CC BY
55
УДК 577.112+577.122:612.646 И.В. Бабушкина, Т.Е. Курильская,
О.П. Ильина, Г.Б. Боровский, Ю.И. Пивоваров ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЗАЩИТА МИОКАРДА И ТРАНСПЛАНТАЦИЯ СЕРДЕЧНЫХ КЛЕТОК
В статье на основе научных исследований подтверждены данные о том, что трансплантация суспензий клеток сердца, несмотря на предварительное подавление синтеза белков, существенно снижает степень повреждения миокарда у экспериментальных животных.
Ключевые слова: защита миокарда, трансплантация, синтез белков, животные.
I.V. Babushkina, T.E. Kuriskayal, O.P. Ilyina, G.B. Borovsky, Yu.I. Pivovarov
MYOCARDIUM ENDOCELLULAR PROTECTION AND CARDIAC CELL TRANSPLANTATION
On the basis of scientific research the data that cardiac cell suspension transplantation, despite preliminary protein synthesis suppression essentially reduces myocardium damage rate of the experimental animals are proved in the article.
Key words: myocardium protection, transplantation, protein synthesis, animals.
Введение. Известно, что трансплантация ксеногенных клеток сердца сопровождалась опережающим приростом внутриклеточных стресс-белков в поврежденном миокарде [6, 3]. Существует предположение, что позитивный эффект клеточной трансплантации при патологии определяется в том числе и содержанием в трансплантате белков с шаперонной активностью. В пользу этой гипотезы свидетельствует ряд исследований, который демонстрирует способность БТШ70 проникать через модельные мембраны [7]. В ряде работ был выявлен защитный эффект экзогенных белков теплового шока [8]. Кроме того, было показано, что ин-трамиокардиальная трансплантация модифицированных мезенхимальных стволовых клеток с повышенным пулом БТШ70 и БТШ60 оказывала положительный эффект при постинфарктном ремоделировании за счет увеличения количества выживших клеток трансплантата [1].
Наши исследования показали, что клеточный трансплантат с заведомо высоким уровнем белков теплового шока оказывает более выраженный протекторный эффект на поврежденный миокард, способствуя существенному увеличению в нем уровня общего пула БТШ70, большей сохранности активности ферментов и меньшему повреждению миокарда у экспериментальных животных. Эти явления отмечались как при сравнении результатов трансплантации немодифицированных суспензий клеток сердца, так и в опытах без трансплантации [2].
Цель исследований. Изучить влияние клеточного трансплантата на характер течения адреналинового повреждения миокарда в условиях системной блокады белкового синтеза.
Материалы и методы исследований. Опыты были проведены на 74 беспородных белых крысах-самцах, массой тела 180-250 г в осенне-зимний период. Возраст животных был не менее 6 месяцев. Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище соответственно нормативам ГОСТ «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ». Опыты на животных выполнялись в соответствии с правилами, регламентированными Приказом МЗ СССР №742 от 13.11.84 г. «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и №48 от 23.01.85 г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных».
Для решения поставленной цели животные были разделены на следующие группы:
1-я группа - подкожное введение адреналина гидрохлорида 0,1 % (в дозе 5 мг/кг) и физиологического раствора в объёме 0,5 мл (контрольная группа (КА), п=23);
2-я группа - подкожное введение адреналина и суспензии неонатальных клеток сердца (Ат, п=17);
3-я группа - подкожное введение адреналина на фоне предварительной блокады синтеза белка (ЦГ а;
п=14);
4-я группа - подкожное введение адреналина и суспензии неонатальных клеток сердца в условиях предварительного подавления синтеза белка (ЦГт; п=14);
5-я группа - интактные животные (п=6).
