CC BY
24
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ РОНКОЛЕЙКИНА И ПРОПОЛИСНОГО МОЛОЧКА ПРИ ИММУНИЗАЦИИ ТЕЛЯТ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА
Андреева А.В., Арсланова Ю.Ф., Мишуковская Г.С.
Резюме
Применение ронколейкина в первые сутки после рождения и прополисного молочка в течение 20 дней способствует повышению иммунологической реактивности организма телят при специфической профилактике сальмонеллеза.
THE EFFICIENCY OF RONCOLEUKIN AND PROPOLISNOGO JELLY THE IMMUNIZATION OF CALVES AGAINST SALMONELLOSIS
Andreeva A.V., Arslanova Yu.F., Misukovskaa G.S
Summary
Application of roncoleukin in the first 24 hours after birth and propolisnoe milk jelly within 20 days improves the organism immunological reactivity in calves in particular prevention of salmonellosis.
УДК 577.112+577.122:612.646
ДИНАМИКА БИОХИМИЧЕСКИХ И МОРФОЛОГИЧЕСКИХ
ПОКАЗАТЕЛЕЙ В ПОВРЕЖДЕННОМ МИОКАРДЕ ПРИ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ В УСЛОВИЯХ СИСТЕМНОГО ПОДАВЛЕНИЯ БЕЛКОВОГО СИНТЕЗА
Бабушкина И.В. - к.б.н.;Ильина О.П.
Иркутская государственная сельскохозяйственная академия, e-mail:babushcinai@mail.ru
Ключевые слова: белки теплового шока, адреналиновое повреждение миокарда, лактатдегидрогеназа-1, креатинкиназа.
Keywords: heat- shock proteins, adrenal myocardial injury, lactic dehydrogenase-1, creatine kinase.
Ранее нами было показано, что трансплантация суспензий клеток сердца с повышенным содержанием белков теплового шока с массой 70 кДа (БТШ70) способствует ранней индукции внутриклеточных механизмов защиты и меньшему повреждению органа [1]. Можно предположить, что протекторный эффект ксенотрансплантации связан с наличием в составе ксенотрансплантата стресс-белков, которые способны проникать в клетки и участвовать в целом ряде важных
регуляторных каскадов в организме [2, 4]. С другой стороны, возможно, что главенствующую роль в предотвращении повреждения миокарда играют внутриклеточные механизмы поврежденного сердца и ксенотрансплантация является лишь триггером. Таким образом, чтобы выяснить какую роль в защите клеток поврежденного органа играют внутриклеточные защитные механизмы миокарда и экзогенные БТШ трансплантата, было важно отделить влияние этих двух механизмов. Цель исследования: оценить влияние клеточного трансплантата на внутриклеточные механизмы защиты поврежденного органа в условиях системного подавления белкового синтеза в миокарде.
Материалы и методы. Для исследования были использованы беспородные белые крысы-самцы (n=127) массой тела 180 - 250 г, возраст животных был не менее 6 месяцев, эксперименты проводились в осенне-зимний период. Для решения поставленной задачи животные были разделены на следующие группы:1 группа - интактные животные; 2 группа - подавление синтеза белка у здоровых животных; 3 группа -подкожное введение Solutio Adrenalini hydrohloridi 0.1% pro injectionibus (в дозе 5 мг/кг) и физиологический раствор в объёме 0.5 мл (контрольная группа); 4 группа - подкожное введение адреналина на фоне предварительной блокады синтеза белка; 5 группа - подкожное введение адреналина и суспензии неонатальных клеток сердца в тех же условиях, т. е. на фоне подавленного синтеза белка.
Для подавления синтеза белка животным за 3 часа до введения адреналина проводилась однократная внутрибрюшинная инъекция циклогексимида в дозе 1,5 мг/кг (4, 5 группы). Группа интактных животных, которая была выведена через 3 часа после инъекции циклогексимида, являлась исходной точкой данного этапа исследования (2 группа). Животным 5-й группы через 10 минут после инъекции адреналина подкожно в область левого бедра, вводили суспензию клеток сердца новорожденных кроликов, которую получали по методике А. Б. Борисова [3] (доза 2,5х106 клеток в 0,5 мл физиологического раствора на кг веса животного).
В сердечной ткани экспериментальных животных изучали содержание цитозольных белков теплового шока с молекулярной массой 70 кДа с помощью иммуноблоттинга (первичные и вторичные антитела фирмы «Sigma»). Активность ферментов креатинкиназы (КК), лактатдегидрогеназы-1 (ЛДГ-1) в миокарде оценивали кинетическими экспресс-методами на спектрофотометре Ultrospec-4050 (LKB, Швеция) с помощью готовых наборов реактивов по методикам, рекомендованным Немецким обществом клинической химии. Содержание пирувата определяли по Умбрайту, содержание лактата определяли с помощью стандартных наборов реактивов «Biocon» (Германия). Для контроля морфометрических изменений в сердце рассчитывались: сосудистый
индекс; клеточный индекс; площадь поперечного сечения мышечных волокон (мкм2) и площадь некроза (мкм ). Для изучения морфометрических показателей использовали стандартные серийные срезы миокарда левого желудочка перпендикулярные продольной оси сердца, с помощью видеосистемы «Quantimet 550IW» фирмы «Leica QWin16» и программного пакета «Leica QWin16». Все указанные параметры изучались через 8, 16, 24, 72 часа от начала эксперимента.
