CC BY
43
ISSN 0202-5493. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (146-147), 2011
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ИЗОЛЯТОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛОЖНОЙ МУЧНИСТОЙ РОСЫ ПОДСОЛНЕЧНИКА НА ОСНОВЕ SNP-МАРКЕРОВ
С.А. Рамазанова,
кандидат биологических наук
Т.С. Антонова,
доктор биологических наук
М.В. Ивебор,
кандидат сельскохозяйственных наук
ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии Россия, 350038, г. краснодар, ул. Филатова, д. 17 тел. (861) 275-86-53 e-mail: [email protected]
Ключевые слова: ложная мучнистая роса, Plasmopara halstedii, раса, молекулярные маркеры, SNPs, ПЦР, RAPD, SSR
УДК 633.72:632.11:581.1
Заболевание подсолнечника ложной мучнистой росой, вызываемое облигатным грибным патогеном Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de
Toni, является одним из самых вредоносных на подсолнечнике. В настоящее время идентифицировано 36 патотипов патогена [1], описанных с помощью трёхзначной номенклатуры, принятой в 2000 г. [2]. В последние годы в мире активно проводятся исследования по поиску молекулярных маркеров для идентификации рас патогена с целью выявления структуры популяций возбудителя болезни.
Молекулярно-генетические маркеры, в частности ДНК-маркеры, позволяют идентифицировать различные виды и расы грибов, устанавливать между ними филогенетические связи, степень дивергенции разных видов и подвидов, следить за процессом расообразова-ния и процессом обособления рас в отдельные виды. Они равномерно распределены по всему геному, могут относиться как к структурным генам, так и к некодирующим участкам генома, часто имеют кодоминантное наследование, и их проявление не зависит от условий окружающей среды. Все это и обусловило их широкое распространение.
По мере развития ДНК-технологий, появления новых типов ДНК-маркеров ведется и поиск информативных, удобных в применении, высокополиморфных и воспроизводимых маркеров для идентификации рас Plasmopara halstedii. Roeckel-Drevet et al. (1997) была выполнена работа по анализу генетической вариабельности 58 французских изолятов пяти патотипов различного географического происхождения P. halstedii [3]. Авторами было тестировано 196 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) праймеров методом поли-меразной цепной реакции. Полиморфные фрагменты ДНК были обнаружены лишь с 30 (15 %) праймерами. Для выявления внутрира-совых различий использовали 16 праймеров из 30 полиморфных. Изменчивости среди изолятов одной расы обнаружено не было. Для изучения межрасовых различий было использовано всего 75 RAPD праймеров. Полиморфные фрагменты были получены с 25 праймерами. Полученные фрагменты были обычно минорными фракциями, мажорные полиморфные фракции выявлены лишь по 6 праймерам. Им удалось дифференцировать между собой расы 100, 300, 700, 703, 710 и два изолята, обладающих устойчивостью к апрону. Расчетный коэффициент сходства Жаккарда, показал, что изученные изоляты очень сходны - от 88,6 до 99 % сходства.
Roeckel-Drevet et al. [4] была изучена вариабельность P. halstedii на мировом уровне. Ими
было собрано 77 изолятов из 12 стран четырех континентов и изучен полиморфизм по 21 RAPD праймеру. Индекс сходства между изо-лятами составил от 89 до 100 %. Обнаруженный полиморфизм был очень слабым независимо от расы и географического происхождения.
Среди изолятов P. halstedii, собранных в районах Германии, обнаружен полиморфизм, по минисателлитным и микроcателлитным маркерам (SSR - simple-sequence repeat), также не кореллирующий ни с принадлежностью к физиологической расе, ни с географическим происхождением. Вместе с тем праймерные комбинации генерировали амплифицирован-ные фракции, позволяющие отличить один изолят от другого [5].
В лаборатории иммунитета и электрофореза (ВНИИМК) была начата работа по идентификации рас Plasmopara halstedii. Был исследован внутривидовой полиморфизм у 42 изолятов шести рас возбудителя ложной мучнистой росы Plasmopara halstedii, поражающих подсолнечник в Краснодарском крае, выявляемый молекулярными маркерами с применением 36 праймеров (RAPD, SSR, ISSR - inter-simple-sequence repeat) и их комбинаций. Степень полиморфизма была оценена как слабая, поскольку лишь 10 праймеров и праймерных комбинаций выявили полиморфизм. Не было найдено маркеров, позволяющих четко различать расы патогена между собой. Однако следует отметить, что изученные изоляты расы 300 выделились в отдельный субкластер. Это показывает, что она генетически удалена от остальных, вероятно, в силу происхождения с другого континента [6].
