CC BY
109
Т. С. Антонова,
доктор биологических наук
Н. М. Арасланова, кандидат сельскохозяйственных наук М. В. Ивебор,
аспирант
С. З. Гучетль,
кандидат биологических наук
Т. А. Челюстникова,
старший научный сотрудник
С. А. Рамазанова,
аспирантка ВНИИ масличных культур
НОВЫЕ РАСЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛОЖНОЙ МУЧНИСТОЙ РОСЫ ПОДСОЛНЕЧНИКА НА СЕВЕРНОМ КАВКАЗЕ
УДК 633.854.78:632(470.6)
Ложная мучнистая роса или милдью, вызываемая облигатным грибным паразитом Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni (синоним Plasmopara helianthi Novot.), - одно из наиболее вредоносных заболеваний подсолнечника и в благоприятные для гриба годы может приводить к значительным потерям урожая. В мире насчитывается до 17 патотипов возбудителя, но общепризнано 11 рас, из которых 9 имеются в Европе.
До начала 80-х годов прошлого века считалось, что на территории России распространена европейская раса 100 [1]*. Однако сорта подсолнечника, имевшие устойчивость к ней, стали поражаться в то время в Краснодарском крае (Тихонов, Зайчук, 1984). С созданием линий-дифференциаторов подсолнечника, с помощью которых можно было дифференцировать патотипы патогена, были обнаружены в Краснодарском крае расы 310 [6] и 330 [7, 9], из которых первая встречалась спорадически, а вторая повсеместно (Антонова и др., 1998). Известно, что кроме Северо-Кавказского региона, были выявлены в Белгородской области расы: 100 [1], 300 [2], 730 [4], 310 [6] (Якуткин, Ахтулова, 2002).
С началом 90-х, когда в Россию начали завозить семенную продукцию подсолнечника иностранных фирм: Франции, Испании, США и др. стала высока вероятность ввоза новых рас патогена с семенами из-за рубежа. К этому следует добавить, что с середины 90-х в некоторых странах, активно возделывающих подсолнечник, появились патотипы возбудителя болезни, устойчивые к действию металаксила (Albourie et al., 1998; Gulya, 2000; Molinero Ruiz et al., 2000). Там произошла адаптация патогена к токсическому действию апрона. Сложившаяся ситуация требует контроля над вирулентностью рас возбудителя болезни в районах возделывания подсолнечника в России.
Целью данной работы было идентифицировать в соответствии с международной классификацией коллекцию изолятов возбудителя ложной мучнистой росы, собранных с подсолнечника в некоторых районах Северного Кавказа в 2004-2005 гг.
Материал и методы исследований. Листья больных растений подсолнечника со спороношением патогена собирали в указанных районах (табл. 1) и для сохранения подвергали быстрому глубокому замораживанию до -80 ОС.
Семянки трёх тест-наборов линий-дифференциаторов подсолнечника, которые с 2000 года используются как международный стандарт для определения патотипов возбудителя ложной мучнистой росы, проращивали при температуре 25 ОС в рулонах фильтровальной бумаги до размера корешка 1-2 см. Проростки раскладывали рядами в пластмассовые растильни с речным песком, накрытым фильтровальной бумагой по 10 штук каждой линии. Для каждого изолята возбудителя проростки всех девяти линий-
* Приводится новый триплетный код расы, принятый на 15-ой Международной конференции по подсолнечнику в 2000 году (Tourvieille de Labrouhe et al., 2000) и в скобках -старая нумерация.
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень
Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур 2006, вып. 1 (134)
дифференциаторов и один ряд контрольных, сорта ВНИИМК 8883, помещали одновременно в одной растильне. Покрывали корни полосками влажной ваты и фильтровальной бумаги. Готовили суспензию зооспор каждого изолята концентрации 106 в 1 мл путём смыва зооспорангиев с замороженных листьев. Поливали растильни суспензией из расчёта 150 мл в каждую. Выращивали при температуре: 25О днем и 18 ОС ночью в течение 7-9 дней, затем обильно поливали, понижали температуру воздуха до 16 ОС и создавали влажную камеру путем накрытия растилен полиэтиленовой пленкой на ночь. Учитывали наличие спороношения на первой паре настоящих листьев.
