CC BY
33
ISSN 0202-5493.МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып.1 (150), 2012
С.А. Рамазанова,
кандидат биологических наук
Т.С. Антонова,
доктор биологических наук
М.В. Ивебор,
кандидат сельскохозяйственных наук
Е.А. Стрельников,
младший научный сотрудник
ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. Филатова, д. 17
тел. (861) 275-86-53 e-mail: antonova-ts@mail. га
ВНУТРИРАСОВЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛОЖНОЙ МУЧНИСТОЙ РОСЫ ПОДСОЛНЕЧНИКА ПО SNP-ЛОКУСАМ ДНК
Ключевые слова: ложная мучнистая роса подсолнечника, Plasmopara halstedii, раса, молекулярные маркеры, ДНК, SNPs, ПЦР, CAPS
УДК 633.72:632.11:581.1
Оомицет Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni - возбудитель одного из наиболее вредоносных заболеваний подсолнечника - ложной мучнистой росы. Самый эффективный метод контроля паразита - введение доминантных генов устойчивости к нему в растение-хозяина. Однако, как показала практика, в популяции P. halstedii происходят постоянные изменения вирулентности возбудителя болезни, что приводит к преодолению им устойчивости. Если впервые о наличии у
патогена двух физиологических рас заявили в 70-е годы прошлого столетия [1], в конце 90-х их было выявлено 17 [2], то уже к 2007 г. в мире их идентифицировано не менее 36 [3].
Мониторинг состояния популяции Р. каЫеёп в конкретном регионе позволяет констатировать наличие в нем тех или иных рас, выявлять появление новых. Для этого достаточны классические фи-топатологические методы. Однако с их помощью не всегда можно отследить активность эволюционных процессов, происходящих в популяции патогена.
В лаборатории иммунитета и электрофореза ВНИИМК была начата работа по поиску молекулярных маркеров, позволяющих идентифицировать расы Р. ЪаЫ-1еёп. Исследования показали, что самыми перспективными для дифференциации рас патогена являются маркеры, основанные на тестировании однонуклеотидных замен ^ЫР) [4; 5]. Поэтому целью нашей работы было оценить внутрирасовый полиморфизм SNP-локусов ДНК пригодных для идентификации
Материалы и методы. Материалом для исследований послужили 76 полевых изолятов возбудителя ложной мучнистой росы трех рас 730, 330, 710. Расовую принадлежность изолятов определяли по общепринятой международной методике [6]. Искусственное заражение линий-дифференциаторов подсолнечника осуществляли путем погружения корней проростков в инокулюм зооспор [7].
ДНК выделяли из соскобов кони-диального спороношения Р. каЫеёп и из тканей пораженных семядольных листьев подсолнечника с применением модифицированного СТАВ-метода [8].
Для реакции амплификации были использованы праймеры, фланкирующие участок ДНК с единичной нуклеотидной заменой ^ОТ-локусы) (табл. 1) [5; 9]. ПЦР выполняли в реакционной смеси (25 мкл) следующего состава: 67 мМ Трис-НС1, рН 8,8; 16,6 мM сульфата аммония; 1,5-3,0 мМ М§СЬ; 0,01 % Tween 20; по 0,2 мМ дезоксирибонуклеозидфос-фатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинант-
ной термостабильной ДНК-полимеразы («ГосНИИгенетика», Россия). Реакции проводили в амплификаторе «Терцик» («АО ДНК-технология», Россия) при следующих температурных режимах: начальная денатурация при 96° С в течение 4 минут, далее 38 циклов с последовательной сменой температур.
