CC BY
39
ISSN 2412-608Х. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 3 (175), 2018
УДК 631.523:633.854.78
DOI 10.25230/2412-608Х-2018-3-175-19-27
МАРКИРОВАНИЕ ЛОКУСОВ Pl5, Pl6
И Pl8, КОНТРОЛИРУЮЩИХ УСТОЙЧИВОСТЬ К Plasmopara halstedii У ЛИНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА СЕЛЕКЦИИ ВНИИМК
С.А. Рамазанова,
кандидат биологических наук
Т.С. Антонова,
доктор биологических наук
ФНЦ ВНИИМК
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. им. Филатова, д. 17 Тел.: (861) 275-86-53 E-mail: immunity@vniimk.ru
Для цитирования: Рамазанова С.А., Антонова Т.С. Маркирование локусов Pl5, Pl6 и Pl8, контролирующих устойчивость к Plasmopara halstedii у линий подсолнечника селекции ВНИИМК // Масличные культуры. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. - 2018. - Вып. 3 (175). - С. 19-27.
Ключевые слова: ДНК-маркеры, МАС, R-гены, P. halstedii, устойчивость, подсолнечник.
Современные технологии генотипирования с помощью ДНК-маркеров позволяют существенно ускорить создание новых гибридов подсолнечника, устойчивых к комплексу рас возбудителя ложной мучнистой росы (P. halstedii) и контролировать наличие генов устойчивости на каждом этапе селекции. Апробированы известные из литературных источников девять STS и три SSR-маркера генов Pl5, Pl6 и Pl8, контролирующих устойчивость к расам P. halstedii. После оптимизации условий проведения ПЦР по каждому праймеру испытания проводили на 15 линиях подсолнечника селекции ВНИИМК, различающихся по устойчивости к расам 730, 710, 330 и 334. Для маркирования локуса Pl6 использовали три STS и три SSR-маркера. Идентификацию локусов Pl5 и Pl8 проводили с использованием шести известных STS-маркеров. Ни один из маркеров не выявил четкой дифференциации между линиями подсолнечника, различающимися устойчивостью к разным расам P. halstedii. Таким образом, испытанные молекулярные маркеры не дифференциро-
вали линии подсолнечника селекции ВНИИМК по устойчивости и восприимчивости к ложной мучнистой росе.
UDC 631.523:633.854.78
Marking of Pl5, Pl6 и Pl8 loci controlling resistance to Plasmopara halstedii in sunflower lines developed in VNIIMK. S.A. Ramazanova, PhD in biology T.S. Antonova, doctor of biology
All-Russian research institute of oil crops by
Pustovoit V.S. (VNIIMK)
17, Filatova str., Krasnodar, 350038, Russia
Tel.: (861) 275-86-53
E-mail: immunity@vniimk.ru
Key words: DNA markers, MAS, R-genes, P. halstedii, resistance, sunflower.
The modern technologies of genotyping using DNA-markers allow significantly increasing development of new sunflower varieties resistant to a complex of downy mildew races (P. halstedii) and to control existence of resistance gens at the each stage of breeding. We approbated known from literary sources nine STS and three SSR-markers of gens Pl5, Pl6, and Pl8 controlling resistance to races of P. halstedii. After optimizing conditions for PCR for each primer, we tested 15 sunflower lines developed in VNIIMK which are differed with their resistance to races 730, 710, 330 and 334. To mark a locus Pl6 we used three STS and three SSR-markers. We identified loci Pl5 and Pl8 using six known STS-markers. No one maker showed a distinct differentiation between sunflower lines with different resistance to races of P. halstedii. Thus, tested molecular markers did not differentiate sunflower lines developed in VNIIMK by their susceptibility or resistance to downy mildew races.
Введение. В нашей стране подсолнечник является ведущей масличной культурой. Основная его ценность - это получение масла, одного из главных продуктов питания человека. Важнейшими факторами, ограничивающими получение высоких урожаев, являются болезни и вредители. Ложная мучнистая роса, вызываемая оомицетом Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni, относится к числу
наиболее вредоносных. Потери урожая при условиях, благоприятных для развития болезни, могут составлять 50-70 %. До настоящего времени в мире уже обнаружено более 45 физиологических рас патогена и наблюдается постоянное возникновение новых, более вирулентных [27; 28; 29]. Одним из наиболее эффективных методов контроля над возбудителями болезней является введение в растение-хозяин доминантных генов устойчивости к ним.
В связи с развитием методов молекулярной биологии в селекции сельскохозяйственных культур все чаще применяются молекулярные маркеры, из них наиболее распространенными и востребованными являются ДНК-маркеры [1]. Применение их в практической селекции получило название MAS (marker-assisted selection), которое имеет несколько вариантов перевода в русскоязычной литературе, такие как «маркер-вспомогательная селекция», «маркер опосредованная селекция», «маркерная селекция» либо «селекция с использованием молекулярных маркеров» и другие. В России исследования по созданию ДНК-маркеров относятся к приоритетным направлениям на ближайшие годы. На сегодняшний день созданы и постоянно продолжают разрабатываться новые ДНК-маркеры для идентификации генов, контролирующих хозяйственно ценные признаки с целью применения их в селекционных программах с использованием MAS.
