаммах из целого ряда регионов, таких, как Западная Сибирь и Волго-Вятский район, а также сведений о хемоти-пах коллекционных образцов, выделенных в прошлые годы. В настоящем исследовании для анализа типа ТрМТ мы применили комбинированный подход, включающий хемотипирование с использованием хемотип-специфических праймеров, описанных ранее (см. раздел «Молекулярное типирование продуцентов ТрМТ типа В»), а также анализ куль-туральных жидкостей некоторых штаммов методом ВЭЖХ. С помощью наборов праймеров, специфичных к полиморфным участкам гена TRI12 (12-1 и 122), удалось установить хемотипы штаммов четырех видов, продуцирующих ТрМТ типа В. Показано,
что штаммы F. culmorum и F. ussurianum относятся к 3-АДОН-хемотипу, штаммы F. cerealis - к НИВ-хемотипу, а среди штаммов F. graminearum присутствуют продуценты как 3-АДОН, так и 15-АДОН. Необходимо иметь в виду, что в некоторых случаях данные ПЦР-анализа могут не совпадать с реальным токсигенным профилем штамма, что подчеркивает необходимость подтверждения генетических данных с помощью химических методов [65]. Методом ВЭЖХ были подтверждены результаты хемотипи-рования 16 из 20 штаммов, выбранных для хрома-тографического анализа. В культуральных жидкостях четырех штаммов содержался только ДОН, а его ацетилированные производные отсутствовали. Опубликованные в последние годы результаты показывают, что среди штаммов F. graminearum различного географического происхождения доминируют продуценты 3-АДОН, что в значительной степени обусловлено их более высокой агрессивностью по сравнению с продуцентами 15-АДОН и НИВ [66, 67]. Анализ европейских штаммов F. graminearum показал, что 3-АДОН-хемотип распространен на севере Европы, в то время как хемотип 15-АДОН чаще встречается в центральной части и на юге континента [62-64]. Из трех исследованных нами штаммов F. graminearum 15-АДОН-хемотипа два можно отнести к центральноевропейской группе (G.8-8 - Германия, 48702 - Тульская обл.) и один -к южноевропейской (41806 - Сев. Осетия). Штаммы 3-АДОН-хемотипа можно отнести к североевропейской (58033 - Ленинградская обл.) и центральноев-ропейской (70725 - Орловская обл.) группам. Все изученные культуры вида F. culmorum были отнесены к 3-АДОН-хемотипу. Считается, что для F. culmorum характерны лишь два из трех известных В-хемотипов - 3-АДОН и НИВ, при этом 3-АДОН существенно более распространен [61, 64], что подтверждено в настоящей работе. Штамм F. ussurianum 29813, представляющий 3-АДОН-хемотип, продуцировал наибольшие количества ДОН из всех проанализированных культур. Принадлежность штаммов F. cerealis к НИВ-хемотипу также соответствует данным [68]. Мы считаем, что результаты, полученные в настоящей работе, позволяют частично восполнить отсутствие в Европейской базе данных сведений о хемотипах штаммов из некоторых регионов России. Так, впервые охарактеризованы штаммы из Волго-Вятского региона (№ 10-12) и Западной Сибири, а также граничащей с ней Костанайской области Казахстана (№ 7, 16).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты настоящей работы имеют как фундаментальное, так и прикладное значение.
Фундаментальное значение определяется существенным расширением сведений о молекулярно-генетическом разнообразии трихотеценпроду-цирующих штаммов рода Fusarium различного происхождения, представляющих различные регионы России. Применение комплексного подхода, сочетающего классическое исследование морфологических структур с анализом высокоинформативных ДНК-маркеров, позволило подтвердить и уточнить видовую принадлежность ряда коллекционных образцов, в частности, впервые обнаружить на территории России штамм F. commune. Впервые для филогенетических исследований использован ген TRI14, анализ которого выявил, с одной стороны, высокий уровень меж- и внутривидового полиморфизма, а с другой, необходимость дальнейшего изучения его структуры и функций, которые позволили бы лучше понять его роль в процессах патогенеза и биосинтеза микотоксинов. Прикладная значимость работы обусловлена возможностью использования изученных маркеров для разработки систем мониторинга зара-
женности продуктов питания продуцентами ТрМТ. Комбинированное исследование принадлежности продуцентов ТрМТ типа В к основным хемотипам с помощью специфической ПЦР и ВЭЖХ позволило оценить их распространенность на территории России, в том числе в регионах, где ранее не находили продуцентов ТрМТ. •
Коллектив авторов выражает благодарность
Т.Ю. Гагкаевой (ФГБНУ ВИЗР) за ценные комментарии, касающиеся морфологической характеристики исследуемых штаммов.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 15-29-02527 (Л.С., С.З.; подбор коллекционных образцов, филогенетический анализ генов TEFla и TRI5, микроскопия) и 16-34-01369 (А.С.; структурный и филогенетический анализ гена TRI14, исследование токсинообразующей способности штаммов методом ВЭЖХ).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Moretti A., Susca A., Mule G., Logrieco A.F., Proctor R.H. // Int. J. Food Microbiol. 2013. V. 167. P. 57-66.