При поиске различий между расами на молекулярном уровне методом ПЦР ДНК были использованы 7 полевых изолятов четырех рас, выявленных с помощью линий-дифференциаторов подсолнечника.
ДНК выделяли из конидиального спороношения P. halstedii на семядольных листьях, искусственно зараженных проростков подсолнечника. Для этого использовали метод выделения и очистки (Saghai-Maroof, et al., 1984), модифицированный нами.
Для проведения полимеразной цепной реакции использовали 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 16,6 мМ сульфата аммония; 1,5-3,0 мМ MgCl2; 0,01% Tween 20; по 0,2 мМ дезоксирибонуклеозидфосфатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термостабильной ДНК полимеразы. Амплификацию проводили в приборе «Терцик». Термальный режим реакций подбирали для каждой пары праймеров с учетом их нуклеотидного состава. Электрофорез продуктов амплификации проводили в агарозном геле (2% агароза, 1х ТАЕ-буфер) с использованием камеры для горизонтального электрофореза в течение 1-1,5 часов при I=58 mA, U=90-100 V. Результаты электрофореза документировали при помощи трансиллюминатора и видеосистемы с программным обеспечением Gel Imager.
Результаты и обсуждение. Погодные условия на Северном Кавказе в мае-июне 2004-2005 гг. благоприятствовали заболеванию подсолнечника этой болезнью. Это позволило собрать до 500 изолятов гриба. В табл. 1 показано, какие патотипы возбудителя были обнаружены в обследованных районах. Раса 100 обнаружена пока только в Каневском районе Краснодарского края. Поскольку это самая старая раса, то продолжительная селекция подсолнечника на устойчивость на протяжении около 50 лет должна была привести к её максимальному вытеснению. Вероятно, эта раса будет обнаруживаться спорадически. Повсеместно встречалась раса 330, а в Выселковском районе, кроме неё, выявлены расы 310, 700, 710, 730. В Шовгеновском районе Адыгеи были обнаружены те же патотипы за исключением рас 100 и 310. Раса 310 обнаружена также на полях ВНИИМК и в окрестностях станицы Крыловской Ленинградского района. На полях ВНИИ масличных культур найдена и раса 710. В Ростовской области выявлены расы 710 и 730.
Таблица 1 - Расы возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника, обнаруженные в некоторых районах Северного Кавказа
2004-2005 гг.
Район обнаружения Хозяин патогена Раса патогена
100 (1)* 310 (6) 330 (7) 700 (3) (7 ) 0 (7 ) 0
Краснодар, поля ВНИИМК Селекционный материал ВНИИМК + ** + +
Кавказский (Тбилисская) Сорт Мастер +
Выселковский (Бузиновская) Гибрид Рк64А83 + + + + +
Ленинградский (Крыловская) Сорт Р 453 (Родник) + +
Каневской (Каневская) Сорта Мастер, Флагман + +
Новокубанский (Новокубанск) Линия ВК 276 Б +
Шовгеновский, Адыгея Сорт Мастер + + + +
Миллеровский Ростовской обл. Г ибрид Сигнал + + +
* в скобках обозначена старая номенклатура рас; ** знаком (+) помечено наличие расы в районе
Процентное соотношение рас, выявленных на одном из полей Выселковского района Краснодарского края и одном поле Шовгеновского района Адыгеи, представлено в табл. 2. В выборке изолятов из Выселковского района, составляющей 93 изолята, 60,5 % принадлежит расе 710. Вторая по распространённости раса 330 составила 23,4 %. На третьем и четвёртом месте расы 700 - 11,2 % и 730 - 3,7 %. Реже встречалась раса 310. В выборке из Шовгеновского района из 23 идентифицированных изолятов наибольший процент также принадлежит расе 710.