В ходе работ по определению полных нук-леотидных последовательностей ряда модельных организмов возник практический интерес к молекулярным маркерам, основанным на тестировании однонуклеотидных замен (SNPs - Singl Nukleotide Polymorphism). SNPs - это однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в некоторой популяции имеются различные варианты последовательностей (аллели), причем, частота встречаемости редкого аллеля не менее 1 % [7]. Это ограничение было введено, чтобы отличить SNPs от редких мутаций. Вопреки формальному определению, к этой группе маркеров относят все небольшие изменения геномных последовательностей: ин-серции/делеции (indels) и изменения нескольких нуклеотидов [8; 9]. SNPs - это не совсем
новый тип ДНК-маркеров. ПДРФ-маркеры (самые первые ДНК-маркеры) тоже относятся к этому типу маркеров.
Обычно SNPs представлены двумя аллель-ными вариантами. На практике трехаллельные SNPs встречаются, но крайне редко. Например, в геноме человека они составляют 0,1 % от всех SNPs (10). Двухаллельные SNPs могут быть четырех различных типов: один вид тран-зиций C<=>T (G<=>A) и три типа трансверсий: С<=>А (G<=>T), C<=>G (G<=>C) и T<=>A (A<=>T). Транзиции составляют две трети SNPs человека. Возможно, это связано с происхождением C<=>T (G<=>A) в реакции деа-минирования 5-метилцитозина [9].
Однонуклеотидные замены широко распространены в геномах всех организмов. Количество SNPs в геноме человека по разным оценкам - от 3 до 10 миллионов, причем количество «распространенных», с частотой встречаемости редкого аллеля более 20 %, составляет около 100 000. Среднее расстояние между маркерами - 30 т.п.н. Предполагается, что на каждый известный ген приходится в среднем по два маркера [8; 9]. Никакой другой тип геномных различий не имеет такой плотности картирования.
Помимо высокой плотности SNPs имеют низкий уровень мутаций на поколение (~10-8). Это делает их очень удобными при изучении крупномасштабных эволюционных событий [9].
В 2008 г. французскими учеными была проведена работа по поиску маркеров, выявляющих однонуклеотидные замены (SNPs), пригодных для дифференциации рас Plasmopara halstedii, так как предыдущие исследования по поиску полиморфных RAPD-, SSR-, ISSR-маркеров не дали положительных результатов, вероятно, потому, что эти молекулярные маркеры не специфичны для данного патогена. Авторами было сконструировано 12 пар праймеров для ПЦР, выявляющих од-нонуклеотидные замены в геномной ДНК Plasmopara halstedii. Результаты применения этих маркеров для различения рас ложной мучнистой росы позволяют надеяться, что проблема будет успешно решена. Авторы сообщают, что ими было дифференцировано 14 рас патогена, собранных в разных областях Франции [11].
Эффективное использование SNPs зависит от разработки надежных, дешевых и простых в исполнении способов их тестирования. В настоящее время применяется много методик
выявления (детекции) аллельных вариантов SNPs, которые условно делят на несколько групп. В таблице 1 представлены наиболее распространенные методы детекции однонук-леотидных замен. Поэтому задача исследователя заключается прежде всего в том, чтобы подобрать метод тестирования однонуклео-тидных замен в зависимости от поставленных задач и имеющихся технических возможностей лаборатории.
Таблица 1 - Основные методы детекции
аллельных вариантов SNPs (9)
Ферментативные методы:
- полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP);
- полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (AFLP);
- расщепление гетеродуплексов структурно-специфическими эндонуклеазами (CFLP, EMD, CAPS);
- анализы, основанные на лигазной реакции (LDR, LCR, Padolock);
- инвазивное расщепление олигонуклеотидов (Invader);
- случайная амплификация полиморфной ДНК (RAPD, AP-PCR);
- ПЦР с прямой терминацией синтеза (DT-PCR);
- аллель-специфическая ПЦР (AS-PCR).
Химические методы:
- химическое расщепление гетеродуплексов;
- химическое лигирование._
Методы, основанные на различной электрофорети-
ческой подвижности полиморфных участков ДНК:
- анализ конформации одноцепочечных фрагментов (SSCP);
- гетеродуплексный анализ;
- секвенирование ДНК._
Детекция на твердой фазе:
- гибридизация на олигонуклеотидных матрицах;
- оптиковолоконный ДНК гибридизационный анализ;
- элонгация иммобилизованных праймеров (мини-сиквенс);
- пиросиквенс._
Хроматографические методы:
- денатурирующая HPLC._
Физические методы:
- масс-спектрометрия;
- резонансное тушение флуоресценции (FRET);
- люминесценция, зависящая от локального окружения.
