КУЛЬТИВИРОВАНИЕ САПРОФИТНОГО ГРИБА ТРИХОДЕРМА И БИОСИНТЕЗ L-ЛИЗИН-α-ОКСИДАЗЫ Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ САПРОФИТНОГО ГРИБА ТРИХОДЕРМА И БИОСИНТЕЗ L-ЛИЗИН-a-ОКСИДАЗЫ

Ю.А. Шнейдер1, А.С. Хомик2, Л.М. Кишмахова2,

И.П. Смирнова3, А.А. Шевченко3

'Кафедра ботаники, физиологии растений и агробиотехнологии 2Кафедра общей фармакологической и биомедицинской технологии 3Кафедра биохимии Российский университет дружбы народов ул. Миклухо-Маклая, 8/2, Москва, Россия, 117198

Исследован рост гриба рода триходерма и биосинтез фермента Ь-лизин-а-оксидазы в зависимости от поверхностного и глубинного способов культивирования. Установлены факторы, регулирующие активность метаболита триходермы Ь-лизин-а-оксидазы: зависимость биосинтеза фермента от спорообразования гриба, количества инокулята, аэрации, значения исходной кислотности ферментационной среды, количества источников углерода и азота, степени их усвояемости. Показана возможность вторичного использования субстрата для получения фермента в лабораторных условиях.

Ключевые слова: триходерма, метаболит, фермент, культивирование, биосинтез.

Ферменты различных видов грибов привлекают внимание многих исследователей с целью изучения физиологии и биохимии продуцентов, а также возможности использования для практических целей [1—7].

В работе японских исследователей было показано, что гриб Trichoderma viride и-244-2 — продуцент Ь-лизин-а-оксидазы — образует фермент только при поверхностном выращивании [7].

Ранее нами был найден штамм, продуцирующий фермент Ь-лизин-а-оксидазу в условиях глубинного культивирования; данная работа является продолжением этих исследований, поскольку практическая значимость Ь-лизин-а-оксидазы — метаболита триходермы — не вызывает сомнений, а распространенность трихо-дермы в почвенной микрофлоре свидетельствует о заметной экологической роли этого гриба [8; 9].

Целью данных исследований являлось изучение условий культивирования Trichoderma harzianum Rifai и образования его метаболита — Ь-лизин-а-оксида-зы — при глубинном и поверхностном выращивании, а также установление факторов, регулирующих активность Ь-лизин-а-оксидазы: зависимость биосинтеза

фермента от спорообразования триходермы, количества инокулята, аэрации, значения исходной кислотности ферментационной среды, количества источника углерода и азота, степени их усвояемости. В цели исследования входило также изучение возможности вторичного использования субстрата для получения фермента в лабораторных условиях.

Условия эксперимента. Культивирование триходермы в условиях по-верхостного выращивания. Штамм harzianum выращивали на среде сусло-агаре в течение 7 суток в термостате при 28 °С. Полученную культуру со средой (слой толщиной 1—1,5 см) вносили в колбу на 250 мл со средой следующего состава: 7 мл 11,4% №а№03, 10 г пшеничных отрубей, 10 мл Н2О. Культивирование осуществляли в течение 14-ти дней при температуре 28 °С. Затем в колбу добавляли 100 мл Н2О, в течение 2-х часов встряхивали, полученную биомассу отжимали через марлю. Полученный водный экстракт использовали для определения активности Ь-лизин-а-оксидазы.

Определяли активность фермента спектрофотометрическим ортодианизи-диновым микрометодом по количеству образующейся в процессе ферментативной реакции Н2О2 [10]. За единицу активности фермента принимали количество фермента, катализирующего образование 1 нмоль Н2О2 на 1 мл культуральной жидкости за минуту в стандартных условиях.

Вторичное использование исходного субстрата для получения фермента. Штамм ^. harzianum выращивали вышеописанным способом. Полученный водный экстракт использовали (первая экстракция), а к оставшейся биомассе добавляли стерильную воду, доращивали культуру в течение 3—4 сут. в термостате при 28 °С (вторая экстракция), а затем вновь использовали (третья экстракция) для получения фермента в лабораторных условиях.

Глубинное культивирование триходермы. Инокулят для глубинного культивирования триходермы выращивали способом, указанным выше, в термостате при 28 °С в течение 14 суток и использовали для посева на ферментационную среду.

Ферментацию триходермы проводили в колбах на 250 мл на термостатированном встряхивателе типа 357 (ПНР) при 28 °С в течение 5 суток, амплитуда № 6, 120 оборотов в минуту.

Использовали ферментационную среду следующего состава на 100 мл воды: пшеничные отруби — 5 г, №а№03 (или (№Ы4)2804) 0,9 г. Начальный рН среды — 5,5—6,0. Количество инокулята, выросшего на твердой среде с пшеничными отрубями, составляло 0,5—1 г от всего количества.

