CC BY
21
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В МЕДИЦИНЕ И БИОЛОГИИ
УДК 577.11 2+577.122:612.646
Б.К. Бадуев, А.А. Рунович, Г.Б. Боровский, В.К. Войников, С.С. Голубев, Т.Е. Курильская,
Ю.И. Пивоваров
ВЛИЯНИЕ КСЕНОГЕННОЙ ЦИТОТРАНСПЛАНТАЦИИ НА НАКОПЛЕНИЕ БТШ70 В УСЛОВИЯХ АДРЕНАЛИНОВОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ СЕРДЦА
ГУ НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН (Иркутск) СИФИБР СО РАН (Иркутск)
Выявление специфических агентов фетальных и неонатальных клеток, определяющих восстановление функций поврежденного органа, является, одним, из ключевых моментов при. применении, клеточных трансплантатов. В последнее время значительное внимание уделяется цитопротектор-ным свойствам белков теплового шока (БТШ). Наиболее изученным, на сегодняшний день является семейство БТШ70. В условиях стресса (окислительного, метаболического и. др.) в ядре, цитоплазме и. в мембранах клетки, накапливаются, денатурированные белки, связываясь с которыми БТШ препятствуют. агрегации, сохраняя, конформацию белка, необходимую для. восстановления его нормальной функциональной активности. БТШ70, как и. некоторые другие БТШ, кроме того, является, мощным ингибитором, различных этапов развития, программированной клеточной гибели. Существует высокая вероятность того, что позитивный эффект, клеточной трансплантации при. патологии определяется, кроме прочего, за счет, изменения параметров синтеза БТШ в сердце реципиента. Ключевые слова: белки теплового шока, неонатальные клетки кролика
XENOGENIC CYTOTRANSPALANTATION AFFECTS ON HSP70 ACCUMULATION UNDER ADRENALINIC HEART INJURY
B.K. Baduev, A.A. Runovich, G.B. Borovskii, V.K. Voynikov, S.S. Golubev, T.E. Kurilskaya,
Yu.I. Pivovarov
SC RRS ESSC SB RAMS, Irkutsk, Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Irkutsk
Detection of specific agents of fetal and neonatal cells determining the functional recovery of the injured organ is one of the key moments in cell transplantation. Currently much attention is given to cytoprotective features of heat shock proteins (HSP). The best-studied, today is the family of HSP70. Under the stress (oxidation, metabolic, etc.) the cellular nucleus, cytoplasm, and membranes accumulate the denatured, proteins. HSP binds with the denatured proteins and. induces their unwrapping prevents from, aggregation, retaining the protein conformation necessary for the renewal of its normal functional activity. Moreover, HSP70, like many other HSPs, is a potent inhibitor of programmed, cell death. There is high probability that the positive effect of cellular transplantation in pathology is determined, among other things by modulation of HSP70 sinthesis in recipients heart under transplantation of neonatal cells.
Key words: heat shock proteins, neonatal cells
На сегодняшний день в различных областях медицины и биологии выявлено множество новых аспектов функционирования белков как регуляторов биологических процессов и участников системы коммуникаций, которые объединяют биологические молекулы, органеллы, клетки, ткани, органы в единую управляемую систему.
В последнее время особое внимание уделяется изучению стрессовых белков или белков теплового шока. Белки этого класса обладают шапе-ронной активностью, т.е. принимают участие в правильной укладке полипептидных цепей (фол-динге) в нормальных и, особенно, в экстремальных условиях (таких, как тепловой шок, воздействие
сильных оксидантов, интоксикации, ишемии, воспалении и т.д.) [1, 2]. Кроме того, белки теплового шока способствуют ренатурации частично денатурированных или элиминации полностью денатурированных белков.
Выявлена активная роль этих белков в физиологии клетки, цитопротекции, формировании стресс-индуцируемых регуляторных цепей [15]. Активное участие в важнейших процессах клетки является свидетельством того, что белки теплового шока играют ведущую роль в обеспечении репарации и деградации, а нарушение функционирования этих белков может явиться одной из причин дисфункции и повреждения органов и тканей
[19]. Обнаружено участие стрессовых белков в различных патологических процессах, в том числе при сердечно-сосудистых заболеваниях [21]. Изменение количества этих белков в клетке является показателем дегенеративных изменений в клетке, что дает возможность использовать их в качестве маркеров внутриклеточных нарушений.
На уровне сегодняшних представлений белки теплового шока многими авторами расцениваются как часть внутриклеточной стресс-лимитирую-щей системы, способствующей защите клетки от повреждения [3, 7, 20].