Анализ in silico:
- сравнение имеющихся в базах данных геномных и EST последовательностей.
В своей работе Giresse с соавторами использовали для выявления найденных ими полиморфных SNP-маркеров четыре разных метода [11; 12]. Они представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Методы детекции аллельных
вариантов SNPs для идентификации патотипов возбудителя ложной мучнистой росы [11; 12]
Локус Тип Используемый
полиморфизма метод
Pfa6 SNP* CAPS (Tsp45I)
Pfa39 Indel" Cеквенирование
Pfa42 Indel Cеквенирование
Pfa43 Indel Cеквенирование
Pfa54 SNP CAPS (FauI)
Pfa56 Indel CAPS (OLiI)
Pfa74 Indel Агароза
Pfa79 SNP SSCP
Pfa82 SNP CAPS (BspMI)
Pfa99 SNP CAPS (BsrDI)
Pfa106 Indel Cеквенирование
Pfa120 SNP SSCP
* изменения одного нуклеотида
** изменения нескольких нуклеотидов и небольшая инсерция/делеция
Как видно из таблицы 2, только для локуса Pfa74 был использован электрофорез в агароз-ном геле. Для пяти локусов Pfa6, Pfa54, Pfa56, Pfa82 и Pfa99 была проведена обработка продуктов амплификации ДНК ферментами эндо-нуклеазами рестрикции (CAPS, Cleaved Amplfied Polymorphic Sequence) с последующим электрофорезом в агарозном геле. Благодаря простоте и надежности этот метод широко используется, но при условии, что изменения в последовательности ДНК затрагивают сайт рестрикции. У двух локусов для выявления SNPs применяли метод однонитево-го конформационного полиморфизма ДНК (SSCP - Single Strand Conformaision Polymor-fism). Он заключается в том, что продукты амплификации денатурируют и полученные однонитевые молекулы разделяют в полиакри-ламидном геле. Любая нуклеотидная замена приводит к изменению заряда однонитевого фрагмента, а следовательно, и к его электро-форетической подвижности. Для других четырех локусов авторы использовали секвени-рование полученных продуктов амплификации ДНК. Секвенирование, безусловно, самый точный метод выявления SNP. Но это дорогой и трудоемкий процесс.
В нашей работе мы изучали пока только один локус Pfa74, так как выявление мутации в нем не требует дополнительных затрат. Была изучена ДНК коллекции изолятов возбудителя ложной мучнистой росы, собранных в Краснодарском крае, и образцов, любезно предостав-
ленных нам французскими коллегами (INRA, UMR santé Vegtale (INRA-ENITA).
В таблице 3 представлены результаты исследования полиморфизма изолятов разных рас возбудителя по локусу Pfa74. Было выявлено 2 аллеля, которые представляют собой фрагменты ДНК с разной электрофоретиче-ской подвижностью. Фрагмент размером 370 п.н. обозначен нами, как аллель 2, а фрагмент 430 п.н. - аллель 1. У отечественных изолятов не было обнаружено полиморфизма, у всех рас - аллель 2. У изолятов из других стран выявлены оба аллеля. На рисунке 1 показана элек-трофореграмма продуктов амплификации ДНК некоторых российских изолятов, а на рисунке 2 - иностранных.
Следует отметить, что среди рас гриба 330, 730 и 710 из Краснодарского края не было выявлено не только межрасовой, но и внутрира-совой изменчивости по аллельному состоянию локуса Pfa74. Достаточно большие выборки изолятов каждой из этих рас имеют аллель -один и тот же аллель 2. Раса 700 довольно редко встречается в этом районе. Однако пять ее изолятов были собраны в разных районах Краснодарского края с расстоянием между ними 50-200 км. Поэтому с некоторой долей вероятности можно говорить об отсутствии полиморфизма в данном локусе и у этой расы. Самая старая раса 100 исключительно редко встречается в Краснодарском крае. Единственный ее изолят показал идентичность с образцом ДНК расы 100 из Франции. А образцы ДНК расы 710 из Краснодарского края и Франции наоборот отличаются по локусу Pfa74. Образец ДНК расы 330 из Испании отличается от таковых из России и США, которые оказались идентичны между собой (табл. 3, рис. 2). Указанные различия труднообъяснимы, необходима достаточная выборка изоля-тов зарубежного происхождения. Судить по одному образцу сложно. Возможно, что локус Pfa74 имеет изменчивость в зависимости от географических условий.
Таким образом, несмотря на идентичность локуса Pfa74 у изолятов гриба из Краснодарского края разной расовой принадлежности, его необходимо изучать с целью идентификации новых биотипов паразита из регионов возделывания подсолнечника в РФ.
