CC BY
23
УДК 577.112+577.122:612.646
И.В. Бабушкина Т.Е. Курильская Ю.И. Пивоваров Г.Б. Боровский 2, В.К. Войников 2
ХАРАКТЕР ВЛИЯНИЯ КЛЕТОЧНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ НА ТЕЧЕНИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА В УСЛОВИЯХ ПОДАВЛЕНИЯ БЕЛКОВОГО СИНТЕЗА В ОРГАНИЗМЕ
1 Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН (Иркутск) 2 Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН (Иркутск)
Клеточная трансплантация в условиях предварительного подавления белкового синтеза в организме продолжала оказывать протекторный эффект, который может, быть связан с непосредственным поступлением, белковых компонентов трансплантата.
Ключевые слова: адреналиновое повреждение миокарда, блокада синтеза белка, неонатальные клетки
CHARACTER OF INFLUENCE OF CELL TRANSPLANTATION ON PATHOLOGICAL PROCESS UNDER CONDITION OF SUPPRESSION OF PROTEIN SYNTHESIS IN ORGANISM
I.V. Babushkina T.E. Kurilskaya Yu.I. Pivovarov G.B. Borovskiy 2, V.K. Voinikov 2
1 Scientific Center of Reconstructive and Restorative Surgery SB RAMS, Irkutsk
2 Siberian Institute of Physiology and Biochemistry of Plants SB RAS, Irkutsk
Cell transplantation in the prior suppression of protein synthesis in the body continued, its protective effect, which may be associated, with the direct inflow into the damaged, organ of the protein components of the graft.
Key words: adrenaline myocardial damage, suppression of protein synthesis, neonatal cells
По данным литературы известно, что клеточная органоспецифическая трансплантация ограничивает повреждение органов при стрессе [8, 9, 10]. Однако саногенетические механизмы влияния этого трансплантата исследованы недостаточно.
Предполагается, что одним из таких механизмов является стимуляция регенерации поврежденных тканей реципиента ростовыми факторами эмбриональных и неонатальных органоспецифических клеток [6, 10, 12]. С другой стороны, нами ранее было показано, что трансплантация ксеногенных клеток сердца сопровождалась опережающим приростом внутриклеточных стресс-белков в поврежденном органе [2, 9]. Кроме того, выяснилось, что предварительная температурная модификация клеточного трансплантата, приводящая к повышению уровня стресс-белков, обеспечивала более выраженный терапевтический эффект на поврежденное сердце, чем трансплантат «без модификации» [1].
Вероятно, влияние клеточного трансплантата связано либо с триггерным воздействием его компонентов на рецепторы поврежденного органа, либо с прямой индукцией синтеза белков теплового шока, активирующей внутриклеточные механизмы защиты органа.
В связи с этим, для проверки данной гипотезы, представляется важным оценить характер течения патологического процесса в миокарде при клеточной трансплантации в условиях предварительного подавления белкового синтеза в организме.
МЕТОДИКА
Для исследования были использованы беспородные белые крысы-самцы (л = 101) массой тела
180 — 250 г, возраст животных был не менее 6 месяцев, эксперименты проводились в осенне-зимний период. Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище соответственно нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ» (вет. удостоверение 238 № 0015220 от 25 марта 2009 г., служба ветеринарии Иркутской области). Опыты на животных выполнялись в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных Приказом МЗ СССР № 742 от 13.11.84 г. «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и № 48 от 23.01.85 г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных».
Для решения поставленной задачи животные были разделены на следующие группы:
1 группа — подкожное введение Solutio Adrenalinihydrohloridi 0,1 % pro injectionibus (в дозе 5 мг/кг) [7] и физиологический раствор в объеме
0,5 мл (контрольная группа);
2 группа — подкожное введение адреналина на фоне предварительной блокады синтеза белка;
3 группа — подкожное введение адреналина и суспензии неонатальных клеток сердца в тех же условиях, т. е. на фоне подавленного синтеза белка.
Подавление синтеза белка вызывали путем однократного внутрибрюшинного введения животным циклогексимида в дозе 1,5 мг/кг за 3 часа до начала эксперимента [13].