На данный момент накоплено большое количество данных об успешном применении трансплантации клеток при целом ряде патологий. Но далеко не всегда действие трансплантации можно объяснить эффектом замещения [13]. Известно, что в организме реципиента клетки трансплантата сохраняют жизнеспособность от нескольких дней до полугода и лишь в единичных случаях наблюдается их пролиферация. Однако эффект от применения клеточной трансплантации наблюдается достаточно долго: от нескольких месяцев до нескольких лет [11]. До настоящего времени неизвестен механизм действия клеточного материала. В связи с этим представляет научный и практический интерес выяснение степени участия белков теплового шока в процессе клеточного повреждения, а также влияние на этот процесс клеточной трансплантации. При использовании стресс-белков как маркеров внутриклеточных изменений можно надеяться выяснить некоторые молекулярные механизмы лечебных эффектов клеточной терапии в свете современных научных знаний.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве экспериментальных животных для исследования действия неонатальных клеточных суспензий в осенне-зимний период использовали беспородных белых крыс-самцов (п = 160) массой тела 180 — 210 г. Возраст животных был не менее 6 месяцев.
Для решения поставленных задач при исследовании эффектов, оказываемых различными суспензиями клеток, животных разделяли на 4 группы.
Г руппа № 1 (контроль). Здоровым крысам подкожно в область правого бедра вводилось 0,5 мл физиологического раствора.
Группа № 2 (контроль действия неонатальных клеточных суспензий). Здоровым крысам подкожно в область правого бедра вводились неонатальные клеточные суспензии сердца и печени кролика (500 тыс. клеток в 0,5 мл физиологического раствора).
Группа № 3 (стандартная модель адреналинового миокардита). По методике Л.М. Непомнящих крысам подкожно в область правого бедра вводили адреналин (5 мг на 1 кг веса) [9]. Сразу после инъекции адреналина подкожно вводился физиологический раствор в объёме 0,5 мл.
Группа № 4 (коррекция миокардита трансплантацией неонатальных клеточных суспензий сердца). Сразу после инъекции адреналина подкожно в
область левого бедра вводились неонатальные клеточные суспензии сердца кролика в дозе 500 тыс. клеток в 0,5 мл физиологического раствора.
Через 1, 4, 8, 12, 16 и 24 часа, затем через 3 и 7 суток от начала эксперимента осуществляли отбор ткани миокарда и получение сыворотки крови животных.
Выделение водорастворимого белка и электрофорез белков проводили по методу Лэммли [17]. Для выявления белков теплового шока использовали антитела на консервативную для белков этого семейства последовательность. Причем использовались антитела для суммарного определения изоформ как конститутивной, так и индуцибель-ной. Вторичные антитела, конъюгированные со щелочной фосфатазой, использовали для детекции первичных антител. Сканирование и анализ мембран проводили при помощи программы Sigma Scan Pro. Величины относительного содержания представляли в условных единицах (у.е.).
Морфометрические исследования образцов сердца выполняли с помощью программного пакета «Leica QWin16». В работе исследовались следующие морфометрические параметры:
1. Абсолютная площадь некрозов — величина измеряется в мкм2, определяется среднее значение в 30 полях зрения.
2. Определение состояния сосудов:
2 Просвета сосуда
сосудистый индекс = ----- ---------
ЬА Ьсреза
(на 10000 мкм2).
3. Качественная характеристика клеточного инфильтрата — по типу клеток.
4. Количественная характеристика клеточного инфильтрата:
2 ^количество клеток
клеточный индекс = ------ ---------
ЬА ^среза
(на 10000 мкм2).
5. Состояние поперечной исчерченности кар-диомиоцитов.
6. Абсолютная толщина мышечных волокон — величина измеряется в мкм2, определяется среднее значение в 30 полях зрения.
При статистической обработке данных для каждой выборки проверяли гипотезу о нормальности распределения тестами Колмогорова — Смирнова. Для определения значимости различий полученных данных (р) в сравниваемых выборках использовали t-критерий Стьюдента. Отличия считались достоверными при р < 0,05.
Статистическая обработка результатов произведена с помощью пакета программ Statistica 6.0 for Windows.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование содержания стрессовых белков в сердце здоровых животных без трансплантации не обнаружило изменений уровня БТШ70 (1,04 ± 0,011 у.е.) на протяжении всего эксперимента.
