CC BY
24
quencing the ITS l and ITS2 regions using an automated capillary electrophoresis system; Medical Mycology, 41, 369-381 (2003)
12. Prashant Kumar Lathar, Arti Sharma and Isha Thakur; Isolation and random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis of wild yeast species from 17 different fruits; Journal of Yeast and Fungal Research Vol. 1(8), pp. 146 - 151, (2010)
13. Gunn, S.R., et al. Use of DNA sequencing analysis to confirm fungemiadue to Trichosporon der-matis in a pediatric patient. J. Clin. Microbiol.44:1175— 1177. (2006)
14. Rodriguez-Tudela, J.L., et al. Susceptibility patterns and molecularidentification of Trichosporon species. Antimicrob. Agents Chemother. 49:4026-4034.(2005)
ВЛИЯНИЕ ВРЕМЕНИ ИНКУБАЦИИ СТАРТОВОЙ КУЛЬТУРЫ СВЕРХПРОЦУЦЕНТА ЛИЗИНА CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM B -_ты НА ВЫХОД ПРОДУКТА В ТЕХНОЛОГИЧЕСКОМ ЦИКЛЕ_
Роганина Виктория Юрьевна
Бакалавр, «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»,
г. Белгород.
АННОТАЦИЯ
Цель работы - оптимизировать технологию биосинтеза лизина путем подбора параметра времени культивирования стартовой культуры. В эксперименте сокращение периода выращивания стартовой культуры с 18 до 12 часов (на 33,3 %) привело к снижению конечной оптической плотности продуцирующей культуры, и, соответственно, выхода лизина, лишь на 5,8 % в сравнении с исходной технологией. Таким образом, нами продемонстрирована возможность существенной экономии времени при минимальном снижении выхода лизина в ходе рабочего цикла. Полученные результаты должны послужить повышению эффективности использования существующих производственных мощностей.
Ключевые слова: биосинтез лизина, сверхпродуцент, кормовые добавки.
ABSTRACT
The aim of this work was to optimize the technology of lysine biosynthesis by selection of time parameter of starting culture cultivation. In the experiment starting culture cultivation time reduction from 18 h to 12 h (by 33.3 %) led to decrease of the final optical density of producing culture and respectively of lysine production only by 5.8 % compared to basic technology. Thus, possibility to save essential amount of time was demonstrated experimentally, with only minimal lowering of lysine yield during an operation cycle. Results obtained would serve to increase effectiveness of use of existing production facilities.
Keywords: lysine biosynthesis, overproduces fodder additives.
Введение. В последнее время в Российской Федерации идет бурное развитие сельского хозяйства. Вследствие этого необходимо обеспечить животных полноценными кормами. Одним из важных компонентов является лизин. Это незаменимая аминокислота, которая не синтезируется в организме человека и животных, недостаток которой приводит к резкому снижению продуктивности животных, ухудшает качество продукции, нарушает баланс других аминокислот в синтезе белка [4].
Лизин применяют в качестве кормовой добавки. Это связано с низким его содержанием в растительных кормах и высокой потребностью в нем. Использование лизина в качестве кормовой добавки позволяет увеличить привес животных и птицы на 10 - 30 %, повышает надои молока на 12 %, увеличивает яйценоскость кур на 10 % [1].
В настоящее время для производства кормового лизина успешно используется генетически модифицированный штамм-сверхпродуцент Corynebacterium glutamicum B - 11167. Технологический цикл включает ряд этапов культивирования клеток сверхпродуцента, в том числе выращивание стартовой культуры, используемой в качестве ино-кулята при посеве основной продуцирующей культуры, обеспечивающей накопление лизина в куль-туральной жидкости [2]. В настоящем исследовании мы сосредоточились на оптимизации этапа
стартовой культуры, поставив целью подбор оптимального времени её культивирования.
Объект и методика. Данное исследование основывается на подборе оптимального времени культивирования стартовой культуры сверхпродуцента лизина С. glutamicum B - 11167 для повышения эффективности производства.
