CC BY
56
ЛИТЕРАТУРА
1. Бакстон П. Дерматология: Пер. с англ. - М.: БИНОМ, 2006.
2. Барабанов А. Л., Рабизо Е. С. // Материалы 4-й Российской науч.-практ. конф., посвящ. 125-летию Санкт-Петербургского научного общества дерматовенерологов им. В. М. Тарновского. 21-22 октября 2010 г. - СПб, 2010.-- С. 15-16.
3. Доценко В. Л., Нешкова Е. А., Яровая Г. А. и др. // Вопр. мед. химии. - 1994. - Т. 40, № 3. - С. 20-25.
4. Зверькова Ф. А. Болезни кожи детей разного возраста. - СПб: СОТИС, 1994.
5. Королюк М. А., Иванова Л. И., Майорова И. Г. и др. // Лаб. дело. - 1988.- № 1. - С. 16-19.
6. Кузнецова Т. П., Прошина Л. Я., ПриваленкоМ. Н. // Лаб. дело.— 1982.-- № 8.-- С. 456-458.
7. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Меньшиков В. В., Делекторская Л. Н., Золотницкая Р. П. и др. -М., 1987. - С. 206-207.
8. МерцаловаИ. Б. // Лечащий врач. -2010. - № 5.-- С. 32-33.
9. Микашинович З. И., Уразовская Е. В., Квасов А. Р. // Вестн. РУДН. - 2008. - № 7. - С. 446- 450.
10. Мяделец О. Д., Адаскевич В. П. Морфофункциональная дерматология. - М.: Медлит, 2006.
11. Саркисян О. Г. Особенности изменений метаболических процессов при атрофических кольпитах и их коррекция: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Ростов-н/Д., 2000.
12. Сергеев А.Ю. // Вестн. дерматол. и венерол. - 2001. - № 5. - С. 8-11.
13. Уразовская Е. В. Способ восстановления роста ногтя. Описание изобретения к пат. 2253386, 2005. РФ // БИМП. - 2005. - № 16.
14. Уразовская Е. В., Микашинович З. И., Коваленко Т. Д., Темников В. Е. // Валеология. - 2011. - № 1. - С. 64-69.
15. Уразовская Е. В., Микашинович З. И. // Валеология. - 2011. - № 3. - С. 50-54.
16. Цыкин А. А. Онихомикозы: ДНК-диагностика, совершенствование комбинированной терапии: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - М., 2008.
Поступила 09.12.11
© А. Е. КРАТНОВ, 2012
удк 616.127-005.4-07:616.155.34-008.9
А. Е. Кратнов
внутриклеточный метаболизм нейтрофилов при различных формах ишемической болезни сердца
Кафедра терапии педиатрического факультета Ярославской государственной медицинской академии
Изучали внутриклеточный метаболизм нейтрофилов у 96 пациентов, из которых 56 (58,3%) страдали ишемической болезнью сердца (ИБС). Обнаружено, что у больных ИБС по сравнению с пациентами без ИБС наблюдается увеличение производства нейтрофилами активных форм кислорода на фоне снижения внутриклеточной активности каталазы и роста содержания лактата в фагоцитах. Активация кислородзависимого метаболизма нейтрофилов при утяжелении ИБС от нестабильной стенокардии к инфаркту миокарда, обусловленная ростом содержания в крови циркулирующих иммунных комплексов, не компенсировалась повышением внутриклеточной активности ферментов системы антиоксидантной защиты. Наибольшая активация НАД(Ф)Н-оксидазы нейтрофилов (производство супероксидного анион-радикала) выявлялась у больных с инфарктом миокарда с зубцом Q и сопровождалась максимальным ростом содержания в фагоцитах лактата, уровень которого почти в 2 раза превышал показатели у пациентов без ИБС. Можно полагать, что в условиях острой гипоксии, возникающей при ишемии миокарда у больных ИБС, в нейтрофилах увеличивается образование лактата, способствующего развитию внутриклеточного ацидоза, усилению действия кислородзависимых факторов и приводящего к деструкции фагоцитов.