Одним из важных условий MAS является как можно более тесное сцепление между маркером и геном, контролирующим признак, а затем использование ассоциаций маркер-признак в практических целях для создания новых сортов и селекционных линий [1]. Однако сначала ассортимент разработанных молекулярных маркеров должен проходить верификацию на разном генетическом фоне, включая генетические коллекции изоген-ных линий, содержащих гены устойчиво-
сти к биотическим и абиотическим факторам среды. Рекомендованными для дальнейшего использования в MAS могут быть только маркеры, для которых случаи ложного положительного или отрицательного результата исключены [2]. Именно по этой причине существующий этап развития MAS характеризуется как повсеместная апробация ДНК-маркеров на разном сортовом материале с выявлением универсальных систем для идентификации различных генов, в том числе и контролирующих устойчивость к ложной мучнистой росе.
В настоящее время расшифрованы нуклеотидные последовательности более 20 генов устойчивости у растений, так называемых R-генов. Это гены, определяющие устойчивость к различным типам патогенов (вирусы, бактерии, грибы, животные). Оказалось, что их нуклеотидные последовательности довольно консервативны, т.е. имеют большой процент схожести, что, вероятно, свидетельствует об одинаковой природе возникновения сигнальных событий при формировании защитной реакции у растений [3; 4]. Все R-гены содержат последовательности, кодирующие белки устойчивости, которые в свою очередь включают домены с богатыми лейцином повторами LRR (leucine-rich repeat). Такие повторы ответственны за связывание белка с белком, т. е. отвечают за распознавание патогена [4].
Все R-белки можно разделить на две группы - это внутри- и внеклеточные белки. Последовательности, кодирующие внутриклеточные белки, помимо LRR-домена содержат сайт связывания нук-леотидов NBS (nucleotide binding site) и в некоторых случаях дополнительно мотив (leucine zipper), названый «лейциновая молния», LZ или домен, гомологичный рецепторам Toll, и интерлейкин-1 TIR (Toll and interleukin-1 receptor). А последовательности, кодирующие внеклеточные белки, также содержат LRR-домен, который может быть дополнен сайтом связывания с мембраной и доменом ци-топлазматической протеинкиназы [3; 4; 5;
6]. Протеинкиназный и нуклеотидсвязы-вающий домены участвуют в фосфорили-ровании белков и регуляции экспрессии защитных генов соответственно [5].
В настоящее время с помощью метода ПЦР с вырожденными праймерами, построенными на основе аминокислотной последовательности доменов NBS-LRR, клонировано очень много последовательностей ДНК. Так как почти все гены устойчивости их содержат, то это дает возможность их маркировать, а также идентифицировать еще неизвестные R-гены. Такие последовательности получили название аналоги генов устойчивости RGAs (Resistence Gene Analog) или «кандидатов» в гены устойчивости RGCs (Resistence Gene Candidate). Они хорошо подходят для маркирования, так как либо сами являются частью R-гена, либо тесно с ним сцеплены [3; 4]. Причем R-локусы могут находиться в одном из четырёх состояний. Одни имеют один ген с множеством аллелей, другие могут существовать как однокопийный ген, который присутствует в устойчивых линиях и отсутствует в восприимчивых. У многих видов растений R-локус имеет тандемные повторы тесно сцепленных гомологичных R-генов с различной спецификацией. Наконец, в отдельных участках генома R-гены для грибных, бактериальных и вирусных патогенов локализованы в одной хромосоме на очень близком расстоянии друг от друга (1-2 сМ) [7].
Известно, что устойчивость к P. hals-tedii контролируется генами Pl. Они идентифицированы как в культурном, так и дикорастущем подсолнечнике, и в настоящее время всего их насчитывается 25: Pl1-17, Plv, Plw, Plx-z, Mw, Mx и Plarg [8; 9; 10; 11; 12]. Некоторые из них обеспечивают устойчивость к одной расе, тогда как другие - к двум и более [8]. Ген Pl1 обусловливает устойчивость к расе 100, а Pl2 к расе 300 [14]. Известно, что гены Pl1, Pl2 и Pl6 контролируют устойчивость к расам 100, 300, 700, 703, 710, 330, 770 и 730. Они картированы в первой группе сцепления на RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) генетической карте
[6] и в восьмой группе сцепления LG на генетической карте SSR (Simple Sequence Repeat) [15]. Относятся они к TIR-NBS-LRR классу R-генов, причем локус Pl6 представляет собой кластер из 13 генов, близко расположенных друг к другу и относящихся к одному локусу [24]. Bouzidi с соавторами [6] на основе ПЦР с вырожденными праймерами разработали и применили для маркирования этого локуса три STS-маркера HAP1, HAP2 и HAP3. Результаты их работы были опубликованы еще в 2002 г. и с того времени использовались исследователями разных стран для идентификации локуса Pl6 в генотипах подсолнечника. К примеру, сербские ученые Pancovic с соавторами [20] тестировали их на устойчивых и восприимчивых к расе 730 изогенных линиях. Авторам удалось получить отжиг только с праймером HAP3. Однако они не выявили четких различий между восприимчивыми и устойчивыми линиями [23]. Идентифицировать локус Pl6 в линиях подсолнечника им удалось с помощью трех SSR-маркеров ORS37, ORS166, 0RS1043. Проведенный гибридологический анализ позволил определить генетическое расстояние SSR-маркеров от локуса Pl6, а также установить их доминантное наследование. Для идентификации гомо- и гетерозиготных образцов они применили CAPS-маркеры HhaI, RsaI, имеющие кодоминантное наследование [20].