Для определения значимости различий для независимых переменных использовали непараметрические критерии Манна - Уитни и Крускаля-Уоллиса. Отличия считались достоверными при р<0,05.
Результаты исследований. В миокарде животных 2-й группы (с подавленным синтезом белка) содержание БТШ70 было ниже, в сравнении с интактными животными, к трем часам наблюдения и составляло 0,89 у.е., эта точка являлась исходной в нашем исследовании. Через восемь часов от исходной точки в миокарде животных данной группы содержание БТШ70 не изменилось и было ниже уровня стресс-белков у интактных животных, восстановление уровня БТШ70 произошло к 16 часам эксперимента и имело тенденцию к увеличению в последующие сроки исследования (табл. 1).
Активность КК и ЛДГ-1 в миокарде животных 2 группы также снижается в исходной точке и через восемь часов достигает минимальных значений 15,05 (14,95-15,07) и 4,14 (4,13-4,32), у интактных животных активность КК и ЛДГ-1 составляла 17,16 (17,05-17,25) и 5,86 (5,82-5,90), соответственно. Восстановление активности КК и ЛДГ-1 до исходных значений во 2 группе наблюдалось к 16 часам от начала эксперимента.
1. Содержание БТШ70 в суммарном белке из миокарда лабораторных крыс в течение периода 8 часов - 3 суток после введения циклогексимида
(медиана, квартили)
Срок наблюдения 2 группа
Интактные животные 1,00 (0,98-1,02)
Исход (через 3 часа после инъекции циклогексимида) 0,89 (0,88-0,90) 0
8 часов 0,92 (0,89-0,93) 0
16 часов 0,94 (0,90-1,00)
1 сутки 1,06 (1,03-1,15) "
3 суток 1,06(1,02-1,10) "
Примечание: 0 - р<0,05 достоверность различий по сравнению с группой интактных животных (по критерию Манна-Уитни);^ - р<0,05 - в сравнении со сроком «8 часов» в исследуемой группе (по критерию Крускала-Уоллиса).
Снижение уровня БТШ70 в миокарде экспериментальных животных при блокировании в нем синтеза белка и показанная динамика биохимических показателей позволили использовать циклогексимид в
эксперименте, так как его применение позволяет исключить влияние внутриклеточных механизмов защиты в течение 11 часов.
У животных с моделированным повреждением сердца (3 группа) повышение содержания БТШ70 проявилось достаточно быстро (табл. 2), к восьми часам содержание БТШ70 было в два раза выше, чем у интактных животных и составляло 1,86 (1,81-1,93). Своего максимума содержание БТШ70 достигало к 24 часам (уровень в три раза больше, чем у интактных животных) и оставалось высоким до 72 часов эксперимента.
При этом в контрольной группе во все сроки эксперимента наблюдалось достоверное снижение активности ЛДГ-1 и КК в клетках сердца в сравнении с интактными животными.
2. Содержание БТШ70 в суммарном белке из миокарда лабораторных крыс в течение периода 8 часов - 3 суток после введения
адреналина (медиана, квартили)
Срок наблюдения Контрольная группа (КГА)
Интактные животные 1,00 (0,98-1,02)
8 часов 1,86(1,81-1,93) 0
16 часов 2,37 (2,36-2,50) 0 "
1 сутки 3,19(3,14-3,36) 0 " □
3 суток 3,17 (3,07-3,30) 0 " □
Примечание: 0 - р<0,05 достоверность различий по сравнению с группой интактных животных (достоверность определялась по критерию Манна-Уитни); ш -р<0,05 - в сравнении со сроком «8 часов», п - р<0,05 - в сравнении со сроком «16 часов» в исследуемой группе (по критерию Крускала-Уоллиса).
В миокарде животных, которым вводился адреналин, четко прослеживались все стадии воспаления, включающие сосудисто-экссудативные, клеточные и пролиферативные компоненты. По мере нарастания воспалительной реакции происходило увеличение сосудистого индекса, развитие выраженной лейкоцитарной инфильтрации и отека миокардиальных волокон. Площадь сформированных некрозов контрактурного и цитолизного типа к третьим суткам составила 2115,59 (2054,34-2205,18) мкм2.