В процессе развития миокардита действие адреналина на содержание БТШ70 проявилось достаточно быстро: уже через 8 часов содержание БТШ70 было в два раза выше контрольного (1,98 ± 0,07 у.е.), максимальные значения фиксировались к 24 часам (в пять раз более высокий уровень, чем у здоровых животных (5,03 ± 0,08 у.е.)) и после этого оставались высокими до 7-х суток (4,25 ± 0,07 у.е.). При ксенотрансплантации клеточных суспензий неонатального сердца на фоне миокардита, содержание БТШ70 имеет иную динамику. Рост количества этого белка происходит значительно быстрее и опережает соответствующие показатели у животных без трансплантата в 2 раза, достигая максимума к 16 часам от начала эксперимента (5,20 ± 0,05 у.е.). Затем к 24 часам содержание БТШ70 снижается (3,78 ± 0,04 у.е.) и в точке «7 суток» оно в 1,5 раза ниже, чем у животных без трансплантации (2,66 ± 0,04 у.е.) (рис. 1).
В условиях наблюдения за динамикой содержания стресс-белков важно было проследить, как в отмеченные сроки изменяется интенсивность морфологических отклонений в сердце у животных с адреналиновым миокардитом и при трансплантации неонатальных клеток сердца в условиях этой патологии.
При миокардите без трансплантации в сердце животных четко прослеживались все стадии воспаления, включающие сосудисто-эксудативные, клеточные и пролиферативные компоненты (табл. 1). При миокардите без трансплантации наблюдались резко выраженная лейкоцитарная инфильтрация и увеличение сосудистого индекса.
Ксенотрансплантация клеточных суспензий сердца на фоне миокардита приводила к уменьшению интенсивности и сокращению сроков воспаления. Так, в условиях клеточной трансплантации интенсивность лейкоцитарной инфильтрации в миокарде через 24 часа от начала эксперимента
была на 26 % меньше (39,7 ± 5,3), чем у животных с адреналиновым миокардитом (53,6 ± 5,4) (табл. 1).
Начиная с 8 часов от начала эксперимента, происходит достоверное увеличение толщины мышечных волокон (табл. 1).
Кроме того, при менее выраженной клеточной инфильтрации к 7 суткам её состав определялся более существенным вкладом макрофагов и фиб-робластов, в результате чего количество новообразованных волокон и степень заместительного фиброза были значительно выше, чем в опытах предыдущей серии. Кроме этого, при трансплантации наблюдается менее выраженная интенсивность гемодинамических расстройств, зафиксировано достоверное уменьшение показателей сосудистого индекса от 8 часов до 3-х суток от начала наблюдения (табл. 1).
Те же закономерности выявились и при сравнительном анализе толщины мышечных волокон миокарда: в сроки от 16 часов до 3 суток она была достоверно меньшей, чем в опытах без клеточной трансплантации (табл. 1).
Механизм миокардиальной цитопротекции клеточной терапии при адреналиновом повреждении миокарда связан, возможно, с активацией синтеза в кардиомиоцитах стресс-белков (в нашем случае — БТШ70). Уникальный механизм синтеза БТШ приводит к накоплению этих белков в клетках даже в условиях ишемически-метаболическо-го стресса, когда синтез других белков снижен или остановлен [7]. Белки теплового шока играют одну из основных ролей в ренатурации денатурированного, неправильно свернутого или агрегированного белка, восстанавливая тем самым функциональную активность макромолекулы [5, 8, 10]. Известно также, что повышение концентрации БТШ70 защищает клетку от апоптоза [18]. В основе этого процесса лежит неспецифическая шаперонная функция БТШ и непосредственное их участие в
Миокардит —□—Миокардит и трансплантация
Рис. 1. Величина БТШ70 в клетках сердца в различные сроки развитии адреналинового миокардита.
Примечание: * - рu < 0,05 - достоверность различий между группами с миокардитом и группами с миокардитом и трансплантацией.