Для выявления мутаций в локусе Pha74 был проведен электрофорез в агарозном геле, а для локусов Pha6, Pha54, Pha56, Pha82 и Pha99 использовали CAPS-анализ, т.е. расщепление амплифициро-ванных фрагментов ДНК эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами) с последующим электрофорезом в агарозном геле. В работе использовали эндонуклеазы рестрикции фирмы Fermentas, представленные в таблице 1. Рестриктную обработку
Таблица 1 Характеристика пар праймеров
продуктов амплификации в количестве 10 мкл проводили в буферных растворах и согласно инструкциям, прилагаемым фирмой производителем к каждой эндо-нуклеазе рестрикции. Время инкубации для всех рестриктаз - 3 ч при температуре
37 °С. Электрофорез продуктов рестрикции проводили в 2 %-ном агарозном геле на основе ТАЕ буфера при напряжении 90100 V и силе тока 50 А, в течение 1,5 ч. Гели окрашивали бромистым этидием. Визуализацию проводили с использованием гель-документирующей системы Bio-Print.
Результаты и обсуждение. Среди изученных полевых изолятов P. halstedii большее их количество (34) принадлежало расе 330, которая является одной из наиболее распространенных на Юге Российской Федерации [10]. Изоляты этой расы были собраны на полях ВНИИМК и в разных районах Краснодарского края и Ростовской области. Также были использованы два изолята из Испании и США, любезно предоставленные нам французскими коллегами (INRA, UMR santé Veg-tale INRA-ENITA). Проведенный CAPS-анализ показал незначительную внутри-расовую изменчивость. По локусам Pha74, Pha6 и Pha99 не выявлено внутрирасовой изменчивости (табл. 2). По локусу Pha54 отличились два образца - № 2, собранный с поля ВНИИМК, и № 33 из Испании. В отличие от остальных образцов, у них обнаружен аллель 2. Это значит, что в последовательности ДНК данного локуса у этих изолятов в сайте рестрикции обнаружена мутация (замена одного нуклеотида).
По локусу Fha82 выделился изолят под номером 15. Здесь, наоборот, изменения в сайте рестрикции приводят к тому, что рестриктаза «не узнает» последовательности, и разрезание не происходит.
Были выявлены также два изолята -№ 13 и № 17, отличающиеся по локусу Pha56. У образца № 6 обнаружены оба ал-леля (табл. 2). Наличие в образце ДНК обоих аллелей, скорее всего, связано с тем, что здесь, по-видимому, присутствует смесь рас. В целом, из 34 изолятов расы 330, выявлено лишь 5, отличающихся ал-лельным состоянием трёх SNP-локусов от остальных. Возможно, что отличающиеся изоляты имеют другую расовую принадлежность, либо это редкие единичные мутации, которые периодически возникают и исчезают в популяциях.
Ло-кус Номер в базе данных (Genbank) Нуклеотидная последовательность Эндо-нук-леаза рестрикции Сайт рестрикции
Pha74 CB 174642 F: ACCTCGCATG GTTGCTTTAC R: TTGCTATTTCG GCCTACTGG - -
Pha6 CB 174585 F: GTCGCTGATTTT ATGTTTATGTGC R: TACTACCTCAGT CACATCATCACC NmuCI (Tsp45I) 5'-GTSAC-3'
Pha54 CB 174708 F: ATTTGGCAACGT CTCAGAGC RCCATCGTAATAAC ATTCTTTAAAGTCC SmuI (FauI) 5'-CCCGC(N)4-3'