2. Ueno Y. // Adv. Food Nutr. Res. 1989. V. 3. P. 301-305.
3. Desjardins A.E. Fusarium mycotoxins: chemistry, genetics and biology. APS Press, St. Paul, Minnesota, 2006.
4. Grovey J.F. / The trichothecenes and their biosynthesis. // Progress in the Chemistry of Organic Natural Products. Eds Herz W., Falk H., Kirby G.W. Vienna: Springer-Verlag, 2007. P. 63-130.
5. McCormick S.P., Stanley A.M., Stover N.A., Alexander N.J. // Toxins. 2011. V. 3. P. 802-814.
6. Nesic K., Ivanovic S., Nesic V. // Rev. Environ. Contam. Toxicol. 2014. V. 228. P. 101-120.
7. Kelly A., Proctor R.H., Belzile F., Chulze S.N., Clear R.M., Cowger C., Elmer W., Lee T., Obanor F., Waalwijk C., Ward T. J. // Fungal Genet. Biol. 2016. V. 95. P. 39-48.
8. Varga E., Wiesenberger G., Hametner C., Ward T.J., Dong Y., Schöfbeck D., McCormick S., Broz K., Stückler R., Schuhmacher R., et al. // Environ. Microbiol. 2015. V. 17. № 8.
P. 2588-2600.
9. O'Donnell K., Kistler H.C., Tacke B.K., Casper H.H. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 7905-7910.
10. O'Donnell K., Ward T.J., Geiser D.M., Kistler H.C., Aoki T. // Fungal Genet. Biol. 2004. V. 41. P. 600-623.
11. Moss M.O., Thrane U. // Toxicol. Lett. 2004. V. 153. № 1. P. 23-28.
12. Brown D.W., Dyer R.B., McCormick S.P., Kendra D.F., Plattner R.D. // Fungal Genet. Biol. 2004. V. 41. P. 454-462.
13. Alexander N.J., McCormick S.P., Waalwijk C., van der Lee T., Proctor R.H. // Fungal Genet. Biol. 2011. V. 48. № 5. P. 485-495.
14. Nasmith C.G., Walkowiak S., Wang L., Leung W.W.Y., Gong Y., Johnston A., Harris L.J., Guttman D.S., Subramaniam R. // PLoS Pathog. 2011. V. 7. № 9. e1002266.
15. Cundliffe E., Cannon M., Davies J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. V. 71. № 1. P. 30-34.
16. Dyer R.B., Plattner R.D., Kendra D.F., Brown D.R. // J. Agric. Food Chem. 2005. V. 53. P. 9281-9287.
17. Paran I., Michelmore R.W. // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 85. № 8. P. 985-993.
18. Starkey D.E., Ward T.J., Aoki T., Gale L.R., Kistler H.C., Geiser D.M., Suga H., Toth B., Varga J., O'Donnell K. // Fungal Genet. Biol. 2007. V. 44. P. 1191-1204.
19. Aoki T., Ward T.J., Kistler H.C., O'Donnell K. // JSM Mycotoxins. 2012. V. 62. P. 91-102.
20. Obanor F., Erginbas-Orakci G., Tunali B., Nicol J.M., Chakraborty S. // Fungal Biol. 2010. V. 114. P. 753-765.
21. Scott J.B., Chakraborty S. // Mycol. Res. 2006. V. 110. P. 1413-1425.
22. Yli-Mattila T., Gagkaeva T., Ward T.J., Aoki T., Kistler H.C., O'Donnell K. // Mycologia. 2009. V. 101. № 6. P. 841-852.
