Исследование влияния цисплатина на уровень пероксида водорода и рН в клетках линии HeLa Kyoto с использованием генетически-кодируемых сенсоров Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ НА УРОВЕНЬ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА'

В КЛЕТКАХ ЛИНИИ HELA KYOTO С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ-КОДИРУЕМЫХ СЕНСОРОВ

УДК 517.21:575:618.146-006.6 Поступила 13.10.2013 г.

А.С. Белова, аспирант кафедры биофизики1;

Н.М. Мишина, к.б.н., младший научный сотрудник лаборатории молекулярных технологий2; научный сотрудниклаборатории флюоресцентного биоимиджинга НИИ биомедицинскихтехнологий3;

А.Г. Орлова, к.б.н., научный сотрудник лаборатории биофотоники4;

ЕА Сергеева, к.ф.-м.н., старший научный сотрудник лаборатории биофотоники4;

A. В. Масленникова, д.м.н., профессор кафедры онкологии3;

АА Брилкина, к.б.н., доцент кафедры биохимии и физиологии растений1;

Н.М.Шахова,д.м.н., ведущий научный сотрудниклаборатории биофотоники4;

B. В. Белоусов, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярных технологий2; старший научный сотрудниклаборатории флюоресцентного биоимиджинга НИИ биомедицинских технологий3; САЛукьянов, д.б.н., академик РАН, проректор по науке5; зав. лабораторией флюоресцентного биоимиджинга НИИ биомедицинских технологий3

'Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского — Национальный исследовательский университет, Н. Новгород, 603950, проспект Гагарина, 23;

Институт биоорганической химии РАН им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Москва, 117997, ул. Миклухо-Маклая, 16/10;

Нижегородская государственная медицинская академия, Н. Новгород, 603000, пл. Минина и Пожарского, 10/1; Институт прикладной физики РАН, Н. Новгород, 603950, ул. Ульянова, 46;

Российский национальный исследовательский медицинский университет им Н.И. Пирогова, Москва, 117997, ул. Островитянова, д. 1

Цель исследования — изучение динамики уровня пероксида водорода и уровня pH в цитоплазме клеток карциномы шейки матки HeLa Kyoto при воздействии цитотоксического препарата с использованием генетически-кодируемых сенсоров пероксида водорода и pH.

Материалы и методы. В работе использованы две клеточные линии карциномы шейки матки человека HeLa Kyoto, содержащие в цитоплазме генетически-кодируемый сенсор пероксида водорода НуРег2 и сенсор pH HyPer2-C199S. Для оценки токсического действия цисплатина в отношении клеток HeLa Kyoto применяли стандартный МТТ-тест. Изменения уровня pH и пероксида водорода (Н202) определяли методом флюоресцентной микроскопии по изменению соотношения между интенсивностями флюоресценции при возбуждении сенсора на двух длинах волн: 500 и 420 нм (F500/F420). Во время эксперимента клетки содержали в микроинкубаторе при температуре 37,0°С в бескарбонатной бессывороточной среде МЕМ. Раствор цисплатина в конечной концентрации, соответствующей Ю50 (по данным проведенного МТТ-теста), добавляли непосредственно в среду культивирования. В качестве контроля использовали среду МЕМ без добавления цисплатина.

Результаты. Добавление цисплатина не вызывало изменений уровня пероксида водорода и pH в цитоплазме клеток линии HeLa Kyoto, экспрессирующих соответствующие сенсоры, в течение всего времени наблюдения (20 мин).

Заключение. Использование генетически-кодируемых сенсоров позволяет продемонстрировать, что при воздействии цисплатина изменений уровня пероксида водорода ирНв клетках HeLa Kyoto не происходит.

Ключевые слова: цисплатин; генетически-кодируемый сенсор; пероксид водорода; флюоресцентная микроскопия; линия клеток карциномы Hela Kyoto; МТТ-тест.

Для контактов: Белова Анастасия Сергеевна, тел. +7 906-359-88-85; e-mail: [email protected]

ттттшттшттчшттчшттчшттчшттчшттчшттчшштт

Изучение влияния цисплатина на уровень Н202 ирНс помощью генетически-кодируемых сенсоров СТМ J 2013 — ТОМ 5, №4 19

БИОМЕДИЦИНСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

English

The Study of Cisplatin Effect on Hydrogen Peroxide and pH Level in HeLa Kyoto Cell Line Using Genetically Encoded Sensors

A.S. Belova, Postgraduate, the Department of Biophysics1;

N.M. Mishina, PhD, Junior Research Worker, the Laboratory of Molecular Technologies2; Research Worker,

Fluorescence Bioimaging Laboratory, Scientific Research Institute of Biomedical Technologies3;

A.G. Orlova, PhD, Research Worker, the Laboratory of Biophotonics4;

EA Sergeeva, PhD, Senior Research Worker, the Laboratory of Biophotonics4;

A.V. Maslennikova, D.Med.Sc., Professor, the Department of Oncology3;

AA Brilkina, PhD, Associated Professor, the Department of Plant Biochemistry and Physiology1;

N.M. Shakhova, D.Med.Sc., Leading Research Worker, the Laboratory of Biophotonics4;

V.V. Belousov, PhD, Senior Research Worker, the Laboratory of Molecular Technologies2; Senior Research Worker,

Fluorescence Bioimaging Laboratory, Scientific Research Institute of Biomedical Technologies3;

SA Lukyanov, D.Bio.Sc., Academician of Russian Academy of Sciences, Vice-Rector on Scientific Work5;

Head of Fluorescence Bioimaging Laboratory, Scientific Research Institute of Biomedical Technologies3

1Nizhny Novgorod State University named after N.l. Lobachevsky — National Research University,

Gagarin Avenue, 23, Nizhny Novgorod, Russian Federation, 603950;

2Shemyakin and Ovchinnickov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences,

Miklukho-MaklayaSt., 16/10, Moscow, Russian Federation, 117997;

3Nizhny Novgorod State Medical Academy, Minin and Pozharsky Square, 10/1, Nizhny Novgorod,

Russian Federation, 603000;

4lnstitute of Applied Physics of Russian Academy of Sciences, Ul’yanova St., 46, Nizhny Novgorod,

Russian Federation, 603950;

5Pirogov Russian National Research Medical University, Ostrovitianov St., 1, Moscow, Russia Federation, 117997

The aim of the investigation was to study the changes of hydrogen peroxide level and pH level in cytoplasm of cervical cancer cells HeLa Kyoto on cytotoxic exposure using genetically encoded sensors of hydrogen peroxide and pH.

Materials and Methods. In the study we used two cell lines of human cervical cancer HeLa Kyoto containing in cytoplasm a genetically encoded sensor of hydrogen peroxide HyPer2 and a sensor pH HyPer2-C199S. To assess toxic effect of cisplatin on HeLa Kyoto cells we used a standard MTT assay. The changes of pH and hydrogen peroxide (H202) level were determined using fluorescence microscopy by modification in proportion between fluorescence intensities at sensor’s excitation attwo wavelengths: 500 and 420 nm (F500/F420). During the experimentthe cells were kept in incubator at 37.0°C in carbonate-free and serum-free medium MEM. Cisplatin solution at final concentration corresponding to IC50according to MTT assay was added directly in culture medium. MEM with no cisplatin added was used as a control medium.

Results. Addition of cisplatin resulted in no changes in hydrogen peroxide and pH level in cytoplasm of HeLa Kyoto cells expressing corresponding sensors during the whole period of observation (20 min).

Conclusion. The use of genetically encoded sensors enables to demonstrate cisplatin to have no effect on hydrogen peroxide and pH level in HeLa Kyoto cells.

Key words: cisplatin; genetically encoded sensor; hydrogen peroxide; fluorescence microscopy; carcinoma Hela Kyoto cell line; MTT assay.

Химиотерапия (цитотоксическое воздействие на опухоль) является одним из основных методов лечения злокачественных новообразований. Понимание молекулярных механизмов, вызывающих клеточную гибель при воздействии различных противоопухолевых препаратов, является исключительно важным для разработки патогенетически обоснованных методов лечения.

Цитотоксическое воздействие, по крайней мере частично, основано на повышенной чувствительности опухолевых клеток к окислительному стрессу [1], а активные формы кислорода (АФК) играют важнейшую роль в реализации эффекта противоопухолевых препаратов [1-3]. С этой точки зрения особенно актуальны исследования, посвященные изучению природы окислительного стресса, особенностям его развития в

злокачественных новообразованиях, а также возможностям воздействия на оксидантный статус опухоли с целью повышения эффективности терапии.