Pha56 CB 174714 F: GCGGTACTGG TCTATGTGCTG R: TTCAAGAAGTT TGATTTTTCATGC OliI (AleI) 5'-CACNNNNGTG-3'
Pha82 CB 174573 F: ACTCGATCCAT GCAGTAAGTAAG R: AGGAGGCTT TGCAGATGAA BveI (BspMI) 5'-ACCTGC(N)4-3'
Pha99 CB 174703 F:CTCGCATTCA AACGGAAAAT R: CAAGCCAAC TGTGCAATGAAT BseMI (Bsr DI) 5 ' -GCAATGNN-3 '
Таблица 2
Аллельное состояние изолятов расы 330 по SNP-локусам ДНК
№ п/п Хозяин Место сбора изолята* Локус
РЬа74 РЬа6 РЬа54 РЬа82 РЬа56 РЬа99
1 Неизвестный Поля ВНИИМК 2 2 1 2 2 1
2 Неизвестный -//- 2 2 2 2 2 1
3 РЯ64Л83 Выселковский р-н 2 2 1 2 2 1
4 Родник Каневской р-н 2 2 1 2 2 1
5 Мастер -//- 2 2 1 2 2 1
6 Смесь с разных хозяев - 2 2 1 2 1,2 1
7 Флагман 2 2 1 2 2 1
8 Мастер 2 2 1 2 2 1
9 ВК680 Поля ВНИИМК 2 2 1 2 2 1
10 Неизвестный -//- 2 2 1 2 2 1
11 Родник Каневской р-н 2 2 1 2 2 1
12 Арена -//- 2 2 1 2 2 1
13 ВК678 Поля ВНИИМК 2 2 1 2 1 1
14 ВК678 -//- 2 2 1 2 2 1
15 СПК Крыловской р-н 2 2 1 1 2 1
16 СПК -//- 2 2 1 2 2 1
17 Неизвестный Поля ВНИИМК 2 2 1 2 1 1
18 ВК680 2 2 1 2 2 1
19 Родник -//- 2 2 1 2 2 1
20 Флагман Каневской р-н 2 2 1 2 2 1
21 Родник Поля ВНИИМК 2 2 1 2 2 1
22 Родник -//- 2 2 1 2 2 1
23 Арена Каневской р-н 2 2 1 2 2 1
24 Донской крупноплодный Куйбышевский р-н Ростовской области 2 2 1 2 2 1
25 Донской крупноплодный 2 2 1 2 2 1
26 ВК680 Поля ВНИИМК 2 2 1 2 2 1
27 Родник -//- 2 2 1 2 2 1
28 ВК653 Кавказский р-н 2 2 1 2 2 1
29 Мастер Каневской р-н 2 2 1 2 2 1
30 Мастер -//- 2 2 1 2 2 1
31 Арена -//- 2 2 1 2 2 1
32 Неизвестный Поля ВНИИМК 2 2 1 2 2 1
33 Неизвестный Испания 2 2 2 2 2 1
34 Неизвестный США 2 2 1 2 2 1
*Все изоляты собраны в Краснодарском крае за исключением № 24, № 33, № 34
Аналогично, по SNP-локусам были изучены 19 изолятов расы 730. Для изо-лятов этой расы, также не было обнаружено полиморфизма по трем локусам Pha74, Pha6 и Pha99. По локусу Pha54 были выделены образцы, отличающиеся аллельным состоянием от большинства. Это четыре изолята из Краснодарского края и один французский; у них обнаружен аллель 2, тогда как у остальных присутствует аллель 1 (табл. 3). Следует отметить, что из четырех отличившихся образцов, три были собраны в Выселков-ском районе на поле с распространенностью болезни порядка 40 %. При этом раса 730 была доминирующей в этом аг-роценозе, в отличие от большинства других исследованных в Краснодарском крае: почти повсеместно преобладала раса 330. Изолят № 7 с этого же поля отличался по локусу Pha56 (табл. 3).
Таблица 3
Аллельное состояние изолятов расы 730 по 8ИР-локусам ДНК
Изоляты расы 710 оказались почти все одинаковы по аллельному состоянию SNP-локусов. Только один изолят под номером 18, собранный в Тбилисском
районе с неизвестного генотипа подсолнечника, отличался от остальных по ло-кусу Pha54. Возможно, этот образец представляет собой расу 730, ошибочно определённую как раса 710. А по локусу Pha82 у изолята № 9 обнаружено два ал-леля; возможно, он представляет собой смесь рас.