Таблица 1
Характер сосудистой и клеточных реакций миокарда у животных при введении им адреналина и одновременной трансплантации неонатальных кардиомиоцитов
Сроки получения материала Сосудистый индекс Клеточный индекс Площадь кардиомиоцитов
Группа № 3 (адреналиновый миокардит) Г руппа № 4 (адреналиновый миокардит и трансплантация) Группа № 3 (адреналиновый миокардит) Группа № 4 (адреналиновый миокардит и трансплантация) Группа № 3 (адреналиновый миокардит) Г руппа № 4 (адреналиновый миокардит и трансплантация)
Контроль 0,021 ±0,005 - 212,61 ±11,83 (мкм2)
1 час 0,033 ± 0,006 0,031 ± 0,006 3,2 ± 0,3 2,5 ± 0,3 221,93 ± 10,65 217,42 ± 10,91
4 часа 0,048 ± 0,007** 0,042 ± 0,007** 8,3 ± 0,7 6,1 ± 0,4* 248,52 ± 12,59 220,95 ± 13,32
8 часов 0,061 ± 0,005** 0,047 ± 0,006** 14,7 ± 1,9 10,2 ± 1,3 268,77 ± 13,46** 238,89 ± 12,83
12 часов 0,059 ± 0,006** 0,039 ± 0,006*** 22,5 ± 2,4 17,3 ± 3,7 291,3 ± 15,91** 257,32 ± 11,76**
16 часов 0,047 ± 0,007** 0,037 ± 0,005 31,2 ± 3,8 25,2 ± 4,8 342,81 ± 14,95** 287,59 ± 15,89***
1 сутки 0,045 ± 0,005** 0,034 ± 0,006 53,6 ± 5,4 39,7 ± 5,3 361,28 ± 15,53** 304,28 ± 13,62**
3 суток 0,046 ± 0,008** 0,033 ± 0,007 69,1 ± 7,2 58,7 ± 5,6 389,12 ± 17,34** 332,85 ± 16,73***
7 суток 0,036 ± 0,006 0,039 ± 0,004** 46,2 ± 6,5 22,3 ± 4,1* 249,32 ± 19,49 236,34 ± 13,52
Примечание: * - вероятность различий с результатами группы № 3 (р, < 0,05); ** - вероятность различий с контролем (Р, < 0,05).
специфических сигнальных каскадах програмиру-емой клеточной гибели [7].
В проведенных ранее исследованиях выявлено, что имплантируемые неонатальные клетки содержат в своем составе активные антиоксидант-ные соединения [12]. Это витамины А и Е, микроэлементы, участвующие в активации ферментов антиоксидантной защиты клетки, глутатион и система его ферментов. Одним из возможных механизмов повышения антиоксидантной защиты клетки также является синтез цитозольных белков БТШ. Эти белки блокируют каскадный путь апоп-тоза [14, 16, 18]. Пока не ясно, связан ли этот эффект БТШ с их шапероновыми свойствами. Возможно, он позволяет клетке отслеживать количество денатурированных белков, чтобы инициировать апоптоз.
Обобщая полученные результаты, необходимо отметить ряд существенных моментов. Во-первых, известно, что при воздействии стрессорных нагрузок ответ организма содержит в себе неспецифическую возникающую при действии любого сильного раздражителя стресс-реакцию. В клетках чрезмерно интенсивная стресс-реакция реализуется в виде трех основных повреждающих эффектов: 1) адренергически обусловленная кальциевая внутриклеточная перегрузка; 2) чрезмерное усиление липотропных процессов и реализация липидной триады повреждения биомембран, а именно: активация фосфолипаз и липаз, активация ПОЛ и детергентное действие лизофосфатов и жирных кислот; 3) истощение энергетических и структурных ресурсов [6, 7].
Важно также подчеркнуть, что на уровне клеток белки теплового шока с молекулярной массой 70 кДа участвуют в ограничении повреждающих эффектов стресс-реакции [4, 7, 20]. Также важной особенностью этих белков является их стресс-ин-
дуцибельность. И наконец, БТШ70 обладают ци-топротекторными свойствами и повышают устойчивость клеток и органов к повреждающим воздействиям [3, 5]. Эти три свойства БТШ70 (способность ограничивать повреждающие эффекты стресс-реакции, стресс-индуцибельность и цито-протекторное действие) соответствуют критериям, сформулированным Ф.З. Меерсоном для стресс-лимитирующих систем [6, 7].
Все вышеизложенное свидетельствует в пользу кардиопротекторного действия ксенотран-сплантации клеток миокарда в условиях острого его повреждения.
В нашем исследовании впервые показано, что трансплантация клеточных ксеногенных суспензий сердца способна значительно увеличить скорость накопления стрессовых белков в клетке, причем только при повреждающем воздействии. На основании данных, полученных при морфологических исследованиях, установлена эффективность ксенотрансплантации культуры неонатальных клеточных суспензий для коррекции острого адреналинового повреждения сердца.
Полученные результаты позволяют говорить о том, что механизм позитивного действия трансплантата связан с более быстрым повышением уровня БТШ в ответ на стресс, что ведет к меньшим повреждениям и меньшей гибели клеток, а в дальнейшем к более быстрому восстановлению миокарда.
Работа поддержана грантом программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине».
ЛИТЕРАТУРА
1. Аутоиндуцированная толерантность миокарда к ишемии: роль стресс-белков в механизмах ее возникновения / Ю.Л. Шевченко, А.С. Свистов,
B.В. Тыренко и др. // Физиол. чел. — 1999. — Т. 25, № 1. - С. 134-139.
