CC BY
39
УДК 616.155.34:612.67
СТАРЕНИЕ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ НЕЙТРОФИЛОВ
л
А.Е. Кратнов , М.И. Румянцев, A.A. Кратнов
Ярославская государственная медицинская академия
Исследован внутриклеточный метаболизм нейтрофилов у подростков и здоровых людей в возрасте 18—68 лет (средний возраст 40,7 ± 12,8 года). У здоровых лиц без ИБС, в отличие от здоровых подростков наблюдаются различные изменения метаболизма: повышается активность миелопероксидазы, инициирующей свобод-норадикальное оксиление липидов, существенно снижается активность глутатионредуктазы — фермента эндогенной системы анти-оксидантной защиты, принимающей участие в восстановлении нестойких органических гидроперекисей.
Ключевые слова: метаболизм нейтрофилов, старение Key words: metabolism neutrophil, aging
В настоящее время в России сохраняется высокая смертность лиц трудоспособного возраста от сердечно-сосудистых заболеваний [9]. В последние годы одним из факторов риска кардиаль-ной смерти является эндотелиальная дисфункция [17]. Считается, что немаловажное значение в развитии дисфункции эндотелия при ИБС имеет сосудистый окислительный стресс, развивающийся вследствие дисбаланса образования в организме свободных радикалов и их инактивации системой антиоксидантной защиты [14]. Полагается, что основным источником активных форм кислорода в ишемизированном миокарде являются нейтрофилы. При участии кислородных радикалов образуются гидроксирадикалы, запускающие перекисное окисление липидов в мембранах клеток сердца и повреждающие их. В эндотелии под влиянием свободных радикалов
1 Кратнов Андрей Евгеньевич, д-р мед. наук, профессор, заведующий кафедрой терапии педиатрического факультета ЯГМА. Тел.: (4852) 79-29-05. E-mail: kratnov@msail.ru.
возрастает экспрессия молекул адгезии, провоцирующих агрегацию клеток крови и нарушение микроциркуляции [6]. Не исключено, что одним из факторов, способствующих развитию окислительного стресса, является снижение ан-тиоксидантной защиты в нейтрофилах вследствие различных причин, в том числе при старении организма человека.
Цель исследования — сравнить показатели внутриклеточного метаболизма нейтрофилов у здоровых подростков и взрослых людей без ИБС.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследование было включено 40 (46%) взрослых людей в возрасте от 18 до 68 лет (средний возраст 40,7 ± 12,8 года) без достоверно верифицированной ИБС, для исключения которой выполняли электрокардиографию, велоэргометрию, холтеровс-кое мониторирование ЭКГ, эхокардиографию. Критерием исключения было курение. В исследование не включались больные с ожирением, сахарным диабетом типа 2, язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, бронхиальной астмой, зло-
качественными новообразованиями, хроническим алкоголизмом.
Группу сравнения составили 47 (54%) подростков I—II группы здоровья в возрасте от 8—16 лет (средний возраст 12,5 ± 2,3 года), которые в предшествующие 2 мес не имели инфекционных заболеваний и не получали профилактических прививок.
Нейтрофилы выделяли из крови в двойном градиенте плотности фиколла—верографина 1,077 и 1,092 г/мл. Для исследования брали клетки второй интерфазы, которую на 95% составляли нейтрофилы. Тест восстановления нитросинего тетразо-лия (НСТ-тест), оценивающий преимущественно активность НАДФИ-оксидазы нейтрофилов, участвующей в образовании супероксидного анион-радикала, проводили количественным спектрофотомет-рическим методом по T. Gentle и R. Thompson [12] с использованием 0,2% раствора нитросинего тет-разолия («Reanal», Венгрия). В качестве индуктора кислородзависимого метаболизма НФ использовали фитогемагглютинин из бобов фасоли (Phaseolus vulgaris) (предприятие «ПанЭко»). Активность глу-татионредуктазы в лизате нейтрофилов определяли спектрофотометрическим методом по степени окисления НАДФ • Н [3]. Активность миелопероксида-зы в лизате фагоцитов оценивали количественным спектрофотометрическим методом с использованием 0,04% раствора орто-фенилендиамина на фосфатном буфере [8]. Изучение активности катала-зы в нейтрофилах базировалось на способности пе-роксида водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс [5]. Пероксид водорода в нейтрофилах определяли количественным методом, основанным на способности перекиси водорода взаимодействовать с феноловым красным с образованием неидентифицированного продукта [16]. Определение содержания лактата (молочной кислоты) в нейтрофилах основывалось на способности пероксида водорода, образующегося при превращении лактата в пируват под действием лактатоксида-зы, взаимодействовать с n-хлорфенолом и 4-амино-антипирином при участии пероксидазы с образованием окрашенного хинониминового продукта — квининомина [10]. Уровень циркулирующих иммунных комплексов определяли по методу A. Digean и B. Mayer в модификации В. Гашковой и соавт. [1] преципитацией в растворе полиэтиленгликоля при pH 8,4.