Гены Pl5 и Pl8, контролирующие устойчивость к 16 расам P. halstedii, были также клонированы на основе ПЦР с вырожденными праймерами [10]. Radwan с соавторами [11; 12] показали, что эти два гена сцеплены, относятся к non-TIR-NBS-LRR классу R-генов и картированы в тринадцатой группе сцепления на генетической карте SSR.
В России аналогичные исследования проводил Маркин с соавторами [25]. Ими были генотипированы 16 линий подсолнечника - восстановителей фертильности пыльцы с разной устойчивостью к ложной мучнистой росе по девяти STS-локусам. И только по двум (маркеры на локус Pl6) удалось различить линии, ус-
тойчивые и вocпpиимчивые к pacaM 773O и 710 P . ha-Medii .
В селекционном MaTep^Je ВНИИМК MOJiCKyiJi5)pHciíi идeнтификaция генов устойчивости II Этому татогену Не ^овоДИ-.acb. В pa6oTe по соззд^нию новый генотипов подсолнечник с зaдaнными napaMeTpaMffl комплексной устойчивости к ложной мучнистой poce необходимы знания о таличии генов устойчивости и их ^.лл^л1)Ном состоянии. Pa6oTa по соз-д^нию системы m^jik^jio^, позволяющей однозгачно идeнтифициpoвaть гены устойчивости к P. halifedi'iaKTyaJbHa .
Целью таших 1сссл^до^^ни1й 6bIлcc an-jio6infio^^Ti3 известные MO.JieKy.Ji)pHbie Mapcepbi и изучить возможность их ис-пошзззо^^ния для oпpeдeлeния таличия генов устойчивости к P . halstedii в линиях под солнечник селекции ВНИИМК.
Материалы и методы. Объектом ис-сл^до^^ния послужили 155 линий селекции ВНИИМК, устойчивые и вocпpиимчивыe к pacaM 77 3 0, 77 34, 710, 73O, 77344 (табл. 2). Оценку степени устойчивости OÔficliîLiOB ПОДСОЛН^чЫНИК^ njio^o-дили в Лa60paT0pHЫX условиях методом искусственного зapaжeния пpopocткoв подсолнечник [30] .
Для выделения ДНК ^име^ли метод, ocHO^^^Hbiíí Ha испошзззо^^н^и .ro^yo-щего 6ylepa, coдepжaщero г^ссс^д^цдил-тpимeтилaммoний 6poмид (СТААВ) с мoдификaциями [16 ; 17]. Кон^т^^цию ДНК в полученном пpeпapaтe оп1г^д^ляли визyaльнo по интенсивности свечения npo6bi объемом 10 мкл в yintTTfi^cciiiOJi^TO-вом свете в 1 /-ном arapoöHOM геле с до-б^^л^нием 2 мкл 6poмиcтoro этидия. Элeктpoфopeз pac^o^o^ ДНК доводит njm нaпpяжeнии 100 V в течение 30 мин в тpиc-aцeтaтнoм 6ylepHOM pi^c;T^oiie (TAIE).
Для ПЦР aHa.roa ^именили 12 npa^ m^jio^, опис^^ньгх в литepaтypныx источниках, их нуклеотидные посл^до^^т^Шз-ности пpeдcтaвлeны в т^блшг^ 1 [6 ; 19; 20]. noJmMepaBHyKD цепную peacoirno выполняли в peaкциoннoй смеси (25 мкл) следующего coc^a: 617 мМ Ippincî-HCCl (pH 8,8); 166,66 mM cyльфaтa аммония; 1,5-
33,0 mM MgCl2; 0,01 % Tween 20; по 0,2 mM дeзoкcиpи6oнyклeoзидфocфaтoв; по 10 пМ пpaймepoв; 10 нг мaтpичнoй ДНК и 1 ед. peкoм6инaнтнoй TepMocTa-бильной ДHK-пoлимepaзы (НПО «оСи-бЭнзим», Россия). Р^сции доводит в тepмoциклepe S1000™ (BioRad, США) п]эи следующих TeMnepaTypHbK {^жим^х: нaчaльнaя дeнaтypaция ipprn 955 ос в течение 3 мин, д^лг^ 355 циклов с последо^^-тельной сменой TeMnepaTyp: де^ту!^!^ npiii 944 °С, в течение 10 сек, отжиг npa^ Mepa nprn 58-63 °С (в зaвиcимocти от пpaймepa) - 30 сек, элонгация npiii 72 °С -1 мин 30 сек, и зaключитeльнaя элонгация 10 мин.
Элeктpoфopeз пpoдyктoв ^МПЛифик^-ции ^оводши! в геле, coдepжaщeм 2 % arapoзы и Sü^ycliep, с испошзззо^^нием caMepbi для ropизoнтaльнoгo элeктpoфo-JIe;з)a SE-2 (Хеликон, Россия) , nprn H^npiíi-жении ~ 200 В, силе Toca ~ 100 мА, в течение 30 мин. Гели oкpaшивaли (PpiOMii-стым ээтидиел.!. Для ^и;зyI^ли;г^II^и и доку-м^нтиJ)o^^ния JI^;зyIЛIтT^тoв з^JIe;к'P]Э0cCI0JI^5)a применяли сис;тему LIиc|)JЭ0в:0Й доссум^нт^-ции видeoизo6paжeния BIO-PRINT ^\i"ilt»er loOurm^t, ctPpi^HLiiiii) .
