CC BY
92
ISSN 0202-5493.МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (151-152), 2012
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ЛИНИИ ПОДСОЛНЕЧНИКА С РАЗЛИЧНОЙ
УСТОЙЧИВОСТЬЮ к ложной МУЧНИСТОЙ РОСЕ С ПОМОЩЬЮ STS-МАРКЕРОВ
Н.В. Маркин1, В.Е. Тихобаева1, Т.В. Усатенко2, О.Ф. Горбаченко2, А.В. Усатов1
1НИИ биологии Южного федерального университета, Россия, 344090, Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/1, тел. (863) 243-33-94, e-mail: nmarkin@mail.ru.
2ГНУ ДОС им. Л.А. Жданова ВНИИМК Россель-хозакадемии
Ключевые слова: ложная мучнистая роса (ЛМР), STS-маркеры, маркер-вспомогательная селекция, подсолнечник
УДК 575.12:633.854.78
Введение. Ложная мучнистая роса (ЛМР) подсолнечника, вызываемая грибом Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. & de Toni - одно из наиболее вредоносных заболеваний культивируемого подсолнечника. Поражение посевов этим грибом может составлять до 70 % [1]. Поэтому селекция подсолнечника на устойчивость к ЛМР является одной из приоритетных задач.
Селекция сельскохозяйственных культур на устойчивость к болезням и вредителям трудоемка и связана с созданием инфекционных фонов, проведением вегетационных исследований в лабораторных и полевых условиях. Перспективным является использование специфичных молекулярных маркеров для оценки селекционного материала на ранних этапах развития растений, что может существенно сократить объем работ в полевых условиях.
Устойчивость к широкому кругу патогенов, включающему вирусы, бактерии, грибы, насекомые и нематоды обусловливают гены устойчивости - R-гены. Они содержат консервативные последовательности, которые определяют различные функции. Выделяют не менее пяти классов R-генов: внутриклеточные протеин-киназы; рецептор-подобные протеинки-назы, содержащие богатые лейцином повторы (LRR); внутриклеточные LLR белки, содержащие сайт связывания с нуклеотидами (NBS), и мотив «лейцино-вая молния» (LZ); внутриклеточные NBS-LRR белки, несущие домен гомологичный Toll, и interleukin-1 рецепторам (TIR); LLR белки, обеспечивающие связывание с мембраной внеклеточных белков [2].
Исследования генетических основ резистентности растений подсолнечника к паразиту Plasmopara halstedii позволили определить специфические доминантные гены - Pl-гены, обусловливающие устойчивость к различным расам P. halstedii. По данным литературы, в мировой популяции P. halstedii насчитывают около 37 рас, из которых можно выделить порядка шести-семи рас доминирующих в мире [3]. Гены Pli и Pl2 были идентифицированы в 70-е годы прошлого века и связаны с
устойчивостью к 100 и 300 расам ЛМР [4]. После успешного внедрения этих генов в инбредные линии в течение последующих двух десятилетий появились новые расы этого патогена, преодолевающие обнаруженные ранее гены устойчивости. Позднее был обнаружен ген Pl6, у дикого вида H. annuus, который отвечает за устойчивость к 11 расам ЛМР. В настоящее время показано, что локус Pl6 содержит, по меньшей мере, 11 тесно сцепленных генов, каждый из которых дает устойчивость к одной из рас ЛМР [2]. Ген Pl8 является аналогом гена Pl6, но идентифицирован не у H. annuus, а у H. argophyllus, а Pl7 - у H. praecox. Дальнейший анализ показал, что гены Pl1/Pl2/Pl6 комплекса относятся к 1-ой группе сцепления и причислены к TIR-NBS-LRR группе устойчивости, а гены Pl5/Pl8 комплекса - к 6-ой группе сцепления и non-TIR-NBS-LRR группе. В последних источниках сообщается об обнаружении новых генов устойчивости Pl13 и Pl16 у линии культурного подсолнечника HA-R5, который обусловливает резистентность к расам: 100, 300, 310, 330, 700, 710, 730, 731 и 770, но чувствителен к расам 307 и 703 [3; 5].
С помощью стандартного набора линий-дифференциаторов подсолнечника в регионах Северного Кавказа идентифицировано 7 рас патогена [6; 7; 8]. Установлено, что доминирующее положение в большинстве районов занимает раса 330 с преобладанием на отдельных полях рас 710 и 730. Исходя из этого, селекцию подсолнечника на устойчивость к ложной мучнистой росе в Южном регионе, в том числе и в Ростовской области, следует акцентировать на расы 330, 710 и 730.