Таблица 4
Аллельное состояние изолятов расы 710 по SNP-локусам ДНК
№ п/п Хозяин Место сбора изолята* Локус
Pha Pha Pha Pha Pha Pha
74 6 54 82 56 99
1 PR64A83 Высел-
ковский р-н 2 2 2 2 2 1
2 Неизвестный Каневской р-н 2 2 2 2 2 1
3 Родник Высел-
ковский р-н 2 2 2 2 2 1
4 Неизвестный Поля
ВНИИМК 2 2 2 2 2 1
5 Родник Высел-
ковский р-н 2 2 2 2 2 1
6 Круиз Поля
ВНИИМК 2 2 2 2 2 1
7 Круиз -//- 2 2 2 2 2 1
8 Круиз 2 2 2 2 2 1
9 Круиз 2 2 2 1,2 2 1
10 Круиз 2 2 2 2 2 1
11 Круиз -//- 2 2 2 2 2 1
12 Родник Высел-
ковский р-н 2 2 2 2 2 1
13 Неизвестный Поля
ВНИИМК 2 2 2 2 2 1
14 Родник Высел-
ковский р-н 2 2 2 2 2 1
15 Родник -//- 2 2 2 2 2 1
16 Родник 2 2 2 2 2 1
17 Родник -//- 2 2 2 2 2 1
18 Неизвестный Кавказский р-
н 2 2 1 2 2 1
19 Родник Поля
ВНИИМК 2 2 2 2 2 1
20 Родник Выселковский
р-н 2 2 2 2 2 1
21 Неизвестный Поля
ВНИИМК 2 2 2 2 2 1
22 Неизвестный -//- 2 2 2 2 2 1
23 Неизвестный Франция 2 2 2 2 2 1
*Все изоляты собраны в Краснодарском крае за исключением № 23
Как видно из результатов исследования, среди изолятов всех изученных рас выявлена некоторая неоднородность. В процентном соотношении внутрирасовый полиморфизм шести SNP-локусов составил: у расы 330 - 14,7 %, 730 - 31,6 %, 710 - 8,7 %. Возможно, эта неоднородность связана с неточностью определения расовой принадлежности отличившихся
№ п/п Хозяин Место сбора изолята* Локус
Pha 74 Pha 6 Pha 54 Pha 82 Pha 56 Pha 99
1 Родник Выселковский р-н 2 2 1 2 2 1
2 ВК678 Поля ВНИИМК 2 2 1 2 2 1
3 Родник Выселковский р-н 2 2 1 2 2 1
4 Родник -//- 2 2 2 2 2 1
5 Родник 2 2 1 2 2 1
6 Родник 2 2 2 2 2 1
7 Родник 2 2 1 2 1 1
8 Родник -//- 2 2 2 2 2 1
9 ВК678 Поля ВНИИМК 2 2 1 2 2 1
10 Круиз -//- 2 2 1 2 2 1
11 Круиз 2 2 1 2 2 1
12 Круиз 2 2 1 2 2 1
13 Круиз 2 2 1 2 2 1
14 Неизвестный 2 2 2 2 2 1
15 680хМастер -//- 2 2 1 2 2 1
16 Флагман Каневской р-н 2 2 1 2 2 1
17 РМ 17 Лабинский р-н 2 2 1 2 2 1
18 Родник Поля ВНИИМК 2 2 1 2 2 1
19 Неизвестный Франция 2 2 2 2 2 1
*Все изоляты собраны в Краснодарском крае за исключением № 19
изолятов P. halstedii с помощью стандартного набора линий-дифференциаторов подсолнечника. Для более четкой идентификации этот набор необходимо дополнить другими линиями-дифференциаторами. Проблема в настоящее время активно обсуждается исследователями из разных стран, занимающимися изучением данного патогена.
Как оказалось, наибольший внутрирас-овый полиморфизм выявлен у расы 730. Каждый из ее изолятов был повторно испытан на соответствующих линиях-дифференциаторах подсолнечника, с целью исключения возможного смешения в одном образце рас 330 и 710. Поэтому встречаемость у образцов ДНК расы 730 аллелей, свойственных как расе 330, так и расе 710, мы рассматриваем как свидетельство в пользу высказанного ранее [11] предположения, что биотип 730 является гибридом этих двух рас.