Таблица 2 - Соотношение (%) рас Р/аэторага На^есИ, поразивших подсолнечник на отдельных полях Краснодарского края и Адыгеи в 2004 году
Месторасположение поля Поражённый хозяин Количество собранных изолятов Раса патогена
310 330 700 710 730
Выселковский р-н Краснодарского края Гибрид PR64A83 93 1,2 23,4 11,2 60,5 3,7
Шовгеновский р-н Адыгеи Сорт Мастер 23 0 13,0 8,7 69,6 8,7
Известно, что, чем выше трёхзначный номер обозначения расы, тем она патогенней (Spring et al., 1994). В свете этого положения следует признать, что на фоне широко распространённой расы 330, которая была выявлена, как повсеместно встречающаяся ещё на рубеже веков, в обследованных районах появились расы высокой патогенности: 700, 710 и 730. Вызывает серьёзную озабоченность преобладание в обеих выборках расы 710. Оценка устойчивости к ней ряда гибридов отечественной и иностранной селекции показала, что большинство их восприимчиво, хотя к расе 330 некоторые имеют устойчивость (табл. 3). Незначительный процент встречаемости расы 310 свидетельствует, что сорта и гибриды, возделываемые в этих регионах, в большинстве своём устойчивы к ней. Это показывают и данные табл. 3.
Таблица 3 - Иммунологическая реакция гибридов подсолнечника
на некоторые расы возбудителя ложной мучнистой росы
Гибрид Раса патогена
310 330 710
Анюта - - +*
ПР 64 А 63 - - -
ЮВС 4 - - +
МАТ 251 - - +
РХ 3 (РН 3) - + +
Одесский 738 - + +
Верхнедонской - + +
Бизон - + +
Юпитер - - +
Примечание: * + - восприимчив, - устойчив
Полученные результаты свидетельствуют о произошедших изменениях в расовом составе популяции Plasmopara halstedii, поражающей подсолнечник на Северном Кавказе, и необходимости более обширной идентификации патогена.
Используя метод ПЦР анализа ДНК с целью выявления различий между расами на молекулярно-генетическом уровне, мы апробировали 11 праймеров для ПЦР, применительно к двум изолятам расы 710 и трём изолятам расы 330. С каждым праймером было также испытано по одному изоляту рас 310 и 700.
Применяли следующие праймеры: PTO; Paw 5,6; Har-432; Har-514; L 14; Y-11; P-28; P-38; YTL; XLRR; Paw 16. Так как конидиальное спороношение для экстракции ДНК P. halstedii было собрано с сорта подсолнечника ВНИИМК 8883, для контроля была использована ДНК подсолнечника этого сорта. Спектры амплифицированной с одинако-
выми праймерами ДНК гриба и подсолнечника всегда различались между собой (рисунок).
Рисунок - Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК с праймером РТО рас Р. Иа^вСНи подсолнечника. Дорожки: 1- раса 710; 3 - раса 330;
5- раса 310; 7-раса 700; 2,4,6- сорт подсолнечника ВНИИМК 8883; 8 - маркер молекулярной массы ДНК 1 кЬ; 9- маркер молекулярной массы ДНК 100 Ьр.
Для выявления межрасовых различий было анализировано по одному изоляту каждой из 4 рас. Использование трех праймеров (Наг-432, Наг-514, Р-38) не давало ам-плифицированных фрагментов ДНК. ДНК расы 310 не амплифицировалась ни с одним из апробированных праймеров. Полиморфные мажорные ДНК фрагменты для рас 330, 700 и 710 были обнаружены только с праймером РТО. Спектры ДНК каждой из рас, полученные с помощью этого праймера, отличались друг от друга (см. рисунок).