Животным 3-й группы через 10 минут после инъекции адреналина подкожно в область левого
бедра, вводили неонатальные клеточные суспензии сердца в дозе 2,5 х 106 клеток в 0,5 мл физиологического раствора на кг веса животного.
В качестве трансплантата использовали суспензию клеток сердца новорожденных кроликов (1—2 суток от момента рождения), которую получали по методике А.Б. Борисова [3].
В сердечной ткани экспериментальных животных изучали содержание цитозольных белков теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (включает БТШ72 и БТШ73 — индуцибельную и конститутивную формы БТШ70), активность креатинкиназы (КК) и лактатдегидрогеназы 1 типа (ЛДГ-1), содержание пирувата и лактата. Для контроля морфометрических изменений в сердце рассчитывались: сосудистый индекс (рассчитывали в 30 срезах исходя из средней суммарной площади просвета сосудов — S среза 10000 мкм2); клеточный индекс (рассчитывали в 30 срезах исходя из среднего суммарного количества клеток инфильтрата при той же площади одного среза); площадь поперечного сечения мышечных волокон (мкм2 в 30 полях зрения каждого из 30 срезов) и площадь некроза (мкм2 в 30 полях зрения каждого из 30 срезов).
Содержание БТШ70 определялось с использованием электрофореза по методу Лэммли (Laemmli, 1970), с помощью прибора Mini-PROTEAN II («Bio-Rad», США), согласно инструкции производителя. Для чего суммарный белок переносили на нитроцеллюлозную мембрану (иммуноблоттинг) и в последующем для выявления БТШ70 применяли первичные антитела («Sigma») на консервативную для белков этого семейства последовательность. Для последующей детекции этих антител применяли вторичные антитела (Sigma), конъюгированные с щелочной фосфотазой и окрашивали мембраны в растворе 5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфата/ нитроголубого тетразолиум хлорида.
Содержание белка оценивали на мембране с помощью программы Gel Analysis. При этом рассчитывался коэффициент изменения интенсивности окраски, определяющий во сколько раз интенсивность окраски белкового пятна в опытном варианте больше средней интенсивности окраски пятна у интактных животных. Коэффициент изменения интенсивности окраски измерялся в условных единицах (у. е.).
Для изучения морфометрических показателей использовали стандартные серийные срезы миокарда левого желудочка перпендикулярные продольной оси сердца, с помощью видеосистемы «Quantimet 550IW» фирмы «Leica QWin16» и программного пакета «Leica QWin16».
Активность ферментов КК, ЛДГ-1 оценивали кинетическими экспресс-методами на спектрофотометре Ultrospec-4050 (LKB, Швеция) с помощью готовых наборов реактивов (P.Z. CORMAY (Польша, Германия) и Biocon Diagnostik (Германия)) по методикам, рекомендованным Немецким обществом клинической химии. Содержание пирувата определяли по Умбрайту [10], содержание лактата
определяли с помощью стандартных наборов реактивов «Вюсоп» (Германия).
Все указанные параметры изучались через 16, 24, 72 часа от начала эксперимента.
Для определения значимости различий для независимых переменных использовали непараметрические критерии Манна — Уитни и Круска-ля — Уоллиса. Отличия считались достоверными при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Известно, что сократительная функция миокарда требует постоянного энергообеспечения кардио-миоцитов, которая реализуется в процессе сопряжения системы окислительного фосфорилирования и свободного дыхания, а также гликолиза.
Как показали наши исследования, в миокарде животных с моделируемым адреналиновым повреждением наблюдалось снижение активности лактатдегидрогеназы-1 (ЛДГ-1), креатинкиназы (КК) и соотношения пируват/лактат в сравнении с интактными животными (табл. 1). Это связано с тем, что в сердечной мышце имеет место торможение процессов выработки энергии как окислительным, так и гликолитическим путем [4].
Морфологические отклонения в сердце у животных контрольной группы характеризовались увеличением площади миокардиальных волокон и площади некроза, при этом максимальные величины эти показателей достигались к 72 часам эксперимента (табл. 2). В этот же период наблюдалась максимальная интенсивность выхода клеток белой крови в зону воспаления. Среди клеток инфильтрата преобладали нейтрофилы, но при этом достаточно большую часть составляли мононуклеарные клеточные элементы, а также встречались единичные фибробласты.