Определение числа спор в пробах. Подсчет числа спор гриба проводили в камере Горяева. Количество спор в 1 мл водного экстракта определяли по формуле:

X = ах400 _ 103, спор/мл,

где X — искомое количество спор; а — сумма спор, сосчитанных в определенном объеме камеры; б — число малых квадратов.

Повторность опытов 3-кратная.

Определение белка по Лоури. Белок определяли по модифицированному методу Лоури [11]. В качестве стандарта использовали 0,05% раствор кристаллического бычьего альбумина (фирма Яеапа1, Венгрия). Результаты опытов обрабатывали статистическим методом Монцевичюте-Эрингене.

Результаты и обсуждение. На первых этапах работы была исследована корреляция процесса спорообразования и биосинтеза фермента при глубинном культивировании на среде с разной концентрацией (№Ы4)2804 в динамике развития культуры.

Как видно на рис. 1, интенсивность спорообразования на средах с разной концентрацией (№Ы4)2804 неодинакова. Количество спор в единице объема водного экстракта при выращивании культуры на среде с концентрацией (№Ы4)2Б04

0,65 г/100 мл значительно выше, чем при использовании в среде концентрации (№Ы4)2Б04 1,95 г/100 мл.

Биосинтез фермента коррелировал с количеством образовавшихся спор. Уже через пять суток роста культуры отмечалось спорообразование триходермы на среде, где активность фермента была 0,24 Е/мл, в четыре раза выше по сравнению со средой, где активность составляла 0,15 Е/мл. К шестым суткам роста культуры соотношение биосинтеза метаболита и спорообразования составило 3 : 1, а к седьмым суткам роста — 2,3 : 1.

Можно сделать заключение, что количество (№Ы4)2Б04, используемого в качестве источника азота для роста гриба, влияет на процесс спорообразования три-ходермы и биосинтез фермента.

Число спор в 1 ■ 106 мл

___□___ 0,65 г/100 мл —

0,24 Е/мл

А___ 1,95 г/100 мл —

0,15 Е/мл

0 5 6 7

Сутки роста культуры

Рис. 1. Число спор в 1 мл водного экстракта на средах с различными концентрациями (NH4)2SO4

В последующих экспериментах нами изучалось влияние количества спор три-ходермы на образование Ь-лизин-а-оксидазы в условиях глубинного культивирования. Результаты опытов представлены в табл. 1.

Таблица 1

Влияние количества спор триходермы на образование L-лизин-a-оксидазы (5-е сутки роста)

Варианты опытов Конечн. рН Белок, у/мл Активн., ^мл Активн., Е/мг

1 5 мл суспензия спор* 4,6 295 0,2 0,04

2 10 мл суспензия спор 5,0 250 0,8 0,08

3 15 мл суспензия спор 5,2 280 1,0 0,13

*Примечание. В опыте использовалась суспензия спор, полученная путем смыва культуры, выращенной на пшеничных отрубях с одной колбы (8-е сутки роста).

Как видно из табл. 1, при глубинном культивировании триходермы и использовании в качестве посевного материала спор гриба биосинтез Ь-лизин-а-окси-дазы незначителен.

Чрезвычайная сложность разработки технологии выращивания грибов рода триходерма для получения фермента в условиях глубинного культивирования объясняется тем, что виды этого рода в условиях глубинного культивирования способны образовывать хламидоспоры, при этом последовательно происходит редукция числа спор.

В последующих опытах с целью изучения условий максимального образования Ь-лизин-а-оксидазы при глубинном культивировании мы использовали в качестве посевного материала мицелий гриба со средой. Результаты эксперимента представлены в табл. 2.

Таблица 2

Влияние количества мицелия гриба на образование L-лизин-a-оксидазы (5-е сутки роста)

Варианты опытов Конечн. рН Белок, г/мл Активн., Щмл Активн., Е/мг

20 г мицелия гриба + среда 5,7 300 2,0 0,23

40 г мицелия гриба + среда 5,7 350 1,0 0,10

60 г мицелия гриба + среда 5,5 350 1,2 0,12

Мицелиальная форма инокулята повышает активность фермента; она была нами использована для максимального накопления фермента с последующим выделением и очисткой метаболита.

Известно, что биосинтез многих ферментов увеличивается либо снижается в зависимости от аэрации. Из результатов исследования влияния степени аэрации на образование Ь-лизин-а-оксидазы при глубинном культивировании гриба (табл. 3) видно, что повышенное число оборотов в минуту (120 об./мин.) способствует увеличению активности фермента. Максимум образования фермента приходится на 4-е сутки роста культуры.

Таблица 3

Влияние аэрации на образование L-лизин-a-оксидазы Trichoderma Ьаггіапит Йіґаі

Количество оборотов 100 об./мин.