Таблицу 1
XapaKmepucmuKa npaÜMepoe, исиолльзова^иыхх для идентифишции локусов PlsPl6 и Pls
Праймгр 5-3 ' пo(;лeддolB'a^лJJИHктI) Лйо^с
HaP1 F: GGTAATGGCTGTTGAATTTATGGAGC R: AGCATGATCCGGCTAGAGCCTTCTA Plö
HaP2 F: GTCTACTACATGGTTTCCGTTTTC R: TGCTTCTTCCTTCTATCTCACTC PP
HaP3 F: GTTTGTGGATCATCTCTATGCG R:TGCTTCTTCCTTCTATCTCACTC Pl6
Ha-P1 F: GCCCAAAATTGAAAGAAAGGTGTG R: GGCGAAATTGGTTCCCGTGAGTCG Pk PPs
Ha-P2 F: AATCTTGAGTCATTACCCGAGC R: CAGCGTCTCTGGTAGATCGTTCACC Pll, PPs
Ha-P3 F: GCTGTTACTGCCCTCTTCAAAGTC R: TTTGAAAGATAAGTTCGCCTCTCG Pl PPs
Ha-P4 F: GCTGTTACTGCCCTCTTCAAAGTC R: CCCAACTCGACATATCTTCAAACC Pls
Ha-P5 F: TAGTTAACCATGGCTGAAACCGCTG R: CCCCATATTGACAAAGAGTTGAGG Pls
Ha-P6 F: TAGTTAACCATGGCTGAAACCGCTG R: CGTCTCTGGTAGATCGTTCACCTT Pls
ORS37 F : CACAATGCAAAAAAACCCAG R: CAAGGCACATCGCAATTTC Plö
ORSH6 F : CAGCCACATGCCCTCTGA R: TGTTAAGAACCGCGACAACTG Plö
ORS1603 F: CCAAACCGTCATGTTCTATGTTC R: AGTGTGATTGCGAATTGTAGTGC Plö
Результаты и обсуждение. На первом этапе работы провели оценку линий подсолнечника на устойчивость к ложной мучнистой росе в лабораторных условиях методом искусственного заражения проростков зооспорами оомицета. Образцы оценивались на устойчивость к расам 330, 334, 710 и 730. В результате эксперимента линии разделились на 4 группы. Первая состоит из двух линий Л 1942-14 и Л 2018-1, устойчивых ко всем расам. Во вторую группу вошли семь линий (Л 673-15, Л 686-15, Л 678-15, Л 665-15, Л 689-15, Л 700-15, Л 699-15), устойчивых к 330, 730, 710, но восприимчивых к 334 расе. Третья группа - линии ВК 920 и ВК 917, устойчивые только к 330 расе. И четвертая группа включает четыре линии СЛ 24, СЛ 4, ВК 935, ВК 934, восприимчивые ко всем расам (табл. 2). Таким образом, изучаемые линии контрастно различались по степени устойчивости к возбудителю ложной мучнистой росы подсолнечника, что позволило протестировать 8Т8-маркеры на возможность использования их в качестве вспомогательного инструмента в селекции на устойчивость к патогену.
Таблица 2
Оценка линий подсолнечника селекции ВНИИМК на устойчивость к расам Р1а8тврата ЪаЫвйи
№ п/п Линия, гибрид Устойчивость к ЛМР
334 330 730 710
1 Л1942-14 + + + +
2 Л 2018-1 + + + +
3 Л 693-15 - + + +
4 Л 697-15 - + + +
5 Л 678-15 - + + +
6 Л 665-15 - + + +
7 Л 689-15 - + + +
8 Л 700-15 - + + +
9 Л 699-15 - + + +
10 ВК 920 - + - -
11 ВК 917 - + - -
12 СЛ 24 - - - -
13 СЛ 4 - - - -
14 ВК 935 - - - -
15 ВК 934 - - - -
Примечание: знаками «+» и «-» обозначены устойчивые и восприимчивые линии соответственно
Локус Pl6 контролирует устойчивость в общей сложности к 11 расам, в т.ч. к 710,
730 и 330, но не к 334. В таблице 3 представлена характеристика трех праймеров, фланкирующих гены данного локуса, разработанных Боузиди и его коллегами [6].
Таблица 3
Характеристика локуса Р16
Название гена Я/8* Пары праймеров Размер продукта ПЦР
На-Ш8 1 8 НаР1 1,901 Ьр
На-Ш8 2 Я 1,484 Ьр
На-Ш8 3 8 НаР2 1,694 Ьр
На-Ш8 4 8 1,979 Ьр
На-Ш8 5 Я 1,763 Ьр
На-Ш8 6 8 1,700 Ьр
На-Ш8 7 Я 1,589 Ьр
На-Ш8 8 Я 1,414 Ьр
На-Ш8 9 Я 1,260 Ьр
На-Ш8 11 Я НаР3 1,811 Ьр
На-Ш8 12 8 1,406 Ьр
На-Ш8 13 Я 1,119 Ьр
На-Ш8 14 Я 988 Ьр
*
Примечание: - маркер гена, контролирующего устойчивость/восприимчивость
Результаты амплификации образцов ДНК изучаемых линий подсолнечника показали, что ни один из трех маркеров не выявил четких различий между образцами с разной степенью устойчивости к P. halstedii. К тому же, ввиду больших размеров амплифицированных фрагментов (988-1979 п.н.), они плохо воспроизводятся и нечетко различимы на электрофореграммах. Такой результат был получен и иранскими учеными [26]. Применив для идентификации локуса Pl6 эти же праймерные пары, они не получили амплифицированных фрагментов, из чего сделали вывод, что их линии подсолнечника не содержат данного гена.