Статистическая обработка данных проводилась с помощью статистического пакета Statistica 8.0 («StatSoft, Inc.») с использованием параметрических и непараметрических методов. Данные исследований представлены в виде M ± SD.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При изучении показателей внутриклеточного метаболизма нейтрофилов выявлено (таблица), что с возрастом у людей без ИБС в фагоцитах, с одной стороны, достоверно повышается активность миелопероксидазы (р = 0,0001), с другой — значительно снижается активность глута-тионредуктазы, которая является ферментом системы биорегенерации окисленного глутатио-на (р = 0,001). В фагоцитах у взрослых, в отличие от подростков, достоверно уменьшается содержание лактата (р = 0,0001) и отмечается более высокая активность НАДФ • Н-оксидазы нейтрофилов при стимуляции их лектином (р = 0,02). По данным кластерного анализа показателем, обладающим большей полнотой в связи с возрастными изменениями в нейтрофилах, была активность глутатионредуктазы (рис. 1).
В последние годы считается доказанным, что в развитии ИБС важное значение имеет процесс свободнорадикального окисления, которое возникает на фоне угнетения активности антиок-сидантных ферментов. В данном исследовании выявлено, что с возрастом у здоровых людей в нейтрофилах увеличивается активность мие-лопероксидазы на фоне снижения активности глутатионредуктазы — фермента третьей линии антиоксидантной защиты, она участвует в восстановлении нестойких органических гидропе-роксидов в стабильные соединения. Известно,
Показатели внутриклеточного метаболизма нейтрофилов в зависимости от возраста
Показатель Подростки n = 47 Взрослые n = 40 Р
Спонтанный 80,9 ± 30,5 89 ± t 28,2 нд
НСТ-тест, нмоль
Стимулирован- 82,5 ± 37,3 99,8 ± 29,8 0,02
ный НСТ-тест,
нмоль
Миелопероксида- 8,9 ± 6,3 13,8 ± 4,1 0,0001
за, SED
Пероксид водоро- 0,37 ± 0,26 0,24 ± 0,22 нд
да, ед. опт. пл.
Лактат, ммоль/л 2,3 ± 1,6 1,2 ± 0,3 0,0001
Каталаза, мкат/л 619,6 ± 177,4 709,8 ± 273 нд
Глутатион- 184,9 ± 201,5 65,4 ± 35,7 0,001
редуктаза,
нмоль*л 1 *с 1
ЦИК, ед. опт. пл. 113,6 ± 67,7 95,1 ± 32,6 нд
Метод невзвешенного попарного центроидного усреднения
Спонт. НСТ-тест-
Стим. НСТ-тест-
Лактат---
Миелопероксидаза---
Пероксид водорода---
ЦИК-----
Каталаза ------
Глутатионредуктаза-------
012345678 Расстояние объединения
Рис. 1. Кластерный анализ показателей внутриклеточного метаболизма в нейтрофилах у взрослых по методу невзвешенного попарного центроидного усреднения. ЦИК — циркулирующие иммунные комплексы, спонт. — спонтанный, стим. — стимулированный.
что миелопероксидаза участвует в образовании в нейтрофилах эндогенного окислителя — хлорноватой кислоты, при взаимодействии которой с липидными радикалами образуются активные галоидные радикалы, атакующие белки и нуклеиновые кислоты [4]. Угнетение активности
глутатионредуктазы в нейтрофилах с возрастом у здоровых людей сопровождается уменьшением интенсивности гликолиза, что отражает сниженный уровень лактата в клетках. Выявлена достоверная прямая корреляция (г = 0,34; р < 0,05) показателей глутатионредуктазы и лактата (рис. 2).
Не исключено, что роль гиперхолестерине-мии как классического фактора риска развития и манифестации ИБС завышена. Выявлено, что в группах как с низким, так и высоким уровнем холестерина снижается выживаемость [7]. Об этом свидетельствует также так называемый южноевропейский парадокс — при высоком потреблении жира во Франции и Испании смертность от болезней сердечно-сосудистой системы в этих странах остается низкой. Полагается, что такие протективные факторы, как антиокси-данты, физическая активность, социальная поддержка могут противодействовать влиянию высокого уровня классических факторов риска в Южной Европе [11]. Отмечено также, что ста-тины, увеличивающие выживаемость больных ИБС, обладают антиоксидантным свойством [2].