До настоящего времени не до конца изученными остаются вопросы участия некоторых конкретных форм АФК (сайт генерации, основные мишени, пути утилизации) в развитии ответа злокачественных новообразований на различные виды противоопухолевых воздействий. Особый интерес для понимания механизмов реализации противоопухолевых эффектов лекарственных препаратов представляет пероксид водорода (Н202), который является сигнальной молекулой, регулирующей пролиферацию и миграцию как нормальных, так и раковых клеток [4]. Несмотря на понимание важной роли, которую играет Н202 в развитии клеточного повреждения при воздействии токсических агентов,

20 СТМ J 2013 — ТОМ 5, №4 А.С. Белова, Н.М. Мишина, А.Г. Орлова, Е.А. Сергеева, А.В. Масленникова, А.А. Брилкина,...

БИОМЕДИЦИНСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

некоторые вопросы, в частности места образования, накопления и деградации Н202 в клетках, остаются не полностью разъясненными.

В ряде работ в качестве фактора регуляции клеточной гибели наряду с АФК рассматриваются изменения уровня внутриклеточного pH. Участие изменений уровня pH доказано в процессах злокачественной трансформации, роста, инвазии клеток, неоангиогенезе, метастазировании, а также в формировании множественной лекарственной устойчивости [5]. Кроме того, существует мнение, что изменения уровня внутриклеточного pH в механизме активации гибели клетки опосредуют действие АФК [6]. Можно предположить, что под влиянием цитотоксических агентов важную роль в развитии процессов клеточной гибели могут играть изменения как содержания пероксида водорода, так и уровня внутриклеточного pH. Точный ответ на этот вопрос может быть получен при параллельном использовании высокочувствительных и специфичных сенсоров.

Цель исследования — изучение динамики уровня пероксида водорода и уровня pH в цитоплазме клеток карциномы шейки матки HeLa Kyoto при воздействии цитотоксического препарата с использованием генети-чески-кодируемых сенсоров пероксида водорода и pH.

Материалы и методы. В работе использованы две клеточные линии карциномы шейки матки человека HeLa Kyoto, трансфицированные генетически-коди-руемыми цитоплазматическими сенсорами пероксида водорода — НуРег2 и pH — HyPer2-C199S (HeLa Kyoto-HyPer2 и HeLa Kyoto-HyPer2-C199S). HyPer представляет собой химерный белок, состоящий из двух доменов: чувствительного к Н202 (регуляторный домен транскрипционного фактора OxyR из Escherichia coli) и флюоресцентного (так называемый круговой пермутант желтого флюоресцентного белка — cpYFP) [7]. Сенсор НуРег2 был получен путем точечной мутации A406V (замена аланина на валин в положении 406) в структуре белка НуРег, что соответствует замене A233V в OxyR дикого типа [8]. НуРег обладает двумя пиками возбуждения (420 и 500 нм) и одним пиком эмиссии на 516 нм (рис. 1). При возрастании уровня Н202 в клетках происходит пропорциональное уменьшение интенсивности флюоресценции при возбуждении в диапазоне 400-450 нм и увеличение интенсивности при возбуждении в диапазоне 450510 нм, что регистрируется как изменение соответствующего отношения, т.е. Hyper является радиометрическим (ratiometric) сенсором [7]. С использованием сенсора Hyper была получена информация о роли пероксида водорода в различных биологических процессах, в том числе об изменении его внутриклеточной концентрации при воздействии эпидермального фактора роста (EGF) [9].

Сенсор HyPer2-C199S был получен путем точечной мутации C199S в структуре

сенсора НуРег2. Замена цистеина на серин в положении 199 препятствует образованию дисульфидных связей в структуре белка при его окислении. НуРег2-C199S нечувствителен к изменениям содержания Н202. Изменение конформации данного сенсора определяется только колебаниями уровня pH [10].