23. Yli-Mattila T., Ward T.J., O'Donnell K., Proctor R.H., Burkin A.A., Kononenko G.P., Gavrilova O.P., Aoki T., McCormick S.P., Gagkaeva T.Yu. // Int. J. Food Microbiol. 2011. V. 147. P. 58-68.
24. O'Donnell K., Sutton D.A., Rinaldi M.G., Gueidan C., Crous P.W., Geiser D.M. // J. Clin. Microbiol. 2009. V. 47. P. 3851-3861.
25. Fernandez-Ortuno D., Waalwijk C., van der Lee T., Fan J., Atkins S., West J.S., Fraaije B.A. // Int. J. Food Microbiol. 2013. V. 166. P. 148-154.
26. Nicolaisen M., Surponiene S., Nielsen L.K., Lazzaro I., Spliid N.H., Justensen A.F. // J. Microbiol. Meth. 2009. V. 76. P. 234-240.
27. Stakheev A.A., Ryazantsev D.Yu., Gagkaeva T.Yu., Zavriev S.K. // Food Control. 2011. V. 22. P. 462-468.
28. Stakheev A.A., Khairulina D.R., Zavriev S.K. // Int. J. Food Microbiol. 2016. V. 225. P. 27-37.
29. Yli-Mattila T., Nayaka S.C., Venkataramana M., Yörük E. // Methods Mol. Biol. 2017. V. 1542. P. 269-291.
30. Walkowiak S., Rowland O., Rodrigue N., Subramaniam R. // BMC Genomics. 2016. V. 17. P. 1014.
31. Lys0e E., Frandsen R.J.N., Divon H.H., Terzi V., Orru L., Lamontanara A., Kolseth A.-K., Nielsen K.F., Thrane U. // Int. J. Food Microbiol. 2016. V. 221. P. 29-36.
32. Al-Hatmi A.M.S., van den Ende A.H.G.G., Stielow J.B., van Diepeningen A.D., Seifert K.A., McCormick W., Assabgui R., Gräfenhan T., de Hoog G.S., Levesque C.A. // Fungal Biol. 2016. V. 120. P. 231-245.
33. Nirmaladevi D., Venkataramana M., Srivastava R.K., Up-palapati S.R., Gupta V.K., Yli-Mattila T., Clement Tsui K.M., Srinivas C., Niranjana S.R., Chandra N.S. // Sci. Rep. 2016. V. 6. P. 21367.
34. Schoch C.L., Seifert K.A., Huhndorf S., Robert V., Spouge J.L., Levesque C.A., Chen W., Fungal Barcoding Consortium. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109. P. 6241-6246.
35. O'Donnell K., Cigelnik E. // Mol. Phylogenet. Evol. 1997. V. 7. № 1. P. 103-116.
36. Kristensen R., Torp M., Kosiak B., Holst-Jensen A. // Mycol. Res. 2005. V. 109. № 2. P. 173-186.
37. Geiser D.M., Jimenez-Case M., Kang S., Makalowska I., Ve-erararaghavan N., Ward T., Zhang N., Kuldau G.A., O'Donnell K. // Eur. J. Plant Pathol. 2004. V. 110. P. 473-479.
38. Niessen L., Schmidt H., Vogel R.F. // Int. J. Food Microbiol. 2004. V. 95. P. 305-319.
39. St^pien L., Gromadzka K., Chelkowski J. // J. Appl. Genet. 2012. V. 53. P. 227-236.
40. Villani A., Moretti A., De Saeger S., Han Z., Di Mavungu J.D., Soares C.M.G., Proctor R.H., Venancio A., Lima N., Stea G., et al. // Int. J. Food Microbiol. 2016. V. 234. P. 24-35.
41. Menke J., Dong Y., Kistler H.C. // Mol. Plant Microbe In. 2012. V. 25. № 11. P. 1408-1418.
42. Nielsen L.K., Jensen J.D., Rodriguez A., Jorgensen L.N., Justensen A.F. // Int. J. Food Microbiol. 2012. V. 157. P. 384-392.
43. Wachowska U., Packa D., Wiwart M. // Toxins. 2017. V. 9. № 12. P. 408.
44. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. // Nucl. Acids Res. 1994. V. 22. P. 4673-4680.