У животных при повреждении сердца в условиях заблокированного синтеза белка (4 группа) содержание БТШ70, активность ферментов ЛДГ-1 и КК, а также коэффициент отношения пируват/лактат во все сроки исследования были гораздо ниже, чем в контроле. Морфологические изменения в миокарде животных, которым введение адреналина сочеталось с введением циклогексимида, сопровождались более выраженным отеком миокардиальных волокон к 72 часам от начала эксперимента в сравнении с контролем (р<0.05).
При введении неонатальных клеток сердца были выявлены следующие закономерности изменения содержания БТШ70 в миокарде животных данной экспериментальной группы: восстановление содержания БТШ70 произошло раньше, чем в группе 4 (рис. 1), однако к первым суткам произошло снижение уровня стресс-белков и его последующее восстановление было отмечено к третьим суткам эксперимента.
У е 3,4
3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1.8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6
Медиэнэ Ц; 25%-75%
1 сутки 3 сутки
16 ч 1 сутки 3 сутки
16ч 1 сутки 3 сутки
4 группа
3 группа
Рис. 1. Содержание белков теплового шока трансплантации клеток сердца при адреналиновом
5 группа
миокарде
животных при в условиях
повреждении
подавленного синтеза белка (медиана, квартили). Примечание: к - р<0,05 - в сравнении с 3 группой; * - р<0,05 - в сравнении с группой 4 (по критерию Манна - Уитни); р<0,05 - в сравнении с предыдущим сроком исследования (по критерию Крускала-Уоллиса).
в
В этом случае также выявлялась более высокая активность ферментов ЛДГ1 и КК в миокарде к 16 часам как в сравнении с группой 4, так и с группой 3. В последующие сроки активность ферментов была ниже, чем в контроле, но выше, чем в аналогичной группе без трансплантации.
Важно отметить, что у экспериментальных животных с трансплантацией клеток определялись меньшие площадь повреждения и отек миокардиальных волокон, чем в сравниваемых группах. Наиболее существенно эти эффекты проявлялись через 72 часа от начала эксперимента, в этот срок площадь некроза в миокарде была на 15,4%, а отек миокардиальных волокон на 27,4% ниже, чем в группе без трансплантации (р<0,05).
Обсуждение результатов. Предварительное подавление белкового синтеза в миокарде животных при введении адреналина усугубляло течение патологического процесса. Логично предположить, что большая степень повреждения миокарда связана с тем, что циклогексимид блокировал синтез эндогенных белков теплового шока. Трансплантация суспензий клеток сердца привела к более раннему восстановлению содержания БТШ70, уже к 16 часу эксперимента. Полученные данные подчеркивают регуляторный механизм действия ксенотрансплантации
суспензий неонатальных клеток сердца. В условиях подавленного синтеза белка более раннее восстановление собственного синтеза стресс-белков возможно лишь в случае триггерного влияния на рецепторный и генетический аппараты поврежденных клеток.
Выводы. Таким образом, трансплантация суспензий клеток сердца, несмотря на исходное подавление синтеза белков теплового шока, обеспечила защиту миокарда от повреждения, способствуя более раннему восстановлению содержания БТШ70.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Бабушкина И.В., Курильская Т.Е., Пивоваров Ю.И., Боровский Г.Б. и др. Воздействие модифицированного клеточного трансплантата на течение адреналинового повреждения миокарда //Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2010. -№5(75). - С. 217-221. 2. Евдонин А.Л., Кропачева И.В., Медведева Н.Д. Внеклеточный белок теплового шока 70 кДа запускает множественные сигнальные каскады в клетках А431 // Биологические мембраны. - 2009. - Т. 26, № 4. - С. 298-304. 3. Методы культивирования клеток: Сб. науч. тр. / А.Б. Борисов. Культивирование клеток сердца. - Л.: Наука, 1988. - 313 с. 4. Harada Y., Sato C., Kitajima K. Complex formation of 70-kDa heat shock protein with acidic glycolipids and phospholipids // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2007. - Vol. 353 (3). - P. 655-660.
ДИНАМИКА БИОХИМИЧЕСКИХ И МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ В ПОВРЕЖДЕННОМ МИОКАРДЕ ПРИ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ В УСЛОВИЯХ СИСТЕМНОГО ПОДАВЛЕНИЯ БЕЛКОВОГО СИНТЕЗА
Бабушкина И.В., Ильина О.П.
Резюме
Трансплантация клеток сердца приводит к более ранней индукции синтеза белков теплового шока и значительно уменьшает повреждение миокарда.
BIOCHEMICAL AND MORPHOLOGICAL INDICES DYNAMICS IN THE IJURIED
MYOCARD AT XENOTRANSPLANTATION IN THE CONDITIONS OF SYSTEMIC
SUPRESSION OF PROTEIN SYNTHESIS
Babushkina I.V., Ilina O.P.
Summary
Transplantation of heart cells leads to earlier induction of synthesis of heat shock proteins and significantly reduces myocardial damage.