Целью настоящей работы являлась оценка в лабораторных условиях устойчивости селекционного материала подсолнечника к расам 330 и 710 возбудителя ложной мучнистой росы и генотипирова-ние линий подсолнечника с различной устойчивостью к ЛМР с помощью STS-маркеров трех Pl-локусов.
Материалы и методы. Объектом исследования служили 16 линий подсол-
нечника - восстановителей фертильности пыльцы ЦМС PET1 из Донской опытной станции масличных культур им. Л.А. Жданова ВНИИМК (табл. 2). Оценку степени устойчивости растений этих линий к расам 330 и 710 ЛМР проводили по методике, описанной в работе Антоновой с соавторами [9]. Критерием восприимчивости при идентификации гриба являлось наличие конидиального спороношения на семядольных и настоящих листьях, некроз и хлороз; критерием устойчивости - отсутствие на растениях проявления болезни. Устойчивость/восприимчивость оценивали как процентное соотношение пораженных и здоровых проростков. Исследование проводили в 3-5 повторах для 50-100 растений каждой линии в камере искусственного климата (Binder, Германия).
Для молекулярно-генетического анализа геномную ДНК выделяли из листовой ткани проростков согласно [10]. Праймеры для идентификации 9 STS-маркеров трех Pl-локусов - Pl5, Pl6 и Pl8 ассоциированных с устойчивостью подсолнечника к ЛМР были отобраны из данных литературы [2; 11] (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика праймеров, использованных для идентификации STS-маркеров Pl-локусов
Прай-мер 5 '-3'последовательность Локус
HaP1 F: GGTAATGGCTGTTGAATTTATGGAGC R: AGCATGATCCGGCTAGAGCCTTCTA Píe
HaP2 F: GTCTACTACATGGTTTCCGTTTTC R: TGCTTCTTCCTTCTATCTCACTC Píe
HaP3 F: GTTTGTGGATCATCTCTATGCG R: TGCTTCTTCCTTCTATCTCACTC Píe
Ha-P1 F: GCCCAAAATTGAAAGAAAGGTGTG R: GGCGAAATTGGTTCCCGTGAGTCG PÍ5, Pís
Ha-P2 F: AATCTTGAGTCATTACCCGAGC R: CAGCGTCTCTGGTAGATCGTTCACC PÍ5
Ha-P3 F: TAGTTAACCATGGCTGAAACCGCTG R: TTTGAAAGATAAGTTCGCCTCTCG Pís, Pís
Ha-P4 F: GCTGTTACTGCCCTCTTCAAAGTC R: CCCAACTCGACATATCTTCAAACC Pís
Ha-P5 F: TAGTTAACCATGGCTGAAACCGCTG R: CCCCATATTGACAAAGAGTTGAGG Pís
Ha-P6 F: TAGTTAACCATGGCTGAAACCGCTG R: CGTCTCTGGTAGATCGTTCACCTT Pís
Полимеразную цепную реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси сле-
дующего состава: 67 мМтрис - HCl, рН 8,8; 16мМ (NH4)2SO4, 2,5 мМ MgSO4, 0,1 мМ меркаптоэтанола, 0,25 мМ каждого дНТФ (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ), по 20 пМ праймеров; 2,5 ед. Taq-полиме-разы, 15 нг выделенной ДНК. Амплификацию проводили в термоциклере Palm-Cycler (Corbett Research, Австралия).
Термальный режим реакций подбирали для каждой пары праймеров с учетом их нуклеотидного состава. Для большинства проведенных реакций оптимальным оказался терморежим с начальной денатурацией при 95 оС в течение 3 мин., затем 35 циклов при соблюдении температурно-временного режима: отжиг при 60 оС в течение 30 сек., элонгация - 2 мин. при 72 оС, денатурация при 95 оС - 30 сек., финальная элонгация - 1 мин. Для остальных режим амплификации был следующим: начальная денатурация - 94 °С - 3 мин., затем 33 цикла: 94 °С - 10 сек., 60 °С - 30 сек. и 72 °С -1 мин. 30 сек.; финальная элонгация -5 мин. при 72 °С.
Продукты амплификации разделяли в 1 %-ном агарозном геле с бромистым этидием, используя трис-боратный буфер. После окончания электрофореза гели фотодокументировали (GelDoc 2000, BioRad, США). В качестве маркера массы, использовали Gene Ruler 1 Kb DNA Ladder (Fermentas).