Подавление синтеза белка вызывали путем однократного внутрибрюшинного введения животным циклогексимида в дозе 1,5 мг/кг за 3 ч до введения адреналина [5]. Животным 2-й и 4-й групп через 10 мин после инъекции адреналина подкожно в область левого бедра вводили трансплантат в дозе 2,5*105 клеток в
0,5 мл физиологического раствора на 100 г веса животного. В качестве трансплантата использовали суспензию клеток сердца новорожденных кроликов (1-2 сут. от момента рождения), которую получали по методике А.Б. Борисова [4]. Выведение животных из эксперимента осуществлялось на 1-е и 3-е сут. от начала эксперимента.
В сердечной ткани экспериментальных животных изучали содержание цитозольных белков теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (включает БТШ72 и БТШ73 - индуцибельную и конститутивную формы БТШ70), активность лактатдегидрогеназы 1 типа (ЛДГ-1). Для контроля морфометрических изменений в сердце рассчитывались клеточный индекс (в 30 срезах исходя из среднего суммарного количества клеток инфильтрата - S среза 10000 мкм2); площадь поперечного сечения мышечных волокон (мкм2 в 30 полях зрения каждого из 30 срезов) и площадь некроза (мкм2 в 30 полях зрения каждого из 30 срезов).
Содержание стресс-белков определялось с использованием иммуноблоттинга. Для выявления БТШ70 применяли первичные антитела и вторичные антитела (Sigma). Содержание белка оценивали на мембране с помощью программы Gel Analysis. При этом рассчитывался коэффициент изменения интенсивности окраски, определяющий во сколько раз интенсивность окраски белкового пятна в опытном варианте больше средней интенсивности окраски пятна у интактных животных (БТШ70 - 1,00 (0,98-1,02)). Коэффициент изменения интенсивности окраски измерялся в условных единицах (у. е.).
Для изучения морфометрических показателей использовали стандартные серийные срезы миокарда левого желудочка, перпендикулярные продольной оси сердца, с помощью видеосистемы «Quantimet 550IW» фирмы «Leica QWin16» и программного пакета «Leica QWin16».
Активность ЛДГ-1 оценивали кинетическим экспресс-методом на спектрофотометре Ultrospec-4050 (LKB, Швеция) с помощью готовых наборов реактивов (P.Z. CORMAY (Польша, Германия)) по методикам, рекомендованным Немецким обществом клинической химии.
Полученные данные в сравниваемых группах анализировали непараметрическим методом с использованием U-критерия Манна-Уитни. Различия считались достоверными при р<0,05. Данные представляли в виде медианы с верхним и нижним квартилями (25-й и 75-й процентили). Статистическая обработка результатов проводилась с помощью статистического пакета программ.
Результаты исследований и их обсуждение. Исследование содержания БТШ70 в миокарде животных контрольной группы показало, что уровень этих белков к 1 сут. эксперимента в сравнении с интактными животными повысился практически в три раза и оставался неизменным до 3 сут. (табл. 1).
При клеточной трансплантации в этих условиях (т. е. при введении адреналина) был отмечен более высокий уровень синтеза белков теплового шока к 1 сут. эксперимента, чем в контроле. Мы полагаем, что подъем содержания БТШ70 на 1-е сут. способствовал большей сохранности кардиомиоцитов за счет более эффективного функционирования механизмов ренатурации поврежденных, неправильно свернутых или агрегированных белков. К третьим суткам наблюдалось достоверное снижение БТШ70 по сравнению с группой КА. По-видимому, данное явление было связано с тем, что стресс-белки выполнили свою защитную функцию.
В миокарде животных с поврежденным миокардом, как и следовало ожидать, циклогексимид блокировал синтез белков теплового шока, о чем свидетельствуют данные приведенные в табл. 1. На всех контрольных точках исследования уровень содержания стресс-белков в данной группе значимо ниже, чем в контроле.