Для маркирования локуса Pl6 в данном исследовании мы применили также три 88Я-маркера ОЯ837, ОЯ8166 и 0Я81043 [23]. Для всех пар праймеров были подобраны оптимальные температуры отжига, время элонгации и количество циклов для получения удовлетворительных результатов амплификации. В качестве примера на рисунке представлена электрофореграмма продуктов амплификации, полученных с праймером ОЯ8166. Из рисунка видно, что между устойчивыми и восприимчивыми линиями нет чет-
ких различий. На дорожках 3-9 представлены продукты амплификации ДНК линий, устойчивых к трем расам, но восприимчивых к 334 расе. У них обнаружены два фрагмента (обведены на дорожке 3), отличающие их от остальных линий, но эти фрагменты не всегда воспроизводимы и поэтому не могут использоваться в практической работе. С праймерами ОЯ837 и 0Я81043 получены аналогичные результаты. Таким образом, протестированные маркеры не выявили четких различий между линиями с разной устойчивостью к Р. halstedii.
Рисунок - Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК линий подсолнечника
с праймером ОЯ8166. Дорожки 1-2 - образцы, устойчивые к четырем расам, 3-9 - восприимчивые к 334 расе, 10-11 - устойчивые только к 330 расе, 12-15 - восприимчивые ко всем расам
В настоящее время перспективным является введение локуса Р18 в селекционные образцы. Это обусловлено, как минимум, двумя факторами: во-первых, он обеспечивает устойчивость ко всем распространенным в нашем регионе расам, во-вторых, локус Р18 находится в одной группе сцепления с локусом Р15. Что дает возможность использовать их в селекции линий и гибридов подсолнечника с комплексной устойчивостью ко всем расам, распространенным в Краснодарском крае в настоящее время.
В таблице 4 представлена характеристика 8Т8-маркеров локусов Р15 и Р18 и фланкирующих их шести пар праймеров, использованных в нашей работе. Для каждого из них были подобраны оптимальные условия ПЦР. В результате реакции со всеми шестью парами праймеров были получены амплифицированные фрагменты ДНК. Однако специфичные фрагмен-
ты ДНК для устойчивых и восприимчивых линий не были идентифицированы. Не удалось разделить линии на устойчивые и восприимчивые так, как это описано в работе у Radwan с соавторами [19]. По-нашему мнению, это связано с большим размером фланкируемого праймера-ми участка ДНК и, как следствие, амплификацией фрагментов длиною более 1000 пар нуклеотидов. К тому же сравнение нуклеотидных последовательностей этих генов показало наличие большого количества участков ДНК, совпадающих по нуклеотидному составу. Это также создает проблемы при маркировании данных локусов. Такой же результат был получен и Маркиным с соавторами у линий подсолнечника с различной устойчивостью к ложной мучнистой росе селекции Донской опытной стан ции ВНИИМК [25].
Таблица 4
Характеристика локусов Pl5 и Pl8
STS-маркер Локус R/S Пары праймеров Размер продукта ПЦР
Ha-NT8R1 Pis R Ha-P1 1,569
Ha-NT8R2 R 2,119
Ha-NT8R7 R 2,237
Ha-NT8S1 S 1,153
Ha-NT8S2 S 1,610
Ha-NT5R2 Pis R 2,021
Ha-NT5S1 S 1,303
Ha-NT5S2 S 1,424
Ha-NT5S3 Pis S Ha-P2 387
Ha-NT8R3 Pis R Ha-P3 1,584
Ha-NT5R1 Pis R 1,584
HaNT8R4 Pis R Ha-P4 1,840
HaNT8R5 Pis R Ha-P5 2,419
HaNT8R6 Pis R Ha-P6 2,437
чивость/восприимчивость
Заключение. Таким образом, проведена оценка устойчивости 15 линий подсолнечника селекции ВНИИМК к наиболее распространенным в Краснодарском крае расам Р. halstedii. С использованием девяти 8Т8 и трех 88Я-мар-керов локусов Р15, Р16 и Р18 линии подсолнечника были генотипированы. Испытанные молекулярные маркеры не дифференцировали линии подсолнечника ВНИИМК по устойчивости и восприим-
чивости к ложной мучнистой росе, т.к. маркеры локусов Pl5, Pl6 и Pl8 одинаково представлены у всех генотипов.
Список литературы
1. Леонова И.Н. Молекулярные маркеры: использование в селекции зерновых культур для идентификации, интрогрессии и пирамидирования генов // Вавиловский журнал генетики и селекции. -2013. - Т. 17 - № 2 - С. 314-325.
2. Сколотнева Е.С., Леонова И.Н., Букатич
E.Ю., Салина Е.А. Методические подходы к идентификации эффективных генов, определяющих устойчивость пшеницы к комплексу грибных заболеваний // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2017. - Т. 21 - № 7 - С. 862-869. DOI 10.18699/VJ17.307.
3. Martin G.B. Functional analysis of plant disease resistance genes and their downstream effectors // Curr. Opin. Plant Biol. - 1999. - V. 2. - P. 273-279.
4. Meyers B.C., Chin D.B., Shen K.A., Sivaramakrishnan S., Lavelle D.O. [et al.]. The major resistance gene cluster in lettuce is highly duplicated and spans several megabases // Plant Cell. - 1999. -V. 10. - P. 1833-1846.