На первом этапе работы были изучены особенности цитотоксического действия цисплатина в отношении клеточных линий HeLa Kyoto-HyPer2 и HeLa Kyoto-HyPer2-C199S с целью выявления концентраций препарата, вызывающих гибель определенного количества клеток. Исследование проводили с использованием стандартного МТТ-теста, основанного на способности митохондриальных дегидрогеназ в жизнеспособных клетках конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диме-тилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в формазан, который кристаллизуется внутри клетки. Измерение концентрации формазана в растворе после взаимодействия с диметилсульфоксидом (ДМСО) позволяет определить количество жизнеспособных клеток, а в цитотоксических исследованиях оценить специфическую гибель клеток, индуцированную тем или иным агентом [11].

Клетки HeLa Kyoto высевали в 96-луночный планшет в количестве 3000 клеток на 1 лунку и заливали 200 мкл среды «Игла МЕМ» («ПанЭко», Россия), содержащей 2 ммоля глутамина и 10% FBS (HyClone, США), затем помещали в С02-инкубатор на 24 ч (37,0°С, 5% С02). Через сутки производили замену исходной среды на среду «Игла МЕМ» с глутамином и 10% FBS, содержащую цисплатин. Концентрации цисплатина варьировали от 0 до 15 мкг/мл. Через сутки производили смену среды на питательную среду с МТТ в количестве 10% от объема среды по 200 мкл на лунку. Планшет помещали в С02-инкубатор на 4 ч, после чего среду отбирали и в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора ДМСО на 40 мин при постоянном помешивании. Оптическую

Рис. 1. Спектры возбуждения и флюоресценции сенсора НуРег (www. evrogen.com)

ттттштттшттчшттчшттчшттчшттчшттчшттчшттт

Изучение влияния цисплатина на уровень Н202 ирНс помощью генетически-кодируемых сенсоров СТМ J 2013 — ТОМ 5, №4 21

БИОМЕДИЦИНСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

плотность полученного раствора формазана в ДМСО измеряли на планшетном спектрофотометре Synergy MX (BioTek, США) при длине волны 570 нм. За 100% выживаемость принимали интенсивность окраски в лунках с клетками, необработанными цисплатином. График зависимости количества выживших клеток от концентрации цисплатина усреднен по данным четырех экспериментов. Для исследования ответа клеток на воздействие цисплатина была выбрана концентрация препарата, при которой за 24 ч жизнеспособность теряют 50% клеток (1С50).

На втором этапе работы был проведен анализ отклика сенсоров на добавление цисплатина. Использовали флюоресцентный инвертированный микроскоп Leica DMI6000 (Leica Microsystems GmbH, Германия). Флюоресценцию возбуждали при помощи ртутно-галогеновой лампы поочередно в двух каналах с применением фильтров 427/10 нм и 504/12 нм. Регистрацию флюоресценции осуществляли с использованием фильтра 542/27 нм. Флюоресцентные изображения регистрировали каждые 30 с в течение 20 мин. Изменение уровней пероксида водорода и pH определяли по изменению отношения F500/F420 полезных сигналов флюоресценции из цитоплазмы клеток при соответствующих длинах волн возбуждения [12]. График отношения F500/F420 для каждого варианта сенсора усреднен поданным об уровне флюоресценции 5 клеток.

Клетки высевали на чашку Петри со стеклянным дном и содержали в С02-инкубаторе при температуре 37,0°С в атмосфере, содержащей 5% С02. Клетки культивировали в среде ДМЕМ, содержащей 2 ммоля глутамина и 10% FBS. Через сутки чашку Петри помещали на стол микроскопа в микроинкубатор при температуре 37,0°С. Раствор цисплатина в среде добавляли непосредственно в чашку Петри в бескарбонатном бессыво-

роточном растворе MEM (Sigma-Aldrich, США). К1,4мл среды в чашке добавляли 0,1 мл среды, содержащей цисплатин в конечной концентрации, соответствующей 1С50 (по данным проведенного МТТ-теста). В качестве контроля использовали среду МЕМ в том же объеме без цисплатина.

Данные представлены в виде средних и стандартных отклонений среднего. Обработку данных проводили в программе формирования изображений EMBL ImageJ с лицензионным программным обеспечением Excel 5.0.

Результаты. По данным МТТ-теста была построена кривая зависимости жизнеспособности клеток HeLa Kyoto-HyPer2 и HeLa Kyoto-HyPer2-C199S от концентрации цисплатина в среде (рис. 2). Для дальнейшего изучения динамики содержания Н202 в клетках была выбрана концентрация цисплатина 2,937 мкг/мл, вызывающая потерю жизнеспособности 50% клеток.