Сутки роста Конечн. рН Белок, у/мл Активн., ^мл Активн., Е/мг

2 6,8 227 2,77 0,43

4 6,1 240 3,97 0,56

6 6,1 263 2,86 0,52

Количество оборотов 120 об./мин.

Сутки роста Конечн. рН Белок, у/мл Активн., ^мл Активн., Е/мг

2 5,4 153 3,23 1,10

4 5,6 205 4,11 1,18

6 6,4 265 3,94 0,73

Если судить по данным литературы, то оптимальное значение рН питательных сред, предназначенных для культивирования мицелиальных грибов, лежит в пределах 5—6. Нами было изучено влияние исходного рН среды на образование фермента (табл. 4).

Таблица 4

Влияние исходного рН среды на образование L-лизин-a-оксидазной активности гриба Trichoderma Ьэтэпит

Сутки роста рН исходн. Белок, у/мл Активн., Е/мг

1 4,5 170 0,25

5,6 230 0,89

7,0 170 0,35

2 4,5 220 0,19

5,6 250 0,31

7,0 210 0,12

Как видно из табл. 4, максимальное образование фермента наблюдается уже на первые сутки роста гриба при рН = 5,6. При этих же условиях наблюдается лучший рост культуры и большее количество белка.

В более кислой среде, при рН = 4,5, гриб образует биомассу в виде отдельных крупных зернистых колоний, однако активность фермента в этих условиях низкая. В среде, имеющей исходный рН = 7,0, активность фермента также достаточно низкая.

Как в природных условиях, так и в лабораторных условиях биосинтез ферментов зависит от степени усвояемости используемого субстрата. Выше нами было показано (рис. 1), что концентрации источника азота (ЫН4)2804 влияют на синтез метаболита.

Известно, что питательные среды в лабораторных испытаниях обычно стерилизуют в автоклаве. Однако нагревание в автоклаве может вызывать разрушение или изменение состава некоторых компонентов питательной среды. Нами изучалось образование фермента в связи с использованием сред, автоклавированных при разных режимах. Результаты представлены на табл. 5.

Таблица 5

Влияние режима автоклавирования на рост гриба Trichoderma harzianum и образование фермента в условиях стационарного выращивания на жидкой среде

Режим автоклавирования Сутки роста рН конечн. Белок, у/мл Активн., Щмл Активн., E/мг

1 атм. 30 мин. 2 6,05 90 1,38 0,23

4 5,60 120 1,50 0,17

6 5,55 120 1,30 0,15

1 атм. 1 час 2 6,20 130 4,60 1,46

4 6,20 146 5,70 1,30

6 6,05 200 4,20 0,73

Как видно из табл. 5, при автоклавировании среды в течение часа при 1 атмосфере рост гриба и активность фермента выше, чем при тридцатиминутном авто-клавировании. Белка со вторых суток роста образуется больше, чем при автокла-вировании среды в течение 1 часа. По-видимому, сложные сахара, полисахариды и другие компоненты, содержащиеся в пшеничных отрубях, частично гидролизуются и становятся более доступными для роста культуры и биосинтеза фермента.

С целью максимального накопления метаболита гриба триходермы в лабораторных условиях для дальнейшего выделения и изучения его нами исследовалась возможность вторичного использования исходного субстрата (пшеничных отрубей) для получения фермента. Эксперименты осуществлялись в стационарных условиях.

В табл. 6 представлены результаты проведенного опыта.

Таблица 6

Вторичное использование исходного субстрата для получения фермента

Последовательность экстракций Белок мг/мл Активность, E/мг Конечный рН

Первая экстракция (7—8-е сутки роста) 4,8 0,6 7,1

Вторая экстракция (3—4-е сутки роста) 3,2 0,4 7,5

Третья экстракция (3—4-е сутки роста) 3,4 0,4 7,9

Через 3—4 суток доращивания гриба триходермы получали экстракт, а культуру еще раз использовали (табл. 6). Скорость роста гриба в условиях поверхностного культивирования при втором и третьем использовании среды несколько снижалась. Это проявлялось в снижении количества белка в смывах. Если после первой экстракции количество белка составило 4,8 мг/мл, то при второй и третьей экстракции — 3,2 мг/мл и 3,4 мг/мл соответственно, при этом наблюдалось подще-лачивание среды. Если конечный рН первой экстракции был 7,1 на 7—8-е сутки роста, то при последующих (второй и третьей) экстракциях — 7,5 и 7,9 соответственно, а в некоторых повторностях опыта рН повышался до 8,1.

Вторую и третью экстракции проводили на 3—4-е сутки роста гриба; это позволило максимально использовать выросшую поверхностным способом культуру для накопления культуральной жидкости в лабораторных условиях.