В то же время у животных с трансплантацией неонатальных клеток сердца на фоне предварительного подавления синтеза белка уровень БТШ70 в сердце к 1-м сут. значительно снижался в отличие от групп сравнения. Наши предварительные исследования показали, что трансплантация суспензий клеток сердца в тех же условиях сопровождалась более ранним нарастанием уровня БТШ70 в сравнении с аналогичной группой без трансплантации (к 16-му ч), что свидетельствует об опережающей индукции защитных механизмов в миокарде животных этой группы, а снижение уровня БТШ70 к 1 сут. связано с утратой необходимости синтеза этих белков.
Таблица 1
Содержание белков теплового шока (у. е.) в миокарде экспериментальных (медиана, нижний и верхний квартили)
Группа экспериментальных животных Срок исследований
1-е сутки 3-е сутки
КА 3,19 (3,14-3,36) 3,17 (3,07-3,30)
Ат 3,52 к (3,41-3,57) 2,65 к (2,54-2,75)
ЦГа 0,81 к * (0,74-0,89) 1,03 к * (0,93-1,08)
ЦГт 0,60 к * м (0,56-0,67) 0,98 к * (0,92-1,02)
к - р<0,05 - в сравнении с КА. * - р<0,05 - в сравнении с группой Ат; ^ - р<0,05 - в сравнении с группой ЦГа (по критерию Манна-Уитни).
Примечание: КА - адреналиновое повреждение миокарда; Ат - трансплантация суспензий клеток сердца при повреждении миокарда; ЦГА - адреналиновое повреждение миокарда в условиях подавленного синтеза белка; ЦГт - трансплантация суспензий клеток сердца при повреждении миокарда в условиях подавленного синтеза белка; далее обозначения групп те же.
Активность лактатдегидрогеназы-1 в миокарде животных контрольной группы оказалась существенно ниже, чем у интактных животных (рис.).
Изменение активности ЛДГ-1 в миокарде экспериментальных животных: к - р<0,05 в сравнении с КА;
* - р<0,05 в сравнении с группой Ат; ^ - р<0,05 в сравнении с группой ЦГа (по критерию Манна-Уитни)
В условиях клеточной трансплантации у животных Ат активность лактатдегидрогеназы-1 в миокарде была существенно выше в 1-е сутки наблюдения, чем в опытах с введением только адреналина.
Подавление белкового синтеза у животных при повреждении миокарда приводило к значительному снижению активности ЛДГ-1 в сердце в оба срока исследования в сравнении с КА. В то же время трансплантация неонатальных клеток сердца животным на фоне предварительного подавления синтеза белка оказывала иной эффект. В этом случае активность фермента была ниже, чем в контроле, но выше, чем в аналогичной группе без трансплантации.
Морфологические отклонения в сердце у животных контрольной группы характеризовались увеличением площади миокардиальных волокон и площади некроза, при этом максимальные величины эти показателей достигались к 3-м сут. от начала эксперимента (табл. 2).
Таблица 2
Морфометрические показатели в миокарде экспериментальных животных (медиана, нижний и верхний квартили)
Исследуемый параметр Группа Срок исследований
1-е сутки 3-е сутки
Клеточный индекс, у.е. КА 41,67 (32,94-69,28) 88,86 (34,53-99,07)
Ат 36,03 (29,01-51,04) 61,53 (51,34-69,08)
ЦГа 59,63* (53,15-66,02) 74,04 (62,66-81,70)
ЦГт 43,48 м (30,61-54,03) 54,15 (47,38-62,86)
Площадь кардиомиоцитов, мкм2 КА 381,56 (314,20-410,02) 410,20 (326,35-436,17)
Ат 301,07 к (242,55-321,06) 323,60 (277,15-386,81)
ЦГа 386,74* (369,14-401,12) 445,81 к * (438,16-472,95)
ЦГт 285,73 к м (265,57-307,61) 323,48 м (268,20-336,88)
Площадь некроза, мкм2 КА 563,24 (493,14-626,35) 2115,59 (2054,34-2205,18)
Ат 510,36 (459,01-529,17) 1852,06 к (1808,74-1893,12)
ЦГа 593,65* (578,82-617,95) 2164,99* (2083,02-2245,87)
ЦГт 521,23 (454,90-597,50) 1831,07 к м (1802,25-1900,06)
к - р<0,05 в сравнении с КА; * - р<0,05 в сравнении с группой Ат; ^ - р<0,05 в сравнении с группой ЦГа (по критерию Манна - Уитни).
