CC BY
48
e
Биосинтез противоопухолевого фермента L-лизин-а-оксидазы Trichoderma spp.
И. П. СМИРНОВА, С. Б. АЛЕКСЕЕВ, А. А. ШЕВЧЕНКО
Российский университет дружбы народов, