CC BY
22
Экспериментальная онкология
© Л.Р. Валиуллин, И.И. Идиятов, Р.С. Мухаммадиев, В.И. Егоров, В.В. Бирюля, А.А. Набатов, И.С. Рагинов, 2019
УДК 618.146:616-006.03
ВЛИЯНИЕ ЗЕАРАЛЕНОНА И ТРИХОТЕЦЕНА НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ И ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИНИИ КЛЕТОК РАКА ШЕЙКИ МАТКИ (HELA)
Л.Р. Валиуллин1, И.И. Идиятов1, Р.С. Мухаммадиев1, В.И. Егоров1, В.В. Бирюля1, А.А. Набатов2, И.С. Рагинов3-4
1ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань 2ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет МЗ РФ, г. Казань
3Приволжский филиал ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН, г. Казань 4ГАУЗ «Республиканская клиническая больница» МЗ РТ, г. Казань
EFFECT OF ZEARALENONE AND TRICHOTHECENE ON THE VIABILITY AND PROLIFERATIVE ACTIVITY OF CERVICAL CANCER CELL LINES (HELA)
L.R. Valiullin1, I.I. Idiyatov1, R.S. Mukhammadiev1, V.I. Egorov\ V.V. Biryulya1, A.A. Nabatov2, I.S. Raginov3-4
'Federal Center of Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan 2Kazan State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, Kazan 3Volga branch of N.N. Blokhin National Medical Research Centre of Oncology, Kazan 4Republican Clinical Hospital of the Ministry of Healthcare of the Republic of Tatarstan Kazan
Валиуллин Ленар Рашитович — кандидат биологических наук, заведующий сектором тканевых технологий и производства препаратов Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности 420074, г. Казань, Научный городок, 2, тел. +7-950-969-84-69, e-mail: [email protected]
Valiullin Lenar Rashitovich — PhD (biology), Head of the Sector of Tissue Technologies and Production of Medicines of Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety
2 Nauchnyy Gorodok, Kazan, Russian Federation 420074, tel. +7-950-969-84-69, e-mail: [email protected]
Реферат. В настоящее время онкологические заболевания стали одной из самых серьезных проблем для общественного здравоохранения во всем мире. Онкозаболевания являются основной причиной смерти в развитых странах и второй по значимости в развивающихся странах. В данной работе были изучены цитостатические свойства зеараленона и трихотеце-на при воздействии на линию клеток рака шейки матки (Hela). Было установлено, что зеараленон понижает жизнеспособность клеток рака шейки матки в концентрации 4,1х10-4М на 24,5%, а трихотецен в значительно меньшей концентрации, 4,1х10-8М, снизил жизнеспособность данных клеток на 42,0% в сравнении с контролем. На основании полученных результатов открывается возможность продолжения исследований в области разработок препаратов направленного действия против рака шейки матки, которые должны обладать не только высоким цитотоксическим действием, но и повышенными проникающими и биорезорбируемыми параметрами, что означает меньшее отрицательное воздействие на организм человека.
Ключевые слова: раковые клетки линии Hela, зеараленон, трихотецен, цитотоксичность, жизнеспособность, пролифера-тивная активность.
Abstract. Currently, oncological diseases are among the most serious public health problems in the world. Oncological diseases are the main cause of death in developed countries and the second leading cause in developing countries. This work is devoted to
the study of the cytostatic properties of Zearalenone and Trichothecene when exposed to cervical cancer cell lines (HeLa). It was found that Zearalenone reduced the viability of cervical cancer cells at concentration of 4,1x10-4M by 24.5%, and Trichothecene at significantly lower concentration of 4,1x10-8M reduced the viability of these cells by 42.0% as compared to the control. Based on the results, it is possible to continue research in the field of development of drugs directed against cervical cancer, which should have not only high cytotoxic effect but also increased penetrating and bioresorbable parameters, which means less negative impact on the human body.
Key words: HeLa cancer cells, Zearalenone, Trichothecene, cytotoxicity, viability, proliferative activity.