Ключевые слова: метаболизм, нейтрофилы, ишемическая болезнь сердца
A.Ye. Kratnov
THE INTRACELLULAR METABOLISM OF NEUTROPHILS UNDER DIFFERENT FORMS OF ISCHEMIC
HEART DISEASE
The article deals with the results of study of the intracellular metabolism of neutrophils in 96 patients including 56 (58.3%) patients with ischemic heart disease. It is established that in patients with ischemic heart disease as compared with patients without ischemic heart disease occurs the increase of neutrophils ' producing of active forms of oxygen against the background of decrease of intracellular activity of catalase and increase of concentration of lactate in phagocytes. Under severing of ischemic heart disease from unstable stenocardia to cardiac infarction the activation of oxygen-depending metabolism of neutrophils conditioned by increase of concentration of immune complexes circulating in blood was not compensated by increasing of intracellular activity of enzymes of system of antioxidant defense. The maximum activation of NAD(F)N-oxidase of neutrophils (production of superoxide anion-radical) was detected in patients with cardiac infarction with Q-wave. This condition was accompanied by maximal increase of concentration of lactate in phagocytes up to twice higher exceed the level of indicators in patients without ischemic heart disease. It can be assumed that in conditions of acute hypoxia occurring under myocardium ischemia in patients with ischemic heart disease, the lactate production increases in neutrophils hence the triggering of development of intracellular acidosis, impact of oxygen-depending factors and phagocytes destruction.
Key words: metabolism, neutrophils, ischemic heart disease
Для корреспонденции:
Кратнов Андрей Евгеньевич, д-р мед. наук, проф., зав. каф. терапии Адрес: 150000, Ярославль, ул. Революционная, 5 Телефон: 8(4852)79-29-05 E-mail: kratnov@mail.ru
Эндотелиальная дисфункция является наиболее ранним признаком поражения сосудов и выявлена при многих сердечно-сосудистых заболеваниях [15]. Один из важных факторов повреждения эндотелия - нейтрофилы (НФ), которые при участии образуемых ими кислородных радикалов запускают липопероксидацию в мембранах эндотелиоцитов,
БИОХИМИЯ
а с помощью эластазы отслаивают их от базальной мембраны [7]. Обнаружено, что одним из прогностических маркеров риска кардиальной смерти является увеличение количества НФ в периферической крови [12].
Целью настоящего исследования было изучение состояния внутриклеточного метаболизма НФ у больных с различными формами ишемической болезни сердца (ИБС).
Материалы и методы. Материалом для исследования являлась периферическая кровь, анализ которой осуществляли при поступлении больных в стационар. НФ выделяли из гепаринизированной крови в двойном градиенте плотности фиколла - верографина 1,077 и 1,092 г/мл. Для исследования брали клетки второй интерфазы, которую на 95% составляли НФ. Количество НФ в клеточной суспензии подсчитывали в камере Горяева с использованием прижизненной окраски раствором метиленового синего в 3% уксусной кислоте (краска Тюрка) для определения жизнеспособных клеток. Жизнеспособность фагоцитов, оцениваемая по трипановому тесту, составляла более 90%. Для достижения концентрации 5 • 106 НФ в 1 мл клеточную суспензию разводили средой 199.
Для изучения активности мембранной НАД(Ф) Н-оксидазы НФ использовали тест восстановления нитро-синего тетразолия (НСТ-тест), который выполняли количественным спектрофотометрическим методом по Т. А. Gentle и R. A. Thompson [11] с использованием 0,2% раствора ни-тросинего тетразолия («Reanal», Венгрия) на фосфатном буфере с рН 7,2, фиксацией клеток метанолом и растворением восстановленного диформазана в смеси 2М калия гидрокси-да и диметилсульфоксида 3:5 по объему. Фотометрию проводили при X 492 нм. В качестве индуктора кислородзависи-мого метаболизма НФ использовали фитогемагглютинин из бобов фасоли (Phaseolus vulgaris) («ПанЭко», Россия). При определении стимулированного НСТ-теста в пробирки с НФ добавляли 100 мкл активатора.
Активность миелопероксидазы в НФ изучали с использованием 0,04% раствора ортофенилендиамина на фосфатном буфере с рН 5,0 и добавлением 0,33% раствора перекиси водорода в соотношении 20:1 по объему. Реакцию останавливали через 10 мин 10% раствором серной кислоты. Бланки-ровка проходила по раствору ортофенилендиамина и серной кислоты в тех же соотношениях, но без клеточного лизата. Фотометрию проводили при X 492 нм. Калибровочные растворы готовили разведением стандартной пероксидазы хрена («Sigma Chemical», США) в фосфатном буфере с рН 5,0 от 0,1 до 100 Ед Sigma/мл [8].
Определение активности каталазы в НФ было основано на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс. Реакцию запускали добавлением 0,03% раствора перекиси водорода. В холостую пробу вместо лизата НФ вносили дистиллированную воду. Реакцию останавливали через 10 мин добавлением 4% раствора молибдата аммония. Интенсивность окраски измеряли при X 410 нм против контрольной пробы с дистиллированной водой [6].
Для изучения активности глутатионредуктазы в НФ в контрольную и опытную пробы, содержащие по 500 мкл разведенного клеточного лизата НФ, добавляли 1500 мкл дистиллированной воды, 300 мкл трис-НО-буфера и 100 мкл НАДН на трис-буфере. Реакцию запускали добавлением в опытную пробу 200 мкл 0,033 мМ раствора окисленного глу-татиона на фосфатном буфере, в контрольную пробу вносили 200 мкл дистиллированной воды, после чего проводили фотометрию при X 340 нм. Пробы оставляли при 37oC на 30 мин. Для остановки реакции пробы помещали в холодильник на 10 мин при 40С. Повторно проводили фотометрию [3].
В основе определения содержания лактата (молочной кислоты) в НФ лежала способность пероксида водорода, образующегося при превращении лактата в пируват под действием лактатоксидазы, взаимодействовать с n-хлорфенолом и 4-аминоантипирином при участии пероксидазы с образо-
Таблица 1
Показатели внутриклеточного метаболизма нФ и уровня Цик в зависимости от наличия иБс (X ±
Показатель Пациенты без ИБС (n = 40) Пациенты с ИБС (n = 56) Р
Спонтанный НСТ-тест, нмоль 89,2±28,2 98,3±21,6 нд
Стимулированный НСТ-тест, нмоль 100,1±29,1 112,4±26,6 0,02
Миелопероксидаза, SED 14,3±4,2 17,6±8,2 0,02
Глутатионредуктаза, нмоль • л"1 • с"1 64,8±34,9 66,6±58,2 нд
Каталаза, мкат/л 730,2±276,9 507,8±366,1 0,002
Лактат, ммоль/л 1,2±0,3 1,9±0,9 0,00005
ЦИК, ед. опт. пл. 96,2±32,2 117,8±82,6 нд
Примечание. нд - не достоверно.
ванием окрашенного хинониминового продукта - квинино-мина. Фотометрию исследуемого образца и калибровочной пробы проводили при X 500 нм против холостой пробы. Использовали набор реагентов «Витал диагностикс СПб» [14].
Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли по методу A. Digean и В. Mayer в модификации В. Гашковой и соавт. [1], преципитацией в растворе полиэти-ленгликоля при рН 8,4.
Обследовано 96 пациентов. Основную группу составили 56 (58,3%) больных ИБС (средний возраст 69,3±11,6 года), среди которых 24 (42,9%) пациента имели нестабильную стенокардию (НС), 7 (12,5%) - инфаркт миокарда без зубца Q (га^-ИМ) и 25 (44,6%) - инфаркт миокарда с зубцом Q (Q-ИМ). В группу сравнения вошли 40 (41,7%) пациентов (средний возраст 41,2±12,4 года) без ИБС, для исключения которой выполняли электрокардиографию (ЭКГ), велоэрго-метрию, холтеровский мониторинг, ЭКГ, эхокардиографию. Критерии исключения из исследования - курение, сахарный диабет, ожирение, бронхиальная астма, злокачественные новообразования, хронический алкоголизм.
Статистическую обработку данных проводили с помощью параметрических и непараметрических методов, используя пакет Statistica 8.0 (StatSoft, Inc., США). Данные исследований представлены в виде средних значений и стандартного отклонения (JT± SD). Различия между группами считались статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты и обсуждение. У больных ИБС по сравнению с группой сравнения отмечены достоверно более высокие показатели стимулированного лектином НСТ-теста, что свидетельствует о примировании НФ (табл. 1). Это сопровождалось достоверным увеличением содержания миелопе-роксидазы и снижением активности каталазы в фагоцитах. Состояние прекондиционирования НФ, приводящее к росту их флогогенного потенциала, было обусловлено увеличением содержания в крови ЦИК, которое было выше по сравнению с показателями группы пациентов без ИБС. Изменения внутриклеточного метаболизма в НФ у больных ИБС наблюдались на фоне достоверного увеличения содержания в них лактата.
При изучении состояния внутриклеточного метаболизма НФ в зависимости от формы ИБС наибольшая спонтанная активность мембранной НАД(Ф)Н-оксидазы НФ, сопровождающаяся примированием клеток на фоне увеличения содержания ЦИК в плазме крови, выявлялась у больных с Q-ИМ (табл. 2). На фоне обнаруженных изменений происходило увеличение активности каталазы в НФ, которая, хотя и достигала максимума при Q-ИМ по сравнению с другими формами ИБС, была достоверно ниже, чем в группе сравне-
Таблица 2
Показатели внутриклеточного метаболизма нФ и уровня Цик в зависимости от формы иБс (X ± SD)
Показатель Пациенты без ИБС (n = 40) Пациенты с НС (1-я группа) (n = 24) Пациенты с œ-Q-ИМ (2-я группа) (n = 7) Пациенты с g-ИМ (3-я группа) (n = 25)
Спонтанный НСТ-тест, нмоль 89,2±28,2 96,2±23* 83,6±18,8 104,5±19,1*, ##
Стимулированный НСТ-тест, нмоль 100±29,1 107,6±24,2 103,5±28* 120,5±27,5*
Миелопероксидаза, SED 14,3±4,2 13,9±6,4 20,3±6,5*, ** 20,3±9*, #
Глутатионредуктаза, нмоль • л-1 • c-1 64,8±34,9 51,9±61,2* 78,1±37,3** 75±60,6#
Каталаза, мкат/л 730,2±276,9 442,4±317,2* 456,6±268* 611,2±443,7*, #, ##
Лактат, ммоль/л 1,2±0,3 1,5±0,4* 1,9±0,7* 2,1±1,1*
ЦИК, ед. опт. пл. 96,2±32,2 118,7±101,9 81,6±54,9 125,6±66,1*
Примечание. * - р < 0,05: по сравнению с контролем, ** - различие между 1-й и 2-й группой. * - различие между 1-й и 3-й группой, ** - различие между 2-й и 3-й группой.
ния (611,2±443,7 < 730,2±276,9 мкат/л). ЦИК-зависимая активация НАД(Ф)Н-оксидазы НФ при Q-ИМ сопровождалась наибольшим ростом содержания в фагоцитах лактата, уровень которого почти в 2 раза превышал показатели пациентов без ИБС (2,1±1,1 > 1,2±0,3 ммоль/л). Различия между группами больных НС и ra-Q-ИМ были связаны с ростом уровня миелопероксидазы во 2-й группе (р = 0,03) при достоверном увеличении активности глутатионредуктазы (р = 0,03). Таким образом, по мере утяжеления ИБС - от НС к ИМ наблюдается активация кислородзависимого метаболизма НФ, которая не компенсируется достаточным увеличением внутриклеточной активности ферментов системы антиоксидант-ной защиты и сопровождается накоплением лактата.
Полагают, что ишемия миокарда при ИБС, характеризующаяся резким снижением парциального давления кислорода, «сенсибилизирует» миокард к реперфузионному «взрыву» окислительных свободнорадикальных реакций [9]. Окисление субстратов цикла Кребса в митохондриях при ишемии миокарда подавлено, вследствие чего может возрастать содержание НАД(Ф)Н и НАДН, приводя к одноэлектронному восстановлению кислорода с образованием супероксидного анион-радикала [4]. Важным источником кислородных радикалов при развитии ишемии миокарда являются активированные НФ [16]. Выявлена воспалительная реакция ише-мизированной ткани, которая характеризуется ранней фазой инфильтрации НФ (24-48 ч) с последующей инфильтрацией моноцитами [17]. Обструкция активированными НФ микро-циркуляторного русла на участке ишемии приводит к развитию феномена невосстановления кровотока (no-reflow phenomenon) капилляров, в том числе коллатералей, который интерферирует с реоксигенацией миокарда [13].