В этот же период наблюдалась максимальная интенсивность выхода клеток белой крови в зону воспаления. Среди клеток инфильтрата преобладали нейтрофилы, но при этом достаточно большую часть составляли мононуклеарные клеточные элементы, а также встречались единичные фибробласты.
Воспалительный процесс при трансплантации суспензий клеток сердца в этих условиях (введение адреналина) характеризовался меньшим отеком миокардиальных волокон в 1-е сут. и значительным снижением площади очагов некроза к 3-м сут. эксперимента, в отличие от группы сравнения.
Подавление синтеза белков в группе ЦГА сопровождалось большим отеком миокардиальных волокон к 3-м сут. в сравнении с КА.
У экспериментальных животных ЦГт определялись меньшие площадь повреждения и отек миокардиальных волокон, чем в сравниваемых группах (табл. 2). Наиболее существенно эти эффекты проявлялись через 72 ч от начала эксперимента, в этот срок площадь некроза в миокарде была на 15,4 %, а отек миокардиальных волокон на 27,4 % ниже, чем в группе без трансплантации. Таким образом, клеточная трансплантация, несмотря на исходное подавление синтеза белков теплового шока, обеспечивала защиту миокарда от повреждения.
При сравнении Ат и ЦГт было выяснено, что при разной исходной реактивности миокарда один и тот же трансплантат оказывал различное действие на защитные внутриклеточные стресс-белки и ферменты, но обеспечивал однотипный характер выраженности воспалительного процесса, что очевидно свидетельствовало о воздействии других биологически активных веществ трансплантата на поврежденный орган.
Литература
1. Влияние стресс-белков на переживаемость мезенхимальных стволовых клеток костного мозга после интрамиокардиальной трансплантации на фоне постинфарктного ремоделирования сердца / С.А. Афанасьев, Л.П. Фалалеева, Т.Ю. Реброва [и др.] // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2008. -№ 3. - С. 123-127.
2. Воздействие модифицированного клеточного трансплантата на течение адреналинового повреждения миокарда / И.В. Бабушкина, Т.Е. Курильская, Ю.И. Пивоваров [и др.] // Бюл. Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2010. - № 5(75). - С. 217-221.
3. Влияние клеточной трансплантации на индукцию белков теплового шока в поврежденном сердце / Б.К. Бадуев, Г.Б. Боровский, В.К. Войников [и др.] // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2009. - № 3. - С. 149-153.
4. Борисов А.Б. Методы культивирования клеток. - Л.: Наука, 1988. - С. 290-299.
5. Особенности распределения [3Н]циклогексимида, биосинтез белка и ДНК в органах крысы после суб-летального блока трансляции / Ю.И. Митрохин, М.Н. Гутникова, П.Я. Бойков [и др.] // Биохимия. -1987. - Т. 52. - № 6. - С. 969-977.
6. Атеросклероз и клеточная терапия / А.А. Рунович, В.К. Войников, Ю.И. Пивоваров [и др.]. - Иркутск: Дом печати, 2005. - 304 с.
7. Harada Y., Sato C., Kitajima K. Complex formation of 70-kDa heat shock protein with acidic glycolipids and phospholipids // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2007. - Vol. 353. - P. 655-660.
8. Treatment with extracellular HSP70/HSC70 protein can reduce polyglutamine toxicity and aggregation / T.V. Novoselova, B.A. Margulis, S.S. Novoselov [et al.] // J. Neurochem. - 2005. - Vol. 94. - P. 597-606.