Результаты и обсуждение. В лабораторных условиях методом искусственного заражения проростков подсолнечника спорами гриба Plasmopara halstedii проведена оценка устойчивости 16 отцовских линий (R-линии) к двум расам ложной мучнистой росы - 330 и 710. Из 16 изученных линий (табл. 2) 5 линий - J-6/1285, J-8/154, J-11/420, J-11/536 и J-7/465 устойчивы как к 330, так и 710 расам ЛМР. Шесть линий - J-5/2884, J-7/108, J-10/256, J-10/186, J-9/508 и J-9/428, напротив, неустойчивы к этим расами. Остальные пять линий - J-5/3452, J-5/2586, J-7/381, J-11/385 и J-11/112 не поражались расой 330, но оказались неустойчивыми к расе 710. Таким образом, в результате лабораторных ис-
следований были определены линии подсолнечника, контрастно различающиеся по степени поражения ЛМР. Так как устойчивость к возбудителю ЛМР у подсолнечника контролируется доминантными генами, нами протестированы известные STS-маркеры трех Р/-локусов -Р/5, Р/6 и Р/8 ассоциированных с устойчивостью подсолнечника к ЛМР на линиях демонстрирующих различное проявление признака устойчивости к заболеванию с целью определить наиболее информативные для маркер-вспомогательной селекции. Такие ДНК-маркеры могут быть полезными для быстрой идентификации потенциально устойчивых к этому патогену генотипов в больших выборках, что позволит более эффективно решать проблему устойчивости к ЛМР этой сельскохозяйственной культуры.
Таблица 2
Линии подсолнечника, изученные по степени поражения расами 330 и 710 ложной мучнистой росы
Степень поражения ложной
Линия мучнистой росой, %
раса 330 раеа 710
J-5/3452 0 100
J-5/2884 100 100
J-5/2586 0 91,7
J-6/1285 0 0
J-7/108 100 100
J-10/256 100 100
J-7/381 0 100
J-8/154 0 0
J-11/385 0 100
J-11/420 0 0
J-11/536 0 0
J-11/112 0 100
J-7/465 0 0
J-10/186 100 100
J-9/508 92 100
J-9/428 100 100
Из 9 изученных STS-маркеров (табл. 1) только два - НаР2 и НаР3 - маркирующие локус Р/6 оказались информативными и позволили из 5, устойчивых к ЛМР линий, маркировать 4 линии: J-6/1285, J-8/154, J-11/420 и J-7/465. При этом в генотипе устойчивых линий определены
специфичные ПЦР-фрагменты размером около 1200 п.н. (НаР2) и 1800 п.н. (НаР3), что согласуется с данными представленными в работе [2]. Интересно отметить, что третий из маркеров локуса Pl6 - HaP 1, праймеры которого фланкируют участок (около 2000 п.н.), включающий маркерные последовательности НаР2 и НаР3, не позволил идентифицировать устойчивые генотипы. Протестированные STS-марке-ры локусов - Pl5 и Pl8 (табл. 1) не позволили определить устойчивые к ЛМР генотипы, так как одинаково представлены у всех исследованных линий. Необходимо отметить, что у подсолнечника болезнь может не проявляться на ранних этапах роста растения [12]. Кроме того показано, что здоровые по внешним признакам растения подсолнечника, выросшие в окружении больных, дают семена, которые являются носителями инфекционного начала возбудителя ЛМР [13]. В этой связи растения линии J-11/536 проявившие устойчивость к ЛМР на раннем этапе роста и не маркированные с помощью STS по локусам устойчивости необходимо исследовать в течение всего периода вегетации, а также протестировать семенной материал этих образцов.
А
■»■" -9Ят.тт ¿¿Шш-тшш
и та иш « гаи -.ж « ш ш » да»
1ИЮ W3J ИСКИ ШУ J.IW3D мм» » чаш wi
____■»я _ m m шт_ ••
Рисунок - Электрофореграмма продуктов амплификации геномной ДНК линий подсолнечника: А) с праймером НаР2 и В) с праймером НаР3. Представлены результаты двух независимых ПЦР реакций для каждой линии. Фрагменты уникальные для устойчивых к ЛМР (расы 330 и 710) линий подсолнечника обведены. Чертой отмечен образец, проявивший устойчивость к ЛМР в лабораторных испытаниях, но при этом специфичный ПЦР-фрагмент не идентифицирован.
М - маркер массы (1 КЬ).