Цель исследования: оптимизировать технологию подготовки инокулята для посева продуцирующей культуры путем сокращения времени выращивания стартовой культуры без существенных потерь в конечном продукте.
В качестве объекта исследования использовали С. glutamicum штамм В - 11167 и технологию подготовки инокулята для биосинтеза лизина.
Культурально-морфологические характеристики С. glutamicum: клетки неподвижные, палочковидной формы с булавовидными вздутиями, по окраске по Грамму являются грамположитель-ными, не спорообразующие. Через 2 - 4 суток роста, на твердой агаризованной среде LB образуют колонии диаметром 2 - 4 мм кремово - желтого цвета, поверхность гладкая, форма выпуклая, край ровный, структура тестообразная, однородная [3].
В ходе эксперимента мы сравнивали три варианта с различными значениями параметра времени выращивания стартовой культуры:
1) Контрольный вариант - выращивание ино-кулята в колбе в течение 18 часов (принятый в заводской технологии).
2) Первый опытный вариант - сокращен период подготовки инокулята на 6 часов роста, или на 33,33 % от контроля.
3) Второй опытный вариант - сокращен период подготовки инокулята на 9 часов, или на 50% к контролю.
Наш выбор продиктован стремлением сократить время подготовки инокулята и основывался на нормальной кривой роста культуры С. glutamicum В - 11167, построенной на основе зависимости оптической плотности от времени культивирования (рис.1.).
14
Л 12 -
С
1 10
н
с
§ в
в
§ 6 и
н с
О 2
Контрольный
вариант -18 роста часов -
Первый опытный вариант -12 часов роста Ч
Второй опытный р/ вариант-9 часов
роста
•--■
4 6 8 10 12 14 16
Время культивирования, час
Рис.1. Кривая роста культуры С. glutamicum В - 11167
20
Полученный посевной материал засевали на ферментационную среду, содержащую биотин и тиамин, предварительно разлитую по колбам Эр-ленмейера (250 мл) в объеме 10 мл, и инокулиро-вали посевным материалом в объеме 1 мл. Культи-
вировали на шейкере в течение 72 часов при температуре 30-32 оС, 250 об/мин. В ходе эксперимента контролировали значение рН, содержание лизина (г/л) и чистоту культуры (посев на стерильность и определение морфологии клеток). Данные по посевному материалу представлены в таблице 1.
Таблица 1 Влияние времени культивирования на некоторые показатели посевного материала
Варианты выращивания инокулята рН Оптическая плотность (OD, относительные единицы)
Контроль (18 часов роста) 5,30 12,9
Первый опытный вариант (12 часов роста) 6,60 4,6
Второй опытный вариант (9 часов роста) 6,76 2,31
Сокращение периода культивирования стартовой культуры на 6 часов сместило значение рН в сторону оптимума, но плотность культуры резко снизилась, что может отрицательно сказаться на росте продуцирующей культуры и выходе продукта.
Для статистической обработки полученных результатов был проведён расчёт стандартных отклонений и значений критерия Стьюдента.
Результаты исследований и их обсуждения. Из таблицы 2 видно, что выход готового продукта (лизина) за 12 часов роста составляет 36,71 г/л, что меньше, чем за 18 часов роста 38,97 г/л в контроле. Тем не менее, мы считаем, что, сокращение на треть времени подготовки инокулята не приводит к существенным потерям в готовом продукте, так как раз-
ница между экспериментом и контролем составляет всего 2,26 г/л или 5,8 %. Это соответствует цели эксперимента, так как полученные результаты говорят о возможности сокращения времени получения инокулята, без существенных потерь в конечном продукте. Значение критерия Стьюдента для разности средних арифметических в контроле (18 часов роста) и первом опытном варианте (12 часов роста) составляет 8,218, таким образом, разница существенна на уровне р <0,001.