В данном исследовании повышение активности мембранной НАД(Ф)Н-оксидазы НФ при утяжелении ИБС сопровождалось ростом содержания в них лактата, что может быть обусловлено недостатком кислорода. В процессе гликолиза в анаэробных условиях пируват при участии НАДН восстанавливается до лактата. Можно полагать, что на фоне острой гипоксии, возникающей при ишемии миокарда, в НФ, которые для дыхательных процессов используют преимущественно гликолиз, а не митохондриальное дыхание [10], увеличивается
образование лактата, способствующего развитию внутриклеточного ацидоза. Кислая среда в фагоците усиливает действие кислородзависимых флогогенных факторов (пероксида водорода), а во внеклеточной среде создает условия для катаболиче-ского влияния лизосомальных гликозидаз фагоцитов на эндотелиальные клетки [7]. Лактат, действующий как осмотический аттрактант, также способен нарушить целостность плазматической мембраны и инициировать аутодеструкцию клетки [2]. Обнаружено, что НФ разрушаются внутри миокарда через 2 мин после реперфузии, что приводит к повышению концентрации эластазы и лактоферрина в коронарном синусе по сравнению с периферической кровью [13]. При этом известно, что метаболический ацидоз, возникающий при неадекватной оксигенации тканей, характерен для расстройств периферической микроциркуляции. Накопление лактата в крови ухудшает прогноз у кардиореанимационных больных [5]. Заключение. ЦИК-зависимая активация кислородзависимого метаболизма НФ по мере утяжеления ИБС, сопровождаемая некомпенсируемым ростом внутриклеточной анти-оксидантной защиты, наблюдается на фоне повышения содержания в фагоцитах лактата.
ЛИТЕРАТУРА
1. ГашковаВ., МатлИ., КашликИ. // Чех. мед. - 1978. - № 2. - С. 117-122.
2. Князькин И. В., Цыган В. Н. Апоптоз в онкоурологии. - СПб, 2007. - С. 48.
3. Кратное А. Е., Потапов П. П., Власова А. В. и др. // Клин. лаб. диагн. - 2005. - № 2. - С. 33-37.
4. Панкин В. З., Тихазе А. К., Беленков Ю. Н. // Кардиология. - 2000.
- № 7. - С. 48-57.
5. ЛобачеваГ. В., Ваничкин А. В., Федюшин А. В. // Сердце. - 2005.
- № 6. - С. 334-338.
6. Мамонтова Н. С., Белобородова Э. И., Тюкалова Л. И. // Клин. лаб. диагн. - 1994. - № 1. - С. 27-28.
7. Маянский Д. Н. Хроническое воспаление. - М., 1991.
8. Саидов М. З., Пинегин Б. В. // Лаб. дело. - 1991. - № 3. - С. 56-59.
9. Сакс В. А., Конорев Е. А., Григорьянц Р. А., Беленков Ю. Н. // Кардиология. - 1992. - № 3. - С. 82-91.
10. Borregaard N., Herlin Т. // J. Clin. Invest. - 1982. - Vol. 70. - P. 550-557.
11. Gentle T. A., Thompson R. A. // Clinical im^nology. A practical approach / Eds H. G. Gooi, H. Chapel. - New York, 1990. - P. 57-59.
12. Kyne L., Hausdorff J. M., Dukas L. et al. // Am. Heart J. - 2000. -Vol. 139. - P. 94-100.
13. Simpson P. J., Fantone J. C., Mickelson J. K. et al. // Circ. Res. -1988. - Vol. 63. - P. 1070-1079.
14. Sommerhof C. P., Nadel J. A., Basbaum С. В., Caughey G. H. // J. Clin. Invest. - 1990. - Vol. 85. - P. 682-689.
15. Verma S., Anderson Т. J. // Circulation. - 2002. - Vol. 105. - P. 546549.
16. Wahi S., Kave N., Ganguly N. K. et al. // Can. J. Cardiol. - 1991. -Vol. 7. - P. 229-233.
17. Williams F. M., Collins P. D., Tannieze-Zeller M., Williams T. J. // Pharmacol. - 1990. - Vol. 100. - P. 7829-7834.
Поступила 14.09.11