Введение
Онкологические патологии на данный момент являются одними из самых распространенных заболеваний человека. Рак шейки матки (РШМ) входит в десятку самых распространенных онкологических заболеваний и занимает 5-е место. Ежегодно в мире регистрируют 528 тыс. больных РШМ и 266 тыс. умерших от этого заболевания. РШМ занимает 2-е ранговое место в структуре онкогинекологической патологии и 5-е ранговое место в структуре всех опухолей у женщин [1]. Заболеваемость и смертность от данного типа новообразований значительно снизились за последние годы благодаря внедрению современных и точных методов диагностики и массового скрининга женщин [2]. Однако специалисты отмечают негативную тенденцию в отношении возникновения рецидивов, которые при I стадии составляют 8,3%; II — 21,3%; III — 29,1% и при IV стадии — 43,5% [3]. Одним из основных факторов, влияющих на рецидивирование РШМ, является отсутствие эффективных химиотерапевти-ческих препаратов.
Широкими цитотоксическими свойствами обладают метаболиты микроскопических грибов, которые применяются в ветеринарии и медицине. Фармакологический эффект включает в себя противомалярийную, противомикробную, противовирусную и противоопухолевую активность [4, 5]. Зеараленон и производные трихотеценов, такие как ниваленол, самбуцинол, трихотеллон, триходермол, трихотецин В и трихотецинол А обладают цититоксической активностью в отношении широкого спектра различных типов клеточных линий [5-8]. Преимущество зеараленона и трихотецена заключается в их способности проникать через гематоэнцефалический барьер в связи с низкой молекулярной массой и высокой биоразлагающей способностью в организме теплокровных [9-12].
В связи с отсутствием высокоэффективных препаратов для лечения РШМ целью наших ис-
следований было изучение цитостатических свойств зеараленона и трихотецена на клеточную линию рака шейки матки (Hela) в различных концентрациях.
Материал и методы
В работе использовали зеараленон и трихо-теценовое соединение 4ß,15-диацетокси-8a-(3a-метилбутирилокси)-12,13-эпокситрихотецен-3-ол низшего гриба Fusarium sp., полученые в лаборатории Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») [9]. Клеточные линии рака шейки матки (Hela) человека были предоставлены Научно-образовательным центром фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета. Клетки культивировались в среде DMEM в присутствии 10% фе-тальной телячьей сыворотки при 37°С и 5% СО2. Препараты растворялись в смеси ДМСО и 96% спирта в соотношении (1:1).
Для эксперимента было сформировано 11 групп. Клеточная культура первой группы служила контролем, в нее вводили дистиллированную воду в том же объеме, что и в исследуемых группах. В клеточные культуры второй, третьей, четвертой, пятой, шестой, седьмой, восьмой, девятой, десятой и одиннадцатой групп вводили суспензию зеараленона в дозах 1,2х10-4; 1,6х10-4; 1,9х10-4; 2,1х10-4; 2,4х10-4; 2,7х10-4; 3,1х10-4; 3,4х10-4; 3,7х10-4 и 4,1х10-4М соответственно. В культуры клеток трихотецен в дозе 1,2х10-8; 1,6х10-8; 1,9х10-8; 2,1х10-8; 2,4х10-8; 2,7х10-8; 3,1х10-8; 3,4х10-8; 3,7х10-8 и 4,1х10-8М соответственно.
Влияние исследуемых веществ на клетки изучали методом культивирования клеток в присутствии данных соединений. После 24 часов культивирования клеточный слой с помощью инвертированного микроскопа оценивали по следующим параметрам: процент покрытия поверхности, форма клеток, количество клеточных агрегатов, количество плавающих клеток.