Заключение. Таким образом, проведена оценка устойчивости Rf-линий подсолнечника селекции Донской опытной станции масличных культур им. Л.А. Жданова ВНИИМК к наиболее распространенным в Ростовской области расам ложной мучнистой росы - 330 и 710. В лабораторных условиях методом искусственного заражения определены линии, контрастно различающиеся по устойчивости к этим расам ЛМР и с помощью 9 STS-маркеров трех Pl-локусов - P/5, P/6 и P/8 ассоциированных с устойчивостью подсолнечника к ЛМР линии были гено-типированы. Из 9 изученных STS-маркеров только два - НаР2 и НаР3 (ло-кус P/6) позволили идентифицировать линии продемонстрировавшие устойчивость к ЛМР в условиях искусственного заражения. Изученные ДНК-маркеры НаР2 и НаР3 могут представлять особый интерес в маркер-вспомогательной селекции подсолнечника на устойчивость к заболеванию ЛМР.
Исследование выполнено в рамках государственной темы Министерства образования и науки РФ (регистрационный номер: 4.5642.2011), при финансовой поддержке ФЦП Министерства образования и науки РФ (госконтракт № 16.740.11.0485).
Список литературы
1. Подсолнечник (монография под ред. Пустовойта В.С.). - М.: Колос, 1975.
- 592 с.
2. Bouzidi, M.F. Molecular analysis of a major locus for resistance to downy mildew in sunflower with specific PCR-based markers / M.F. Bouzidi, S. Badaoui, F. Cambon, F. Vear, De Labrouhe D. Tourvielle, P. Nicolas, S. Mouzeyar // TheorAppl Genet. -2002. - V. 104. - P. 592-600.
3. Liu, Z. Molecular mapping of the P/i6 downy mildew resistance gene from HA-R4 to facilitate marker-assisted selection in sunflower / Z. Liu, T.J. Gulya, G.J. Seiler, B.A. Vick, C-C. Jan // Theor. Appl. Genet. - 2012.
- V.125. - P. 121-131.
4. Zimmer, D.E. Phisiological specialization between races of P/asmopara ha/ste-
ISSN 0202-5493.МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (151-152), 2012
dii in America and Europe / D.E. Zimmer // Phytopatology. - 1974. - V.64. - P. 14651467.
5. Mulpuri, S. Inheritance and molecular mapping of a downy mildew resistance gene, Pl13 in cultivated sunflower (Helian-thus annuus L.) / S. Mulpuri, Z. Liu, J. Feng, T.J.Gulya, C-C. Jan // Theor. Appl. Genet. -2009. - V.119. - P. 795-803.
6. Антонова, Т.С. Новые расы возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника на Северном Кавказе / Т.С. Антонова, Н.М. Арасланова, С.З. Гучетль, М.В. Ивебор, Т.А. Челюстникова, С.А. Рамазанова // Масличные культуры: Науч.-техн. бюл. ВНИИМК. - Краснодар, 2006. - Вып. № 1 (134) - С. 18-23.
7. Антонова, Т.С. Новые расы возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника / Т.С. Антонова, Н.М. Арасла-нова, М.В. Ивебор // Вестник Россельхо-закадемии. - 2006. - № 3. С. 37-38.
8. Ивебор, М.В. Идентификация расового состава популяции Plasmopara halstedii в регионах Северного Кавказа / М.В. Ивебор, Т.С. Антонова, Н.М. Арасланова // Наука Кубани. - 2007. - № 2. - С. 47-50.
9. Антонова, Т.С. К вопросу о расовой принадлежности возбудителя ложной мучнистой росы на подсолнечнике на Северном Кавказе / Т.С. Антонова, Н.М. Арасланова, А.В. Головин // Науч. -техн. бюл. ВНИИМК. Краснодар, 2000. - 123. -С.16-20.
10. Маркин, Н.В. RAPD-анализ генотипов солеустойчивых форм горчицы (Brassica juncea L.) / Н.В. Маркин, А.В. Усатов, М. Федоренко // Экологический вестник научных центров Черноморского экономического сотрудничества. - 2006. -№ 2. - С. 78-81.
11. Radwan, O. Development of PCR markers for the Pl5/Pl8 locus for resistance
to Plasmopara halstedii in sunflower, Helian-thus annuus L. from complete CC-NBS-LRR sequences / O. Radwan, M.F. Bouzidi,- P. Nicolas,- S. Mouzeyar // TheorAppl Genet. -2004. - V. 109. - P. 176-185.
12. Новотельнова, Н.С. Ложная мучнистая роса подсолнечника. Таксономия и биология возбудителя, патогенез заболевания / Н.С. Новотельнова. - М.-Л.: Наука, 1966. - 150 с.
13. Тихонов, О.И. Биологические особенности и пути снижения вредоносности возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника в Краснодарском крае / О.И. Тихонов // Автореф. канд. дисс. -Краснодар, 1969. - 24 с.