Рис. 2. Корреляция между содержанием лактата и активностью глутатионредуктазы в нейтрофилах у взрослых людей.
В основе теории старения, сформулированной D. Harman в конце 50-х годов XX в., лежит предположение о накоплении повреждений клеточных структур под действием свободных радикалов [13]. Последние исследования показали, что мутации соматической митохондриаль-ной ДНК при старении могут быть обусловлены ее повреждением свободными радикалами кислорода [15]. Поэтому в современной геронтологии доминирующей становится точка зрения, что первичные причины старения имеют молекулярную природу и связаны с окислительным стрессом. Важное место в его развитии занимают нейтрофилы, обладающие значительным эффекторным потенциалом. Для зрелых фагоцитов характерно метаболическое событие — «респираторный взрыв», проявляющийся повышенным потреблением кислорода и продукцией потенциально микробицидных активных форм кислорода. Мощный цитотоксический эффект свободных радикалов кислорода, используемый природой для уничтожения патогенных микроорганизмов, при неконтролируемой их «утечке» из нейтрофилов может привести к необратимым повреждениям молекул липидов, белков и нуклеиновых кислот собственных клеток организма.
выводы
У взрослых людей без ИБС, в отличие от здоровых подростков, наблюдаются гетерогенные изменения внутриклеточного метаболизма ней-трофилов: увеличение активности миелоперок-сидазы, участвующей в инициации свободнора-дикального окисления липидов и существенное снижение активности глутатионредуктазы — фермента антиоксидантной защиты, принимающей участие в восстановлении нестойких органических гидропероксидов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гашкова В., Матл И., Кашлик И. Циркулирующие комплексы у больных иммунокомплексными заболеваниями и после трансплантации почек // Чех. Мед. 1978. № 2. С. 117-122.
2. Дриницина С.В., Затейщиков Д.А. Антиоксидантные свойства статинов // Кардиология. 2005. № 4. С. 65-72.
3. Кратнов А.Е., Потапов П.П., Власова А.В. и др. Активность глутатионредуктазы в нейтрофилах у больных муковисцидозом // Клиническая лабораторная диагностика. 2005. № 2. С. 33-37.
4. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Свобод-норадикальные процессы при заболеваниях сердечно-сосудистой системы // Кардиология. 2000. № 7. С. 48-61.
5. Мамонтова Н.С., Белобородова Э.И., Тюкалова Л.И. Активность каталазы при хроническом алкоголизме // Клиническая лабораторная диагностика. 1994. № 1. С. 27-28.
6. Маянский Д.Н., Маянская С.Д. Роль нейтрофилов в ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда // Кардиология. 2001. № 12. С. 4-88.
7. Плавинская С.И., Шестов Д.Б. Смертность среди женщин в проспективном исследовании и ее взаимосвязь с основными факторами риска // Кардиология. 1991. № 1. С. 30-33.
8. Саидов М.З., Пинегин Б.В. Спектрофотометричес-кий способ определения активности миелопероксида-зы в фагоцитирующих клетках // Лабораторное дело. 1991. № 3. С. 56-59.
9. Шальнова С.А., Деев А.Д., Оганов Р.Г. Факторы, влияющие на смертность от сердечно-сосудистых заболеваний в российской популяции // Кардиоваску-лярная терапия и профилактика. 2005. № 1. С. 4-9.
10. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под ред. Н.У. Тица. М., 1997. С. 289-290.
11. Elousua R., Marrugat J. Южноевропейский средиземноморский парадокс // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2001. № 1. С. 84-85.
12. Gentle T.A., Thompson R.A. Neutrophil function tests in clinical immunology. Clinical Immunology. A practical approach. Gooi H.G., Chapel H. (eds.). New York: Oxford University Press, 1990. P. 57-59.
13. Harman D. The free-radical theory of aging // Free Radicals in Biol. 1982. № 5. P. 256-275.
14. Heitzer T., Schlinzig T., Krohn K. et al. Endothelial dysfunction, oxidative stress, and risk of cardiovascular events in patients with coronary artery disease // Circulation. 2001. № 104. P. 2673-2678.
15. Ozawa T. Mechanism of somatic mitochondrial DNA mutations associated with age and diseases // Biochim. Biophys. Acta. 1995. Vol. 1271. № 1. P. 177-189.
16. Pick A., Keisari Y. Superoxide anion and hydrogen peroxide production by chemically elicited peritoneal macrophages // Cellular. Immunol. 1981. № 59. P. 301308.
17. Schachinger V., Britten M.B., Zeiher A.M. Prognostic impact of coronary vasodilator dysfunction on adverse long-term outcome of coronary heart disease // Circulation. 2000. № 101. P. 1899-1906.
Поступила 08.02.2010