Дальнейшие наши исследования будут направлены на изучение полиморфизма SNP-локусов, для выявления которых может использоваться ферментативный метод, то есть обработка продуктов амплификации эндонук-леазами рестрикции.
Таблица 3 - Аллельное состояние рас ложной мучнистой росы по локусу Р(и74
ВНИИМК, Краснодар, 2010 г.
Раса
330 (Россия)
730 (-//-
710 (-//-
700 (-//-
100 (-//-
310 (-//-
Количество изоля-тов
30
11
20
Аллель
Раса
Количество изолятов
330 (США)
730 (Франция)
710 (-//-
700 (-//-
100 (-//-
714 (-//-
307 (-//-
334 (-//-
Аллель
Раса
330 (Испания)
717 (Франция)
703 (-//-)
304 (-//-)
704 (-//-)
707 (-//-)
300 (-//-)
314 (-//-)
Количество изоля-тов
Аллель
Рисунок 1 - Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК по локусу БЬа74 у рас возбудителя ложной мучнистой росы (л.м.р.). 330, 730, 710, 700 - расы возбудителя л.м.р. из Краснодарского края
Рисунок 2 - Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК по локусу Fha74
у рас возбудителя ложной мучнистой росы (л.м.р.). 1, 2 - аллели локуса, 730, 707, 717, 700, 334, 300, 710, 704, 330 - расы возбудителя л.м.р. из Франции, 330' - раса из Испании
Список литературы
1. Gulya, T.J. Distribution of Plasmopara halstedii races from sunflower around the world. Proc. 2nd Int. Downy Mildew Symposium «Advances in downy mildew research» / T.J. Gulya // Olomouc, Czech Republic. - 2007, 3 - P.121-134.
2. Tourvieille, J. Molecular variability of Plasmopara halstedii / J. Tourvieille, J. Millon, P. Roeckel-Drevet, P. Nicolas, D. Tourvieille de La-brouhe, T.J. Gulya // 15th International sunflower conference, 12-15 June. - Toulouse, France. -2000. - P. 161-166.
3. Roeckel-Drevet, P. Lack of genetic variability in French identified races of Plamopara halstedii, the cause of downy mildew in sunflower Helianthus annu-us / P. Roeckel-Drevet, V. Coelno, J. Tourvieille, P. Nicolas, D. Tourvieille de Labrouhe // Can. J. Microbiol. - 1997. - V. 43. - P. 260-263.
4. Roeckel-Drevet, P. Molecular variability of sunflower downy mildew, Plasmopara halstedii from
different continent / P. Roeckel-Drevet, J. Tour-vieille, T.J. Gulya, G. Charmet, P. Nicolas, D. Tourvieille de Labrouhe // Can. J. Microbiol. - 2003.
- V. 49(8). - P. 492-502.
5. Intelmann, F. Analysis of total DNA by minisatellite and simple-sequence repeat primers for the use of population studies in Plasmopara hals-tedii / F. Intelmann, O. Spring // Can. J. Microbiol. - 2002, 48 - P. 555-559.
6. Гучетль, С.З. Внутривидовой полиморфизм возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника, выявляемый молекулярными маркерами / С.З. Гучетль, Т.С. Антонова, Т.А. Челюстникова, С.А. Рамазанова, Н.М. Арасла-нова // Сельскохозяйственная биология. - 2010.
- № 5. - С. 55-60.
7. Brookes, A.J. The essence of SNP // Gene. -1999, 234 - P.177-186.
8. Сулимова, Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения. - 2004, [Электронный ресурс] - режим доступа: http://www.labsgi.by.ru
9. Бородина, Т. Методы детекции SNP. Практическая молекулярная биология. [Электронный ресурс] - режим доступа: http : //www.molbiol.edu. ru
10. Lai, E. // Genom Res. - 2001. - V. 11. -№ 6. - P. 927.
11. Giresse, X. Twelve polymorphic expressed sequence tags-derived markers for Plasmopara halstedii, the causal agent of sunflower downy mildew / X. Giresse, D. Tourvieille de La-brouche, S. Richard-Cervera, F. Delmotte // Mo-lec. Ecol. Notes. - 2007.
12. Delmotte, F. EST-derivd markers highlight genetic relationships among Plasmopara halstedii French races / F. Delmotte, X. Giresse, S. Ri-chard-Cervera, F. Vear, J. Tourvieille et al. // Proc. 17th international Sanflower conference, Cordoba, Spain. 2008. - P. 187-192.
Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ, грант № 11-04-96501.
2
2
2
2
2
1
5
2
2
1
2
2
2
2
1
2
1