5. Ellis J.G., Jones D. Structure and function of proteins controlling strain-specific pathogen resistance in plants // Curr, Opin. Plant Biol. - 1998. -V. 1. - P. 288-293.
6. Bouzidi M.F. Badaoui S., Cambon F., Vear F., De Labrouhe D.T., Nicolas P., Mouzeyar S. Molecular analysis of a major locus for resistance to downy mildew in sunflower with specific PCR-based markers // Theor. Appl. Genet. - 2002. - V. 104. - P. 592600.
7. Чекалин Н.М. Генетические основы селекции зернобобовых культур на устойчивость к патогенам. - Полтава: 1нтерграфжа, 2003. - 186 с.
8. Miller J.F. Registration of five oilseed sunflower germplasm restorer lines (RHA373-377) and two nuclear male-sterile populations (nms 274 and 801) // Crop Sci. - 1992. - V. 32 - P. 1298.
9. Gascuel Q., Martinez Y., Boniface M.C., Vear
F., Pichon M., Godiard L. The sunflower downy mildew pathogen Plasmopara halstedii // Molecular Plant Pathology. - 2015. - V. 16 (2). - P. 109-122. DOI 10.1111/mpp.12164.
10. Jocic S., Miladinovic D., Imerovski I., Dimitrijevic A., Cvejic S., Nagl N., Kondic- Spika A. Towards sustainable downy mildew resistance in sunflower // Helia. - 2012. - No 35 - P. 61-72.
11. Bertero de Romano A., Romano C., Bulos M., Altieri E., Sala C. A new gene for resistance to downy
mildew in sunflower // Proc. of Intern. Symposium "Sunflower Breeding on Resistance to Diseases" Russia, Krasnodar, 2010, June 23-24. - P. 141-146.
12. Bachlava E., Radwan O.E., Abratti G., Tang S., Gao W., Heesacker A.F., Bazzalo M.E., Zambelli A., Leon A.J., Knapp S.J. Downy mildew(Pls and Pl14) and rust (RAdv) resistance genes reside in close proximity to tandemly duplicated clusters of non-TIR-like NBS-LRR-encoding genes on sunflower chromosomes 1 and 13 // Theor. Appl. Genet. - 2011. - V. 122. - P. 1211-1221.
13. Vear F., Gentzbittel L., Philippon J., Mouzeyar S., Mestrie E., Roeckel-Drevet P., D.T. de Labrouhe, Nicolas P. The genetics of resistance to five races of downy mildew (Plasmopara halstedii) in sunflower (Helianthus annuus L.) // Theor. Appl. Genet. - 1997. - V. 95 (4). - P. 584-589. DOI 10.1007/s00 1220050599.
14. Zimmer D.E., Kinman M.L.. Downy mildew resistance in cultivated sunflower and its inheritance // Crop Sci. - 1968. - V. 12 (6). - P. 749-751. DOI 10.2135/cropsci1972.0011183X 001200060009x
15. Liu Z., Gulya T.J., Seiler G.J., Vick B.A., Jan
C.-C. Molecular mapping of the Pl16 downy mildew resistance gene from HA-R4 to facilitate marker-assisted selection in sunflower // Theor. Appl. Genet. -2012. - V. 125. - P. 121-131.
16. Zolan M.E., Pukkila P.J. Inheritance of DNA methylation in Corpinus cinereous // Mol. Cell Biol. -1986. - Vol. 6. - No 1. - P. 195-200.
17. Saghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., Allard R. W. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics // PNAS USA. - 1984. - 81. - P. 8014-8018.
18. Lander E.S., Green P., Abrahamson J., Barlow A., Daly M.J. Lincoln S.E., Newburg L. MAPMAKER: an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations // Genomics. - 1987. -V. 1. - P. 174-181.
19. Radwan O., Bouzidi M.F., Vear F., Philippon J.,
D.T. de Labrouhe, Nicolas P., Mouzeyar S. Identification of non-TIR-NBS-LRR markers linked to the P15/P18 locus for resistance to downy mildew in sunflower // Theoretical and Applied Genetics. - 2003. -V. 106. - P. 1438-1446. DOI 10.1007/s00122-003-1196-1.
20. Pankovic D., Radovanovic N., Jocic S., Satovic Z., Skoric D. Development of Co-Dominant Amplified Polymorphic Sequence Markers for Resistance to Sunflower Downy Mildew Race 730 //
Plant Bleeding. - 2007. - V. 126 (4). - P. 440-444. DOI 10.1111/j.1439-0523.2007.01376.x.
21. Bert P.F., Tourvieille de Labrouhe D., Philippon J., Mouzeyar S., Jouan I., Nicolas P., Vear F. Identification of a second linkage group carrying genes controlling resistance to downy mildew (Plasmopara halstedii) in sunflower (Helianthus annuus L.) // Theor. Appl. Genet. - 2001. - V. 103. -P. 992-997.
22. Ивебор М.В. Идентификация рас возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника в регионах Северного Кавказа и выделение устойчивого к ним исходного материала для селекции: дис. ... канд. с.-х. наук. ВНИИ Риса, Краснодар, 2009.
23. Pankovic D., Jocic S., Lacok N., Sakac Z., Skoric D. The use of PCR-based markers in the evaluation of resistance to downy mildew in NS-breeding material // Helia. - 2004. - No 27. - P. 149-158.