На этом фоне (т. е. при введении адреналина) предварительное подавление белкового синтеза с помощью циклогексимида существенно ухудшало течение выше указанного процесса. Об этом свидетельствовали еще более низкий коэффициент отношения пируват/лактат и существенно менее выраженная активность ферментов ЛДГ-1 и КК в миокарде во все сроки исследования, чем в контроле. Кроме того, как и следовало ожидать, ци-клогексимид блокировал синтез белков теплового шока, о чем свидетельствуют данные, приведенные в таблице 3. На всех контрольных точках исследования уровень содержания стресс-белков в 2 группе значимо ниже, чем в контрольной группе.
Кроме того, предварительное подавление синтеза белка приводило к более выраженному повреждающему действию адреналина на миокард, о чем свидетельствовали морфологические изменения в миокарде (табл. 2). Так площадь очагов некроза к 16 часам была значимо выше, а в последующие сроки имелась тенденция к дальнейшему увеличению некротического повреждения, которое к 72 часам сопровождалось существенно выраженным отеком миокардиальных волокон в сравнении с группой 1. Т аким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что в условиях предварительного по-
Таблица 1
Динамика биохимических показателей в миокарде экспериментальных животных при трансплантации суспензий клеток сердца в условиях подавленного синтеза белка (медиана, нижний и верхний квартили (25-75 %))
Сроки исследования Группы экспериментальных животных Исследуемые параметры
Лактатдегидрогеназы-1 (мкмоль/мг белка в мин) Пируват/лактат Креатинкиназы (мкмоль/мг белка в мин)
Интактные животные 5,86 (5,82-5,90) 0,151 (0,149-0,154) 17,16 (17,05-17,25)
16 часов 1 группа 3,19 (3,16-3,22) 0,075 (0,067-0,078) 12,10 (12,08-12,37)
24 часа 4,01 3 (3,76-4,16) 0,085 3 (0,082-0,092) 13,59 3 (13,25-13,78)
72 часа 4,28 3, 4 (4,21-4,57) 0,090 3 (0,086-0,102) 12,88 3 (12,63-13,40)
16 часов 2 группа 3,10 1 (2,90-3,15) 0,086 1 (0,080-0,103) 9,63 1 (9,33-9,72)
24 часа 2,80 1 3 (2,64-2,93) 0,087 (0,080-0,092) 12,97 1 3 (12,81-13,34)
72 часа 2,62 1 3 (2,31-2,71) 0,056 1 3, 4 (0,053-0,057) 9,70 1 4 (9,38-9,88)
16 часов 3 группа 3,35 1 2 (3,24-3,51) 0,112 1 2 (0,098-0,114) 12,55 2 (12,05-12,95)
24 часа 3,14 1 2 (2,86-3,43) 0,063 1 2 3 (0,062-0,067) 11,86 1 2 (11,64-12,53)
72 часа 2,94 1 2 3 (2,77-3,12) 0,064 1 2 3 (0,063-0,069) 10,53 1 2 3 4 (10,22-10,69)
Примечание: 1 группа - адреналиновое повреждение миокарда; 2 группа - адреналиновое повреждение миокарда в условиях подавленного синтеза белка; 3 группа - трансплантация суспензий немодифицированных клеток сердца при повреждении миокарда в условиях подавленного синтеза белка; 1 - p < 0,05 - в сравнении с группой 1; 2 - p < 0,05 - в сравнении с группой 2 (по критерию Манна-Уитни); 3 - p < 0,05 - в сравнении с точкой «16 часов»; 4 - p < 0,05 - в сравнении с точкой «24 часа» (по критерию Крускаля - Уоллиса).