2. Белки теплового шока: новые перспективы миокардиальной цитопротекции / Ю.Л. Шевченко, А.С. Свистов, В.В. Тыренко и др. // Вестник РАМН. - 1999. - №7. - С. 16-20.
3. Евстигнеева З.Г. Структура и функции ша-перонов и шаперонинов (обзор) / З.Г. Евстигнеева, Н.А. Соловьева, Л.И. Сидельникова // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. - Т. 37.
- С. 5-18.
4. Малышев И.Ю. Белки теплового шока и защита сердца / И.Ю. Малышев, Е.В. Малышева // Бюл. эксперимент. биологии и медицины. - 1998.
- Т. 126, № 12. - С. 604-611.
5. Маргулис Б.А. Белки стресса в эукариотической клетке / Б.А. Маргулис, И.В. Гужова // Цитология. - 2000. - Т. 42, № 4. - С. 323-340.
6. Меерсон Ф.З. Адаптация к стрессорным ситуациям и стресс-лимитирующие системы организма / Ф.З. Меерсон // Руководство по физиологии адаптационных процессов. - М.: Наука, 1986. - 640 с.
7. Меерсон Ф.З. Феномен адаптационной стабилизации структур и защита сердца / Ф.З. Меерсон, И.Ю. Малышев. - М.: Наука, 1993. - 159 с.
8. Наградова Н.К. Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков / Н.К. Наградова // Соросовс-кий Образовательный Журнал. - 1996. - № 7. -
C. 10- 18.
9. Непомнящих Л.М. Моделирование очаговых повреждений миокарда / Л.М. Непомнящих // Патологическая анатомия и ультраструктура сердца. - Новосибирск, 1981. - С. 88-117.
10. Применение гемоперфузии через взвесь криоконсервированных гепатоцитов при острой печеночной недостаточности / М.С. Маргулис, Е.А. Ерухимов, Л.А. Андрейман и др. // Вестн. хир.
- 1992. - № 1. - С. 83-88.
11. Репин В.С. Медицинская клеточная биология / В.С. Репин, Г.Т. Сухих. - М.: БЭБиМ, 1998.
- 200 с.
12. Сравнительная оценка антиоксидантного препарата диквертина и комплекса фетальных тканей при лечении больных коронарным атеросклерозом / А.В. Голдобина, Л.И. Колесникова,
С.Б. Никифоров и др. — БЭБМ, 199В. — 165 с.
13. Bone marrow derived stem cells initiate pancreatic regeneration / D. Hess, L. Li, S. Sakano et al. // Nature Biotechnology. — Vol. 21 (7). — P. 763 — 77G.
14. Cardiomyocyte transplantation improves heart function / R.K. Li, Z.Q. Jia, R.D. Weisel et al. // Ann. Thorac. Surg. — 1996. — Vol. 62. — P. 654 — 66G.
15. Feder M.E. Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology / M.E. Feder, G.E. Hofmann // Annual. Rev. Physiol. — 1999. — Vol. 61. — P. 243 — 2В2.
16. In vivo survival and function of transplanted rat cardiomyocytes / R.K. Li, D.A.G. Mickle, R.D. Weisel et al. // Circ. Res. — 1996. — Vol. 7В — P. 2В3 — 2ВВ.
17. Laemmli U.K. Cleavege of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. — 197G. — Vol. 227. — P. 680 — 685.
1В. LeeJ.S. HSP7G deficiency results in activation of c-Jun N-terminal Kinase, extracellular signal-regulated kinase, and caspase-3 in hyperosmolarity-induced apoptosis / J.S. Lee, J.J. Lee, J.S. Seo // J. Biol. Chem. — 2GG5. — Vol. 280. — P. 6634 — 6641.
19. Lindquist S. The heat shock proteins /
S. Lindquist, E.A. Craig // Annual. Rev. Genet. — 19ВВ. — Vol. 22. — P. 631—677.
2G. Mechanical stress-induced heat shock protein 7G expression in vascular smooth muscle cells is regulated by Rac and Ras small G proteins but not mitogen-activated protein kinases / Q. Xu, GT. Schett, C. Li et al. // Circ. Res. — 2GGG. — Vol. В6.
— Р. 1122—112В.
21. Welch W.J. Cellular and biochemical events in mammalian cell during and after recovery from physiological stress / W.J. Welch, J.P. Suhan // J. Cell. Biol. — 19В6. — Vol. 1G3. — P. 2G35 — 2G52.
Поступила в редакцию G5.G9.2GG6 г.