24. Gentzbittel L., Mouzeyar S., Badaoui S., Mestrie E., Vear F., Tourvieille de Labrouhe D., Nicolas P. Cloning and molecular markers for disease resistance in sunflower Helianthus annuus L. // Theor. Appl. Genet. - 1998. -V. 96. - P. 519-525.
25. Маркин Н.В., Тихобаева В.Е., Усатенко Т.В., Горбаченко О.Ф., Усатов А.В. Генотипиро-вание линий подсолнечника с различной устойчивостью к ложной мучнистой росе с помощью STS-маркеров // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2012. - Вып. 2 (151-152). - С. 35-39.
26. Soltani Najafabadi M., Abedini R., Eskandari H., Mehrabi R. Monitoring Three Plasmopara halstedii Resistance Genes in Iranian Sunflower Inbred Lines // Iran J. Biotechnol. - 2015. - V. 13 (2). -P. 45-50. DOI 10.15171/ijb. 1047.
27. Virânyi F., Gulya T.J., Tourvierille de Labrouhe D. Recent changes in the pathogenic variability of Plasmopara halstedii (sunflower downy mildew) populations from different continents // Helia. -2015. - V. 38. - P. 149-162.
28. Sedlârovâ M., Pospichalovâ R., Drâbkovâ-Trojanovâ Z., Bartusek T., Slobodianovâ L., Lebeda A. First report of Plasmopara halstedii new races 705 and 715 on sunflower from the Czech Republic -short communication // Plant Protect. Sci. - 2016. -52. - DOI 10.17221/7/2016-PPS.
29. Spring O., Zipper R. New highly aggressive pathotype 354 of Plasmopara halstedii in German sunflower fields // Plant Protect. Sci. - 2018. - V. 54 -P. 83-86. DOI 10.17221/99/2017-PPS.
30. Iwebor M., Antonova T.S., Saukova S. Changes in the racial structure of Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni population in the South of the
Russian Federation // Helia. - 2016. - V. 39. - P. 113-121.
References
1. Leonova I.N. Molekulyarnyye markery: ispol'zovaniye v selektsii zernovykh kul'tur dlya identifikatsii, introgressii i piramidirovaniya genov // Vavilovskiy zhurnal genetiki i selektsii. - 2013. - T. 17 - № 2 - S. 314-325.
2. Skolotneva E.S., Leonova I.N., Bukatich
E.YU., Salina E.A. Metodicheskiye podkhody k identifikatsii effektivnykh genov, opredelyayushchikh ustoychivost' pshenitsy k kompleksu gribnykh zabolevaniy // Vavilovskiy zhurnal genetiki i selektsii. - 2017. - T. 21 - № 7 - S. 862-869. DOI 10.18699/VJ17.307.
3. Martin G.B. Functional analysis of plant disease resistance genes and their downstream effectors // Curr. Opin. Plant Biol. - 1999. - V. 2. - P. 273-279.
4. Meyers B.C., Chin D.B., Shen K.A., Sivaramakrishnan S., Lavelle D.O. [et al.]. The major resistance gene cluster in lettuce is highly duplicated and spans several megabases // Plant Cell. - 1999. -V. 10. - P. 1833-1846.
5. Ellis J.G., Jones D. Structure and function of proteins controlling strain-specific pathogen resistance in plants // Curr, Opin. Plant Biol. - 1998. -V. 1. - P. 288-293.
6. Bouzidi M.F. Badaoui S., Cambon F., Vear F., De Labrouhe D.T., Nicolas P., Mouzeyar S. Molecular analysis of a major locus for resistance to downy mildew in sunflower with specific PCR-based markers // Theor. Appl. Genet. - 2002. - V. 104. - P. 592600.
7. CHekalin N.M. Geneticheskiye osnovy selektsii zernobobovykh kul'tur na ustoychivost' k patogenam. - Poltava: Intergrafika, 2003. - 186 s.
8. Miller J.F. Registration of five oilseed sunflower germplasm restorer lines (RHA373-377) and two nuclear male-sterile populations (nms 274 and 801) // Crop Sci. - 1992. - V. 32 - P. 1298.
9. Gascuel Q., Martinez Y., Boniface M.C., Vear
F., Pichon M., Godiard L. The sunflower downy mildew pathogen Plasmopara halstedii // Molecular Plant Pathology. - 2015. - V. 16 (2). - P. 109-122. DOI 10.1111/mpp.12164.
10. Jocic S., Miladinovic D., Imerovski I., Dimitrijevic A., Cvejic S., Nagl N., Kondic- Spika A. Towards sustainable downy mildew resistance in sunflower // Helia. - 2012. - No 35 - P. 61-72.
11. Bertero de Romano A., Romano C., Bulos M., Altieri E., Sala C. A new gene for resistance to downy mildew in sunflower // Proc. of Intern. Symposium
"Sunflower Breeding on Resistance to Diseases" Russia, Krasnodar, 2010, June 23-24. - P. 141-146.
12. Bachlava E., Radwan O.E., Abratti G., Tang S., Gao W., Heesacker A.F., Bazzalo M.E., Zambelli A., Leon A.J., Knapp S.J. Downy mildew(Pl8 and Pl14) and rust (RAdv) resistance genes reside in close proximity to tandemly duplicated clusters of non-TIR-like NBS-LRR-encoding genes on sunflower chromosomes 1 and 13 // Theor. Appl. Genet. - 2011. -V. 122. - P. 1211-1221.