Для выявления внутрирасовых различий сравнили 2 изолята расы 710 и 3 изоля-та расы 330. Спектры амплифицированной ДНК по праймеру РТО обоих изолятов расы 710 были одинаковы, так же, как не было различий между спектрами изолятов расы 330. Безусловно, необходимо изучить спектры большего количества изолятов по каждой расе, с большим количеством праймеров, чтобы с определённостью судить о наличии или отсутствии внутрирасовых различий и о величине сходства между ними. Эта работа продолжается. Однако следует подчеркнуть, что праймер РТО оказался пригоден для выявления межрасовых различий Р. Иа&вСИ
До настоящего времени популяция патогена в Северо-Кавказском регионе по молекулярно-генетической структуре не была охарактеризована. В зарубежных странах исследования такого плана проводятся интенсивно, однако ещё много неясных моментов в происхождении рас патогена, выявленных в разных странах. В работе Кот}ай с соавторами (2004), подчеркивается, что очень мало известно о молекулярной природе Р. ЬакЬвсШ и опубликованные данные показывают очень малую вариабельность между патотипами и изолятами. Целью своей работы авторы ставили идентификацию вирулентной структуры локальных популяций Р. Иа^еСИ по двум изоферментным системам -вР1 (глюкозофосфат изомераза) и РвМ (фосфоглюкомутаза) на территории Венгрии и прилегающей к ней части Сербии. В основном полевые изоляты изученных шести рас были гомозиготны и мономорфны по этим признакам.
Roeckel-Drevet с соавторами (1997) был выполнен обширный анализ генетической вариабельности 58 французских изолятов 5 патотипов Р. Иа^вСИ различного географического происхождения. Авторами было тестировано 196 RAPD праймеров методом полимеразной цепной реакции. Полиморфные фрагменты ДНК были обнаружены с 30 праймерами, что составляет лишь 15% от общего числа апробированных. Не было обнаружено внутрирасовой изменчивости. Полиморфные фрагменты были обычно минорными фракциями, мажорные полиморфные фракции выявлены с 6 праймерами. В
описанной работе удалось дифференцировать между собой 5 рас и два изолята, обладающих устойчивостью к металаксилу, но расчетный коэффициент сходства Жаккарда, показал, что изученные изоляты очень сходны - от 88,6 до 99 процентов сходства.
ТоитеШе с соавторами (2000) и Roeckel-Drevet с соавторами (2003) была изучена вариабельность Р. НаЫвСИ из разных стран для определения филогенетических взаимоотношений между всеми известными расами. Ими было собрано 77 изолятов из 12 стран четырех континентов и изучен полиморфизм по 21 RAPD праймеру. Индекс сходства между изолятами составил от 89 до 100%. Обнаруженный полиморфизм был слабый независимо от расы и географического происхождения. По результатам исследований с помощью кластерного анализа авторами были сгруппированы в отдельные кластеры европейские, американские изоляты, и 2 изолята, которые признаны, как имеющие более позднее происхождение. Но их филогения осталась невыясненной из-за ограниченности различий.
Наши исследования являются началом большой, подобной работы по идентификации возбудителя на Северном Кавказе, будут способствовать устранению разрыва в уровне знаний о возбудителе заболевания подсолнечника на юге России и помогут интеграции в международную систему контроля над патогеном.
На протяжении многих лет, до выявления новых рас ложной мучнистой росы, выбор изолятов для испытания селекционного материала на устойчивость к этому патогену, носил случайный характер: для заражения испытуемых образцов использовали смывы зооспор с произвольно собранных на полях больных растений подсолнечника. С выявлением расового разнообразия возбудителя тестирование на устойчивость необходимо проводить, по крайней мере, к наиболее распространённым расам и модифицировать методику оценки устойчивости селекционного материала, применительно к сложившимся условиям. Это позволит определить, какие гены устойчивости присутствуют в анализируемых образцах подсолнечника. Только на этой основе можно будет создавать устойчивые сорта и гибриды.