По данным радиометрического мониторинга флюоресценции НуРег2, добавление цисплатина в указанной концентрации не вызывало изменения отношения F500/F420, что свидетельствует об отсутствии изменений уровня Н202 в цитоплазме клеток линии HeLa Kyoto-HyPer2 по сравнению с контролем (рис. 3). Незначительный рост отношения F500/F420 непосредственно после добавления препарата наблюдали при использовании как среды МЕМ, так и цисплатина.

В клетках линии HeLa Kyoto-HyPer2-C199S не обнаружили каких-либо изменений соотношения интенсивности на двух пиках флюоресценции независимо от добавления среды МЕМ или цисплатина. Это свидетельствует о неизменении уровня внутриклеточного pH при воздействии цитотоксического препарата.

Обсуждение. Роль окислительного стресса в инициации и реализации процесса клеточной гибели, индуцированной цитотоксическими агентами на основе платины, в настоящее время подробно изучается с помощью комплекса методов [1]. В большинстве работ описываются изменения концентрации всего пула АФК, в то время как информация о роли пероксида водорода в ответе клеток на контакт с цисплатином является неполной и противоречивой. В работе [13] авторы продемонстрировали временное повышение уровня продукции пероксида водорода при добавлении цисплатина к клеткам рака простаты. В работе [14] было показано, что пероксид водорода принимает участие в инициации клеточной гибели по механизму некроза, но не по механизму апоптоза.

Существуют данные, что изменения внутриклеточного уровня Н202 и pH связаны между собой и играют важную роль в развитии процессов клеточной гибели. В частности, показано, что сдвиг баланса между

Рис. 2. Влияние концентрации цисплатина на жизнеспособность клеток линий HeLa Kyoto-HyPer2 и HeLa Kyoto-HyPer2-C199S

22 СТМ J 2013 — ТОМ 5, №4 А.С. Белова, Н.М. Мишина, А.Г. Орлова, Е.А. Сергеева, А.В. Масленникова, А.А. Брилкина,...

БИОМЕДИЦИНСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1,4

1,3-

z

Б 1,1 -

о" см ч

1

0,9 -0,8 -0,7

НуРег2

1,4 1,3 -

j 1,2 .................................... ® 1,2

I*

X

5

о 1,1 -см ч

1

0,9 -

0,8

-1-----------1-----------1-----------1

5 10 15 20

Время, мин а

- -А- - — среда МЕМ;

0,7

HyPer2-C199S

І

— цисплатин

—і— 10

15 20

Время, мин

Рис. 3. Уровень Н202 в цитоплазме клеток линии HeLa Kyoto-HyPer2 (а) и pH в цитоплазме клеток линии HeLa Kyoto-HyPer2-C199S (б) после добавления цисплатина (1С50) и среды МЕМ без цисплатина. Стрелкой отмечено время добавления препарата

такими формами АФК, как пероксид водорода и супероксид анион-радикал, в сторону Н202 (повышение концентрации пероксида водорода или снижение концентрации супероксид анион-радикала) приводит к активации компонентов апоптотического пути, опосредованной снижением цитоплазматического pH [6]. Кроме того, установлено, что цисплатин вызывает быстрое (в течение 5-15 мин) снижение pH в пределах 0,1 ед. в клетках рака толстого кишечника [15].

В нашем исследовании с помощью генетически-ко-дируемых сенсоров было продемонстрировано, что контакт с цисплатином в концентрации 1С50 не вызывает повышения уровня пероксида водорода в цитоплазме клеток линии HeLa Kyoto-HyPer2. Полученные результаты соответствуют данным работы [16], авторы которой не обнаружили повышения содержания активных форм кислорода в клетках остеосаркомы SOSN2. Также нами не были зарегистрированы изменения pH цитоплазмы в клеточной культуре HeLa Kyoto-HyPer2-C199S. Это обусловливает необходимость дальнейшего изучения механизмов индуцированной цисплатином гибели клеток линии HeLa Kyoto в зависимости от концентрации препарата.

Заключение. Использование генетически-кодируе-мых сенсоров позволяет продемонстрировать, что при воздействии цисплатина изменений уровня пероксида водорода ирНв клетках HeLa Kyoto не происходит.