Во втором опытном варианте время инкубации стартовой культуры сокращено на 50 %, средний выход готового продукта при этом оказался сокращён до 30,24 г/л, что на 24,34 % меньше, чем в контроле. Такое снижение выхода продукта в одном технологическом цикле является существенным и
недопустимым в производстве, так как оно не может быть компенсировано увеличением количества технологических циклов, проводимых за единицу времени.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о возможности сокращения времени культивирования стартовой культуры на 6 часов (на 33,33 % к контролю) без существенного снижения качества посевного материала и выхода лизина в одном технологическом цикле (таблица 2). Полу-
ченный результат дает возможность интенсификации производства за счёт ускорения цепочки процессов, направленных на получение продуцирующей культуры.
Во втором опытном варианте время культивирования стартовой культуры сокращено на 9 часов (на 50 % к контролю), что следует признать нецелесообразным, так как при этом наблюдаются существенные потери в качестве посевного материала, приводящие к снижению продукции лизина на 24,34 % к контролю.
Таблица 2 Продукция лизина в зависимости от времени культивирования посевного материала (г/л)
№ Контроль (18 часов роста) Первый Опытный вариант (12 часов роста) Второй опытный вариант (9 часов роста) Ошибка разницы Sd Критерий Стьюдента 1факт.
1 2 3
1. 39,05 36,87 32,31
2 38,94 36,78 28,48
3. 39,54 37,32 28,40 Sd(1-2) =0,275 Sd(1-3) = 0,540
4. 37,88 36,91 28,67 1факт.(1-2) =8,218
5. 38,37 36,55 31,55
6. 40,10 36,23 29,87 1факт.(1-3) = 16,17
7. 39,23 37,14 30,34
8. 37,65 35,77 32,20
9. 40,01 36,86 30,31
X2 = 38,97 Х3 = 36,71*** X1 = 30,24***
Примечание: *** - разница существенна на уровне вероятности p <0,001 (tTa6 = 4,78).
Выводы. В результате проведенного исследования нами предложена модификация технологии подготовки инокулята для посева продуцирующей культуры путем сокращения времени выращивания стартовой культуры и проведен анализ влияния этого параметра на накопление лизина в культу-ральной жидкости.
Таким образом, мы определили, что наибольшее накопление лизина в ходе технологического цикла происходит при значении параметра времени выращивания стартовой культуры 18 часов, то есть в контрольном варианте, соответствующем используемой в настоящее время технологии. При этом сравнимый выход наблюдается и в первом опытном варианте, при выращивании стартовой культуры в течение 12 часов. При сокращении времени на 33,33 % выход продукта в одном технологическом цикле сокращается лишь на 2,26 г/л, или 5,8%. В связи с этим, данное значение времени культивирования стартовой культуры представляется нам оптимальным с точки зрения выхода конечного продукта за единицу времени использования производственных мощностей. Предложенная модификация производственного регламента не требует дополни-
тельных затрат расходных материалов, потребляемой энергии и ресурса оборудования в расчёте на один технологический цикл производства лизина.
Список литературы:
1. Жарипов А.И. Пищевая биотехнология: научно-практические решения в АПК / А.И. Жарипов, И.Ф. Горлов, 10.11. Неслепов, II.A. Соколова. -М.: Вестник PACXII, 2003. 384 с.
2. ЛР (лабораторный регламент) - 00479942-12011, 2011, Москва: Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов.
3. Моисейченко, В. Ф. Основы научных исследований в агрономии. - Москва: Колос. 1996. - 297 - 298 с.
4. Современные проблемы науки и образования. - 2012. - № 6 // Процесс биосинтеза лизина штаммом Corynebacterium Glutamicum B - 11167 на основе сред, содержащих гидролизат пшеничного глютена // Сиротин A.A., Глухарева H.A., Оспи-щева Н.В., Бондаренко В.В. и др. - 2012.
5. Шевелуха, В. С. Сельскохозяйственная биотехнология: учеб. пособие для студ. вузов / В. С. Шевелуха, Е. А. Калашникова, Е. С. Воронин. -Москва: Высшая школа, 2008. - 469 с.