Контроль над расовым составом популяции любого патогена совершенно необходимое условие для успеха селекции на устойчивость к нему. Кроме того, отслеживание процесса расообразования и соотношения рас в популяции возбудителя болезни дает возможность размещать сорта и гибриды с учетом их устойчивости к биотипу патогена, свойственному данной местности, что позволяет получать урожай с минимальными потерями.
Таким образом, в настоящее время популяция Р1аэторага Иа^вСН на Северном Кавказе неоднородна по составу и содержит 6 рас, среди которых три имеют высокую патогенность, что требует новой стратегии в селекции подсолнечника на устойчивость. Выявлены различия по спектрам ДНК с праймером РТО между четырьмя расами Р. Иа^вСИ, собранными с подсолнечника в Краснодарском крае.
Исследования выполнены при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края, грант № 06-04-96641.
Литература
1. Антонова Т С., Арасланова Н. М., Головин А. В. и др. К вопросу о расовой принадлежности возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника на Северном Кавказе // Научно-техн. бюл. ВНИИМК. - Краснодар, 2000. - Вып. 123. - С. 21-23.
2. Тихонов О. И., Зайчук В. Ф. Новая раса ложной мучнистой росы // Масличные культуры. - 1981. - С. 20.
3. Якуткин В. И., Ахтулова Е. М. Физиологические расы возбудителя ложномучнистой росы подсолнечника в России // Современная микология в России, 1-й съезд микологов России (тез. докл.). - М., 2002. - С. 217-218.
4. Albourie J. М., Tourvieille J., Tourvieille de Labrouhe D. Resistance to metalaxyl in isolates of the sunflower pathogen Plasmopara halstedii // European Journal of Plant Pathology. - 1998. - 104. - P. 235-242.
5. Gulya T. J. Metalaxyl resistance in sunflower downy mildew and control through genetics and alternative fungicides // In: 15th International Sunflower Conference, Toulouse, France. - 2000. - V. 2. - P. 179-184.
6. Komjati H, Bakonyi J., Viranyi F. Isoenzyme analysis: a tool for characterizing subpopulations of Plasmopara halstedii // Proc. 16th International sunflower conference, Fargo, North Dakota, USA. August 29-September 2, 2004. - Vol. 1. - P. 93-97.
7. Molinero Ruiz L., Dominguez J., and Melero-Vera J. M. Evaluation of Spanish isolates of Plasmopara halstedii for tolerance to metalaxyl. // Helia 23. - 2000. - № 33. -P. 33-38.
8. Roeckel-Drevet P., Coelno V., Tourvieille P. et al. Lack of genetic variability in French identified races of Plamopara halstedii, the cause of downy mildew in sunflower Helianthus annuus // Can. J. Microbiol. - 1997. - V. 43. - P. 260-263.
9. Roeckel-Drevet P., Tourvieille J., Gulya T J., Charmet G., Nicolas P., Tourvieille de Labrouhe D. Molecular variability of sunflower downy mildew , Plasmopara halstedii from different continent // Can. J. Microbiol/Rev. Can. J. Microbiol. - 2003. - V. 49(8). - P. 492-502.
10. Spring O. A., Miltner F, Gulya T. J. New races of sunflower downy mildew (Plasmopara halstedii) in Germany // J. Phytopathol. - 1994. - V. 142. - P. 241-244.
11. Tourvieille de Labrouhe D., Gulya T.J., Rashid Y.K., Viranyi F. New nomenclature of Race of Plasmopara halstedii (Sunflower Downy Mildew)// In: 15th International Sunflower Conference, Toulouse, France. - 2000. - V. 2. - P. 161-166.
12. Tourvieille J., Millon J., Roeckel-Drevet P., Nicolas P., Tourvieille de Labrouhe D., Gulya T.J. Molecular variability of Plasmopara halstedii // 15th International sunflower conference, 12-15 June. -Toulouse, France. - 2000. - P. I67-I72.