Финансирование исследования. Работа поддержана грантами в рамках программы Президиума РАН «Фундаментальные науки медицине», проекта РФФИ 13-04-97165, проекта Министерства образования и науки Российской Федерации №8147, проекта Министерства образования и науки Российской Федерации №8269, проекта Министерства образования и науки Российской Федерации №11.G 34. 31.0017.

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.

Литература

1. Conklin К.А. Chemotherapy-associated oxidative stress: impact on chemotherapeutic effectiveness. Integrative Cancer Therapies 2004; 3(4): 294-300.

2. Manda G., Nechifor M.T., Neagu T.-M. Reactive oxygen species. Cancer and anti-cancer therapies. Current Chemical Biology 2009; 3: 342-366.

3. Florea A.-M., Busselberg D. Cisplatin as an anti-tumor drug: cellular mechanisms of activity, drug resistance and induced side effects. Cancers2011; 3: 1351-1371.

4. Szatrowski T.P., Nathan C.F. Production of large amounts of hydrogen peroxide by human tumor cells. Cancer Res 1991; 51: 794-798.

5. Harguindey S., Orive G., Pedraz J.L., Paradiso A., Reshkin S.J. The role of pH dynamics and the Na+/H+ antiporter in the etiopathogen-esis and treatment of cancer. Two faces of the same coin — one single nature. Biochim BiophysActa2005; 1756(1): 1-24.

6. Pervaiz S., Clement M.V. A permissive apoptotic environment: function of a decrease in intracellular superoxide anion and cytosolic acidification. Biochem Biophys Res Commun 2002; 290(4): 1145-1150.

7. Belousov V.V., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Staroverov D.B., Shakhbazov K.S., Terskikh A.V., Lukyanov S. Genetically-encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods 2006; 3(4): 281-286.

8. Марквичева K.H. Исследование сигнальных функций пероксида водорода в процессе фагоцитоза. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М; 2010.

9. Mishina N.M., Tyurin-Kuzmin Р.А., Markvicheva K.N., et al. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally? Antioxid Redox Signal 2011 Jan1; 14(1): 1-7.

10. Poburko D., Santo-Domingo J., Demaurex N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. The Journal of Biological Chemistry 2011; 286(13): 1167211684.

11. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983; 65(1-2): 55-63.

12. Mishina N.M., Markvicheva K.N., Bilan D.S., Matlashov M.E., Shirmanova M.V., Liebl D., Schultz C., Lukyanov S., Belousov V.V. Visualization of intracellular hydrogen peroxide with HyPer, a genetically-encoded fluorescent probe. Methods Enzymol 2013; 526: 45-59.

13. Tomohiro I., Riyako T., Keitaro K., Keita N., Takashi D.,

шшшшшшшшттштшттштшшштшшшшшшшштшшшшмА

Изучение влияния цисплатина на уровень Н202 ирНс помощью генетически-кодируемых сенсоров СТМ J 2013 — ТОМ 5, №4 23

БИОМЕДИЦИНСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Masashil A., Yasuyuki Т., Masafumi I., Yoshinori N. Cisplatin induces production of reactive oxygen species via NADPH oxidase activation in human prostate cancer cells. Free Radical Research 2011; 45(9): 1033-1039.

14. Baek S.M., Kwon C.H., Kim J.H., Woo J.S., Jung J.S., Kim Y.K. Differential roles of hydrogen peroxide and hydroxyl radical in cisplatin-induced cell death in renal proximal tubular epithelial cells. J Lab Clin Med 2003; 142(3): 178-186.

15. Rebillard A., Tekpli X., Meurette O., Sergent O., LeMoigne-

Muller G., VernhetL., GorriaM., ChevanneM., ChristmannM., Kaina B., Counillon L., Gulbins E., Lagadic-Gossmann D., Dimanche-Boitre M.-T. Cisplatin-induced apoptosis involves membrane fluidification via inhibition of NHE1 in human colon cancer cells. Cancer Res 2007; 15(67): 7865-7874.

16. Katsuda H., Yamashita M., Katsura H., Yu J., Waki Y., Nagata N., Sai Y., Miyamoto K. Protecting cisplatin-induced nephrotoxicity with cimetidine does not affect antitumor activity. Biol Pharm Bull 2010; 33(11): 1867-1871.