120
100
123456789 10 11
■ зеараленон трихотецен
Рис. 1. Влияние соединений зеараленона и трихотецена на жизнеспособность раковой клетки линии Hela
Fig. 1. Effect of Zearalenone and Trichothecene compounds on the viability of a HeLa cancer cell
Подсчет клеток осуществляли в камере Горяева. Количество живых и мертвых клеток оценивали методом окраски трипановым синим (0,1%-ный раствор) [4]. Влияние исследуемых соединений на культурально-морфологические свойства клеток определяли с учетом следующих параметров: коэффициента жизнеспособности — отношения живых клеток к общему их количеству, выраженное в процентах; активность пролиферации — отношения числа выросших клеток к числу засеянных [5]; процента гибели клеток — отношения мертвых клеток, оставшихся после экспозиции с соединением, к общему числу клеток после экспозиции с соединением [13].
Статистическую обработку результатов осуществляли методом вариационной статистики с использованием программы Microsoft Office Excel 2013. Достоверность разницы между сравнимыми величинами оценивали по критерию Стьюдента.
Собственные исследования
Влияние соединений зеараленона и трихотецена на жизнеспособность раковых клеток представлено на рис. 1.
При воздействии вторичного метаболита производного трихотецена на раковую клетку линии Hela жизнеспособность во второй, третьей и четвертой группах уменьшилась незначительно. В пятой, шестой, седьмой, восьмой, девятой, десятой и одиннадцатой группах жизнеспособность клеток уменьшилась на 9,4; 13,3; 16,2; 19,5; 28,1; 31,2 и 42,0% в сравнении с контролем.
Исследование пролиферативной активности при воздействии на клеточную линию Hela соединений зеараленон и трихотецена представлены на рис. 2.
Из рис. 2 видно, что при воздействии зеара-ленона на раковую клетку пролиферативная активность во второй, третьей и четвертой группах уменьшилась незначительно. В пятой, шестой,
Рис. 2. Исследование пролиферативной активности при воздействии на клеточную линию соединений зеараленона и трихотецена
Fig. 2. Study of proliferative activity when exposed to the cell line of compounds of Zearalenone and Trichothecene
седьмой, восьмой, девятой, десятой и одиннадцатой группах пролиферативная активность клеток уменьшилась на 9,1; 13,8; 18,9; 25,0; 30,1; 38,9 и 48,5% в сравнении с контролем. При воздействии метаболита трихотецена на клеточную культуру пролиферативная активность во второй и третьей группах уменьшилась незначительно. В четвертой, пятой, шестой, седьмой, восьмой, девятой, десятой и одиннадцатой группах пролиферативная активность клеток уменьшилась на 10,0; 17,8; 23,7; 32,3; 43,2; 50,1; 61,0 и 71,8% в сравнении с контролем.
Изучение цитотоксических свойств потенциальных противораковых соединений зеараленона и трихотецена при воздействии на культуру клеток линии Hela представлены на рис. 3.
Из рис. 3 видно, что во второй, третьей, четвертой, пятой и шестой группах при воздействии зеараленона не наблюдалось значительных изменений в цитотоксичности. В седьмой группе в концентрации микроорганизмов в 2,7х10-4М
наблюдалось понижение цитотоксического индекса на 12,0%, в восьмой группе — понижение индекса цитотоксичности клеток на 16,7% относительно контроля. В девятой и десятой группах при концентрации микроорганизмов с 3,4х10-4, 3,7х10-4М снижение данного показателя относительно контроля составило 23,0 и 29,2% соответственно. В одиннадцатой группе снижение цитотоксического индекса клеточной линии составило 40,0% по сравнению с контролем.
Из рис. 3 видно, что во второй, третьей, четвертой и пятой группах при воздействии трихотецена не наблюдалось значительных изменений в цитотоксичности. В шестой группе в концентрации микроорганизмов в 2,7х10-4М наблюдалось понижение цитотоксического индекса на 21,0% соответственно. В седьмой и восьмой группах наблюдалось понижение индекса цитотоксично-сти клеток на 30,0 и 40,2 относительно контроля. В девятой и десятой группах при воздействии трихотецена в дозах 3,4х10-8 и 3,7х10-8М сниже-
0,2---
О Н-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-г
123456789 10 11 —^зеараленон —»—трихотецен
Рис. 3. Fig. 3.