Выводы:

— спорообразование триходермы при выращивании культуры на среде с концентрацией (ЫН4)2804 0,65 г/100 мл значительно выше, чем в среде концентрацией (ЫН4)2804 1,95 г/100 мл;

— биосинтез фермента Ь-лизин-а-оксидазы коррелирует с количеством образованных культурой спор;

— использование мицелиальной формы гриба триходермы повышает активность фермента по сравнению с использованием спор в качестве инокулята;

— повышенное число оборотов в минуту (120 об./мин.) при глубинном культивировании способствует увеличению активности фермента;

— максимальное образование фермента наблюдается при исходном рН среды 5,6;

— при автоклавировании среды в течение часа при 1 атмосфере рост гриба и активность фермента выше, чем при тридцатиминутном автоклавировании;

— возможно вторичное использование субстрата для получения фермента в лабораторных условиях.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Ait-Lahsen H., Soler A., Rey M., De La Cruz J., Monte E., Llobell A. An antifungal glucanase from the biocontrol fungus Trichoderma harzianum // Appl. Environ. Microbiol. — 2001. — Vol. 67. — P. 5833—5869.

[2] Antal Z., Manczinger L., Kredics L., Kevei F., Nagy E. Complete DNA Sequence and analysis of a mitochondrial plasmid in the mycoparasitic strain Trichoderma harzianum T95 // Plasmid. — 2002. — Vol. 47. — P. 148—152.

[3] Bolar J.P., Norelli J.L., Wong K.W, Hayes C.K., Harman G.E. Expression of endochitinase from Trichoderma harzianum in transgenic apple increases resistance to apple scab and reduced vigor // Phytopathology. — 2000. — Vol. 90. — P. 72—77.

[4] Carsolio С., Benliamou N., Haran S., Cortes С., Gutierrez A., Chet A., Herrera-Estrella A. Role of the Trichoderma harzianum endochitinase gene ech42 in Mycoparasitism // Appl. Environ. Microbiol. — 1999. — Vol. 65. — P. 929—935.

[5] Giese E.C., Covizzi E.G., Fjarsato D., Dekkera R.F.H., Silva M.L.C., Barbosa A.M. Botryos-phaeran, a new substrate for the production of 0-l,3-glucanases by Bolryosphaeria rhodina and Trichoderma harzianum Rifai // Process Biochemistry. — 2005.

[6] Giese E.C., Covizzi E.G. Botryosphaeran, a new substrate for the production of 0-l,3-glucanases by Bolryosphaeria rhodina and Trichoderma harzianum Rifai // Process Biochemistry. — 2005.

[7] Kusakabe C., Kodama K., Kununaka A., Yoshino H., Soda K. Extracellular producion of L-lysi-ne-a-oxidase in wheat bran culture of a strain of Trichoderma viride // Agric. Biol. Chem. — 1979. — 43. — 12. — P. 2531—2533.

[8] Алимова Ф.К. Промышленное применение грибов рода Trichoderma. — Казань: КГУ, 2006.

[9] Смирнова И.П., Шнейдер Ю.А. Гемицеллюлозный субстрат — индуктор биосинтеза L-ли-зин-a-оксидазы триходермой // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия «Агрономия и животноводство». — 2010. — № 1. — С. 20—26.

[10] Смирнова И.П., Сяткин С.П., Березов Т.Т. Спектрофотометрический метод определения L-лизин-a-оксидазы // Вопр. мед. химии. — 1984. — № 1. — С. 133—136.

[11] Lowry O.H., Roserbrogh N.Y., Farr A.L., Randall R.Y. Protein measurement with the Folin phenol reagent // Y. Biol. Chem. — 1954. — Vol. 193. — P. 265—275.

CULTIVATION OF SAPROPHYTIC FUNGUS TRICHODERMA AND BIOSYNTHESIS OF L-LYSINE-a-OXIDASE

Yu.A. Shneyder1, A.S. Homik2, L.M. Kishmahova2,

I.P. Smirnova3, A.A. Shevchenko3

'Department of botany, plant physiology and agrobiotechnology 2Department of general pharmaceutical and biomedical technology 3Department of biochemistry Russian People’s Friendship University

Miklukho-Maklaya str., 8/2, Moscow, Russia, 117198

Studies on the growth of the fungus Trichoderma and biosynthesis of L-lysine-a-oxidase enzyme were carried out with surface and deep methods of cultivation. Factors which control the activity of Trichoderma’s metabolite L-lysine-a-oxidase were determined: relationship between enzyme’s biosynthesis and the fungus sporulation; number of inoculum, aeration; initial pH value of fermentation medium; number of sources of carbon and nitrogen, degree of their assimilation. The possibility of secondary use of substrate for production of enzyme in vitro was indicated.

Key words: Trichoderma, metabolite, enzyme, culturing, biosynthesis.