45. Nei M., Kumar S. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York: Oxford University Press, 2000.
46. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. // Mol. Biol. Evol. 2011. V. 28. № 10. P. 2731-2739.
47. Rozas J., Ferrer-Mata A., Sánchez-DelBarrio J.C., Guirao-Rico S., Librado P., Ramos-Onsins S.E., Sánchez-Gracia A. // Mol. Biol. Evol. 2017. V. 34. № 12. P. 3299-3302.
48. Ward T.J., Bielawski J.P., Kistler H.C., Sullivan E., O'Donnell K. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 9278-9283.
49. Wang J.H., Li H.-P., Qu B., Zhang J.-B., Huang T., Chen F.-F., Liao Y.-C. // Int. J. Mol. Sci. 2008. V. 9. P. 2495-2504.
50. Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M.W., Shipley G.L., Vandesompele J., Wittwer C.T. // Clin. Chem. 2009. V. 55.
P. 611-622.
51. Farber J.M., Sanders G.W. // Appl. Environ. Microbiol. 1986. V. 51. № 2. P. 381-384.
52. Gupta V.K., Chattopadhyay P., Kalita M.C., Chaurasia A.K., Gogoi H.K., Singh L. // Pharm. Methods. 2011. V. 2. № 1.
P. 25-29.
53. Han Z., Tangni E.K., Huybrechts B., Munaut F., Scauflaire J., Wu A., Callebaut A. // Mycotoxin Res. 2014. V. 30. P. 231-240.
54. Leslie J.F., Summerell B.A. The Fusarium laboratory manual. Blackwell Publ.,, 2006. P. 266-267.
55. Skovgaard K., Rosendahl S., O'Donnell K., Hirenberh H.I. // Mycologia. 2003. V. 95. P. 630-636.
56. Zhu Z., Zheng L., Pan L. // Plant Disease. 2014. V. 98. № 7. P. 977-987.
57. Marin P., Moretti A., Ritieni A., Jurado M., Vazquez C., Teresa Gonzalez-Jaen M. // Food Microbiol. 2012. V. 31. P. 229-237.
58. Bakan B., Giraud-Delville C., Pinson L., Richard-Molard D., Fournier E., Brygoo Y. // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. № 11. P. 5472-5479.
59. Kulik T., Pszczolkowska A., Lojko M. // Int. J. Mol. Sci. 2011. V. 12. P. 5626-5640.
60. Pan D., Mionetto A., Calero N., Reynoso M.M., Torres A., Bettucci L. // Gen. Mol. Res. 2016. V. 15. № 1. 15017270.
61. Laraba I., Boureghda H., Abdallah N., Bouaicha O., Obanor F., Moretti A., Geiser D.M., Kim H.-S., McCormick S.P., Proctor R.H., et al. // Fungal Genet. Biol. 2017. V. 103. P. 34-41.
62. Yli-Mattila T., Rämö S., Hietaniemi V., Hussien T., Carlobos-Lopez A.L., Cumagun C.J.R. // Microorganisms. 2013. V. 1.
P. 162-174.
63. Surponiene S., Sakalauskas S., Mankeviciene A., Barcaus-kaite K., Jonaviciene A. // Zemdirbyste-Agriculture. 2016. V. 103. № 3. P. 281-287.
64. Pasquali M., Beyer M., Logrieco A., Audenaert K., Balmas V., Basler R., Boutigny A.L., Chrpova J., Czembor E., Gagkaeva T., et al. // Front. Microbiol. 2016. V. 7. P. 406.
65. Kulik T., Busko M., Bilska K., Ostrowska-Kolodziejczak A., van Diepeningen A.D., Perkowski J., Steinglein S. // Toxins. 2016. V. 8. № 11. 330.
66. Covarelli L., Beccari G., Prodi A., Generotti S., Etruschi F., Juan C., Ferrer E., Manes J. // J. Sci. Food Agric. 2014. V. 95. P. 540-551.
67. Pasquali M., Giraud F., Brochot C., Cocco E., Hoffmann L., Bohn T. // Int. J. Food Microbiol. 2010. V. 137. P. 246-253.
68. Amarasinghe C.C., Tittlemier S.A., Fernando W.G.D. // Plant Pathol. 2015. V. 64. № 4. P. 988-995.