Таблица 2
Морфометрические показатели в миокарде экспериментальных животных при трансплантации суспензий клеток сердца в условиях подавленного синтеза белка (медиана, нижний и верхний квартили (25-75 %))
Исследуемые параметры Группы Сроки исследования
16 часов 24 часа 72 часа
Клеточный индекс (уе.) 1 группа 34,29 (24,33-37,15) 41,67 (32,94-69,28) 88,86 (34,53-99,07)
2 группа 34,97 (28,54-42,78) 59,63 3 (53,15-66,02) 74,04 3 (62,66-81,70)
3 группа 26,96 (19,02-36,46) 43,48 2 (30,61-54,03) 54,15 3 (47,38-62,86)
Площадь кардиомиоцитов (мкм2) 1 группа 338,46 (300,10-381,05) 381,56 (314,20-410,02) 410,20 (326,35-436,17)
2 группа 336,29 (315,69-373,54) 386,74 3 (369,14-401,12) 445,81 1 3 4 (438,16-472,95)
3 группа 302,59 2 (276,49-312,37) 285,73 1 2 (265,57-307,61) 323,48 2 (268,20-336,88)
Площадь некроза (мкм2) 1 группа 61,29 (45,84-64,20) 563,24 3 (493,14-626,35) 2115,59 3, 4 (2054,34-2205,18)
2 группа 85,69 1 (76,74-91,75) 593,65 3 (578,82-617,95) 2164,99 3 4 (2083,02-2245,87)
3 группа 49,18 2 (39,05-58,95) 521,23 к (454,90-597,50) 1831,07 1 2 3 4 (1802,25-1900,06)
Примечание: 1 группа - адреналиновое повреждение миокарда; 2 группа - адреналиновое повреждение миокарда в условиях подавленного синтеза белка; 3 группа - трансплантация суспензий немодифицированных клеток сердца при повреждении миокарда в условиях подавленного синтеза белка; 1 - p < 0,05 - в сравнении с группой 1, 2 - p < 0,05 - в сравнении с группой 2 (по критерию Манна - Уитни); 3 - p < 0,05 - в сравнении с точкой «16 часов»; 4 - p < 0,05 - в сравнении с точкой «24 часа» (по критерию Крускаля - Уоллиса).
давления синтеза белка в клетках сердца, введение адреналина сопровождалось значительным ухудшением патологического процесса в миокарде.
В то же время трансплантация неонатальных клеток сердца животным на фоне предварительного подавления синтеза белка оказывала иной эффект. В этом случае выявлялась более высокая активность ферментов ЛДГ1 и КК в миокарде к 16 часам в сравнении с вышеуказанными группами. В последующие сроки активность ферментов была ниже, чем в контроле, но выше, чем в аналогичной группе без трансплантации. Кроме того, к 16 часам в данной группе наблюдался больший уровень содержания БТШ70 в сравнении с группой 2.
Важно отметить, что у экспериментальных животных с трансплантацией клеток определялись меньшие площадь повреждения и отек миокардиальных волокон, чем в сравниваемых группах (табл. 2). Наиболее существенно эти эффекты проявлялись через 72 часа от начала эксперимента. Таким образом, клеточная трансплантация, несмотря на исходное подавление синтеза белков теплового шока, обеспечивала защиту миокарда от повреждения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В предварительных исследованиях установлено, что у здоровых животных введение цикло-гексимида приводило к снижению уровня БТШ70
Таблица 3
Содержание БТШ70 в миокарде экспериментальных животных при трансплантации суспензий клеток сердца в условиях подавленного синтеза белка (медиана, нижний и верхний квартили (25-75 %))
Группы Сроки исследования
16 часов 24 часа 72 часа
1 группа 2,37 (2,36-2,50) 3,19 (3,14-3,36) 3 3,17 (3,07-3,30) 3
2 группа 0,96 (0,90-0,98)1 0,81 (0,74-0,89)1 3 1,03 (0,93-1,08)1 4
3 группа 1,05 (1,01-1,11)1 2 0,60 (0,56-0,67)1, 2, 3 0,98 (0,92-1,02)1, 4
Примечание: 1 группа - адреналиновое повреждение миокарда; 2 группа - адреналиновое повреждение миокарда в условиях подавленного синтеза белка; 3 группа - трансплантация суспензий немодифицированных клеток сердца при повреждении миокарда в условиях подавленного синтеза белка; 1 - p < 0,05 - в сравнении с группой 1; 2 - p < 0,05 - в сравнении с группой 2 (по критерию Манна - Уитни); 3 - p < 0,05 - в сравнении с точкой «16 часов»; 3 - p < 0,05 - в сравнении с точкой «24 часа» (по критерию Крускаля - Уоллиса).