Таким образом, изученные изоляты рас P. halstedii 330 и 710 показали высокую степень однородности в 6 SNP-локусах ДНК. Незначительная изменчивость в трёх локусах Pha54, Pha56 и Pha82 может быть связана с погрешностями в определении рас с помощью стандартного набора линий-дифференциаторов подсолнечника. Изменчивость расы 730 в локусе Pha54 более значительная. Она имеет аллели, свойственные как расе 330, так и расе 710. Это может свидетельствовать о её происхождении от гибридизации этих двух рас.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, грант №11-04-96501
Список литературы
1. Zimmer, D.E. Physiological specili-zaion between races of Plasmopara halstedii in America and Europe / D.E. Zimmer // Phytopatology. - 1974. - V. 64. - P. 1465-1467.
2. Tourvieille de Labrouhe, D. A new race of Plasmopara halstedii, pathogen of sunflower downy mildew / D. Tourvieille de
Labrouhe, S. Lafon, P. Walser, I. Raulic // Oleagineux. - 2000. - V. 7. - P. 404-405.
3. Gulya, T.J. Distribution Plasmopara halstedii races from sunflower around the world / T.J. Gulya // Proceedings of the 2nd internacional Downy Mildews symposium. Advances in downy mildew re-search.Palacky University in Olomouc and JOLA vos., Kostelec na HanI (Gzech Republic). - 2007. - № 3. - P. 121-134.
4. Delmotte, F. EST-derivd markers highlight genetic relationships among Plasmo-para halstedii French races / F. Delmotte, X. Giresse, S. Richard-Cervera, F. Vear, J. Tourvieille et al. // Proc. 17th international Sanflower conference. - Cordoba, Spain. -2008. - P. 187-192.
5. Рамазанова, С.А. Внутривидовой полиморфизм Plasmopara halstedii, выявляемые SNP-маркерами / С. А. Рамазанова, Т.С. Антонова, М.В. Ивебор, Е.А. Стрельников, С.З. Гучетль // Масличные культуры: Науч.-техн. бюл. ВНИИМК. -2011. - Вып. 2 (148-149). - С. 141-145.
6. Tourvieille de Labrouhe, D. New nomenclature of Race of Plasmopara halstedii (Sunflower Downy Mildew) / D. Tourvieille de Labrouhe, T.J. Gulya, Y.K. Rashid, F. Viranyi // In: 15th International Sunflower Conference, Toulouse, France. - 2000. - V. 2.
- P. 161-166.
7. Антонова, Т.С. К вопросу о расовой принадлежности возбудителя ложной мучнистой росы на подсолнечнике на северном Кавказе / Т.С. Антонова, Н.М. Арасланова, А.В. Головин, Т. А. Челюст-никова, С.Л. Саукова // Научно-технический бюллетень ВНИИМК. - 2000. -Вып. 123. - С. 16-20.
8. Zolan, M.E. Inheritance of DNA methylation in Corpinus cinereous / M.E. Zolan, P.J. Pukkila // Mol. Cell Biol. - 1986.
- V. 6. - № 1. - Р. 195-200.
9. Рамазанова, С.А. Дифференциация изолятов возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника на основе SNP-мар-керов / С.А. Рамазанова, Т.С. Антонова, М.В. Ивебор // Масличные культуры:
ISSN 0202-5493.МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып.1 (150), 2012
Науч.-техн. бюл. ВНИИМК. - 2011. -Вып. 1(146-147). - С. 122-126.
10. Ивебор, М.В. Новые расы Plasmopara halstedii - возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника на Северном Кавказе / М.В. Ивебор, Н.М. Арасланова, Т.С. Антонова // Наука Кубани. - 2005. -№ 2. - С. 162-164.
11. Гучетль, С.З. Внутривидовой полиморфизм возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника, выявляемый молекулярными маркерами / С.З. Гучетль, Т.С. Антонова, Т.А. Челюстникова, С.А. Рамаза-нова, Н.М. Арасланова // Сельскохозяйственная биология. - 2010. - № 5. - С. 55-60.