13. Vear F., Gentzbittel L., Philippon J., Mouzeyar S., Mestrie E., Roeckel-Drevet P., D.T. de Labrouhe, Nicolas P. The genetics of resistance to five races of downy mildew (Plasmopara halstedii) in sunflower (Helianthus annuus L.) // Theor. Appl. Genet. - 1997. - V. 95 (4). - P. 584-589. DOI 10.1007/s00 1220050599.
14. Zimmer D.E., Kinman M.L.. Downy mildew resistance in cultivated sunflower and its inheritance // Crop Sci. - 1968. - V. 12 (6). - P. 749-751. DOI 10.2135/cropsci1972.0011183X 001200060009x
15. Liu Z., Gulya T.J., Seiler G.J., Vick B.A., Jan C.-C. Molecular mapping of the Pl16 downy mildew resistance gene from HA-R4 to facilitate marker-assisted selection in sunflower // Theor. Appl. Genet. -2012. - V. 125. - P. 121-131.
16. Zolan M.E., Pukkila P.J. Inheritance of DNA methylation in Corpinus cinereous // Mol. Cell Biol. -1986. - Vol. 6. - No 1. - R. 195-200.
17. Saghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., Allard R.W. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics // PNAS USA. - 1984. - 81. - P. 8014-8018.
18. Lander E.S., Green P., Abrahamson J., Barlow A., Daly M.J. Lincoln S.E., Newburg L. MAPMAK-ER: an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations // Genomics. - 1987. - V. 1. - P. 174-181.
19. Radwan O., Bouzidi M.F., Vear F., Philippon J., D.T. de Labrouhe, Nicolas P., Mouzeyar S. Identification of non-TIR-NBS-LRR markers linked to the P15/P18 locus for resistance to downy mildew in sunflower // Theoretical and Applied Genetics. - 2003. -V. 106. - P. 1438-1446. DOI 10.1007/s00122-003-1196-1.
20. Pankovic D., Radovanovic N., Jocic S., Satovic Z., Skoric D. Development of Co-Dominant Amplified Polymorphic Sequence Markers for Resistance to Sunflower Downy Mildew Race 730 // Plant Breeding. - 2007. - V. 126 (4). - P. 440-444. DOI 10.1111/j.1439-0523.2007.01376.x.
21. Bert P.F., Tourvieille de Labrouhe D., Philippon J., Mouzeyar S., Jouan I., Nicolas P., Vear
F. Identification of a second linkage group carrying genes controlling resistance to downy mildew (Plasmopara halstedii) in sunflower (Helianthus annuus L.) // Theor. Appl. Genet. - 2001. - V. 103. -P. 992-997.
22. Ivebor M.V. Identifikatsiya ras vozbuditelya lozhnoy muchnistoy rosy podsolnechnika v regionakh Severnogo Kavkaza i vydeleniye ustoychivogo k nim iskhodnogo materiala dlya selektsii: dis. ... kand. s.-kh. nauk. VNII Risa, Krasnodar, 2009.
23. Pankovic D., Jocic S., Lacok N., Sakac Z., Skoric D. The use of PCR-based markers in the evaluation of resistance to downy mildew in NS-breeding material // Helia. - 2004. - No 27. - P. 149-158.
24. Gentzbittel L., Mouzeyar S., Badaoui S., Mestrie E., Vear F., Tourvieille de Labrouhe D., Nicolas P. Cloning and molecular markers for disease resistance in sunflower Helianthus annuus L. // Theor. Appl. Genet. - 1998. -V. 96. - P. 519-525.
25. Markin N.V., Tikhobayeva V.E., Usatenko T.V., Gorbachenko O.F., Usatov A.V. Genotipirovaniye liniy podsolnechnika s razlichnoy ustoychivost'yu k lozhnoy muchnistoy rose s pomoshch'yu STS-markerov // Maslichnyye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - 2012. - Vyp. 2 (151152). - S. 35-39.
26. Soltani Najafabadi M., Abedini R., Eskandari H., Mehrabi R. Monitoring Three Plasmopara halstedii Resistance Genes in Iranian Sunflower Inbred Lines // Iran J. Biotechnol. - 2015. - V. 13 (2). -P. 45-50. DOI 10.15171/ijb. 1047.
27. Viranyi F., Gulya T.J., Tourvierille de Labrouhe D. Recent changes in the pathogenic variability of Plasmopara halstedii (sunflower downy mildew) populations from different continents // Helia. -2015. - V. 38. - P. 149-162.
28. Sedlarova M., Pospichalova R., Drabkova-Trojanova Z., Bartusek T., Slobodianova L., Lebeda A. First report of Plasmopara halstedii new races 705 and 715 on sunflower from the Czech Republic -short communication // Plant Protect. Sci. - 2016. -52. - DOI 10.17221/7/2016-PPS.
29. Spring O., Zipper R. New highly aggressive pathotype 354 of Plasmopara halstedii in German sunflower fields // Plant Protect. Sci. - 2018. - V. 54 -P. 83-86. DOI 10.17221/99/2017-PPS.
30. Iwebor M., Antonova T.S., Saukova S. Changes in the racial structure of Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni population in the South of the Russian Federation // Helia. - 2016. - V. 39. - P. 113-121.
Получено: 08.06.2018 Принято: 17.09.2018 Received: 08.06.2018 Accepted: 17.09.2018