вплоть до 8 часа наблюдения, при этом исходный уровень восстанавливался к 16 часам. В связи с этим мы предполагаем, что ускоренный синтез стресс-белков в сердце и индукция в нем внутриклеточных механизмов защиты были связаны с поступлением в клетки миокарда регуляторных белков, в том числе и белков теплового шока.
Работа была выполнена при поддержке Программы фундаментальных научных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине».
ЛИТЕРАТУРА
1. Бабушкина И.В. и др. Влияние трансплантации ксеногенных неонатальных клеток сердца с измененным содержанием белков теплового шока на степень защиты поврежденного сердца // Фундаментальные науки — медицине : матер. конф. ; Новые материалы и методы исследования : матер. науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2008. — С. 189—190.
2. Бадуев Б.К. и др. Влияние клеточной трансплантации на индукцию белков теплового шока в поврежденном сердце // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2009. — № 3. — С. 149—153.
3. Борисов А.Б. Методы культивирования клеток // Сб. науч. тр. — Л. : Наука, 1988. — 313 с.
4. Богородская С.Л. и др. Трансплантация ксеногенных кардиомиоцитов при экспериментальном адреналиновом повреждении миокарда: ферментативная активность и морфологические параметры // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2008. — № 3. — С. 132—135.
5. Камышников В.С. Справочник по клиникобиохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. — М. : МЕДпресс-информ, 2004. — 501 с.
6. Лепехова С.А. Саногенез печеночной недостаточности под влиянием ксенотрансплантации клеток печени и селезенки : автореф. дис. ... докт. биол. наук. — Иркутск, 2010. — 26 с.
7. Непомнящих Л.М. Патологическая анатомия и ультраструктура сердца. — Новосибирск : Наука, 1981. - 323 с.
8. Репин В.С., Сухих Г.Т. Медицинская клеточная биология. - М. : Российская академия мед. наук : БЭБиМ, 1998. — 200 с.
9. Рунович А.А. и др. Атеросклероз и клеточная терапия. — Иркутск : Дом печати, 2005. — 304 с.
10. Рябчиков О.П. и др. Гормональный и клеточный состав препаратов фетальных тканей человека // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 1998. — Т. 126, Прил. 1. — С. 156 — 157.
11. Сухих Г.Т. Трансплантация фетальных клеток в медицине: настоящее и будущее // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 1998. — Т. 126, Прил. 1. — С. 3—13.
12. Шваб О.В., Трошкин С.В., Демушкин В.П. Хроматографический анализ пептидов фетальных тканей // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 1998. — С. 191 — 195.
13. Farber J.L., Farmar R. Differential effects of cycloheximide on protein and RNA synthesis as a function of dose // Biochemical and biophysical research communications. — 1973. — № 51. — P. 626 — 630.
Сведения об авторах
Бабушкина Инна Викторовна - младший научный сотрудник научного отдела коронарного атеросклероза Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН (664079, г Иркутск, мкр. Юбилейный, д. 100; тел.: 8 (3952) 42-46-59, 8 (924) 639-18-70; e-mail: babushcinai@mail.ru).
Курильская Татьяна Ефимовна - доктор медицинских наук, заведующая научным отделом коронарного атеросклероза Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН (664079, г. Иркутск, мкр. Юбилейный, 100: тел.: 8 (3952) 46-55-56).
Пивоваров Юрий Иванович - доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник НО коронарного атеросклероза Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии Со РАМН (664079, г. Иркутск, мкр. Юбилейный, 100; тел.: 8 (3952) 46-55-56).
Боровский Геннадий Борисович - доктор биологических наук, профессор, заместитель директора по науке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (664033, г. Иркутск, а/я 317, ул. Лермонтова, д. 132; тел.: 8 (3952) 42-59-51).
Войников Виктор Кириллович - доктор биологических наук, профессор, директор Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (664033, г. Иркутск, а/я 317, ул. Лермонтова, д. 132).