ние данного показателя относительно контроля составило 48,4 и 54,1% соответственно. В одиннадцатой группе снижение цитотоксического индекса клеточной линии составило 63,9% по сравнению с контролем.
Заключение
Исследование цитотоксических свойств вторичных метаболитов микроскопических грибов на линию клеток рака шейки матки (Hela) показало, что метаболиты зераленон и трихотецен в различных дозах вызывали понижение жизнеспособности и пролиферативной активности данных раковых клеток. Трихотецен проявлял значительно более высокие цитотоксические свойства по сравнению с зеараленоном. В связи с представленными данными изучение метаболитов микроскопических грибов зеараленона и трихотеценов открывает возможности их дальнейшего изучения с целью разработки новых перспективных препаратов для лечения онкологических заболеваний различной этиологии.
Литература
1. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2012 году. — М.: Медицинское информационное агентство, 2012. — С. 143.
2. Состояние онкологической помощи населению России в 2016 году / Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Ста-ринского, Г.В. Петровой. — М.: МНИОИ им. П.А. Герцена, 2017. — С. 236.
3. Гуськова Е.А., Неродо Г.А., Гуськова Н.К. и др. Факторы, влияющие на частоту рецидивирования рака шейки матки // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. — 2015. — №10(1). — С. 87-91.
4. Валиуллин Л.Р., Бирюля В.В., Идиятов И.И., Касанова Н.Р., Набатов А.А. Изучение изменений биохимических показателей культур клеток при воздействии Т-2 токсина // Уч. Зап. КГАВМ им. Н.Э. Баумана. — 2018. — Т. 236, №4. — С. 39-43.
5. Тертичная М.В. «Методика» по определению ци-тотоксичности медицинских металлических из-
делий, утвержденная директором ФГНУ ВНИВИ и генеральным директором ГУП ВНИПИМИ (2002).
6. Hussaini A. Mycotoxin and Food Safety in Developing Countries; 2013. 280 p. http://dx.doi. org/10.5772/3414.
7. Leylaie S., Zafari D. Antiproliferative and antimicrobial activities of Secondary metabolites and phylogenetic study of endophytic Trichoderma species from Vinca plants // Frontiers in Microbiology. 2018; 9:1484-1500. doi:10.3389/fmicb.2018.01484.
8. Islam M.T., Mishra S.K., Tripathi S. et. al. Mycotoxin-assisted mitochondrial dysfunction and cytotoxicity: Unexploited tools against proliferative disorders // J IUBMB Life. 2018. doi: 10.1002/iub.1932.
9. Wang Y., Zhang L., Li G.-T., Li Z.-H., Dong Z.-J., Li Y. Identification and cytotoxic activities of two new trichothecenes and a new cuparane-type sesquiterpenoid from the cultures of the mushroom Engleromyces goetzii // J Nat Prod Bioprospec. — 2015;5:47-53. doi:10.1007/s13659-014-0051-1.
10. Jia W., Shi L., Zhang F. et. al. Multiplexing data independent untargeted workflows for mycotoxins screening on a quadrupole-Orbitrap high resolution mass spectrometry platform // Food Chem. — 2019. doi: 10.1016.
11. Yang S., Zhang H., Sun F. et. al. Metabolic Profile of Zearalenone in Liver Microsomes from Different Species and Its inVivo Metabolism in Rats and Chickens Using Ultra High-Pressure Liquid Chromatography-Quadrupole / Time-of-Flight Mass Spectrometry // J Agric Food Chem. 2017. doi: 10.1021.
12. Yang S., Zhang H., Beier R.C. et. al. Comparative metabolism of Lappaconitine in rat and human liver microsomes and in vivo of rat using ultra highperformance liquid chromatography-quadrupole/ time-of-flight mass spectrometry // J Pharm Biomed Anal. 2015 Jun 10;110:1-11. doi: 10.1016.
13. Nabatov A.A., Raginov I.S. The DC-SIGN-CD56 interaction inhibits the anti-dendritic cell cytotoxicity of CD56 expressing cells // J Infectious Agents and Cancer. 2015. doi: 10.1186.
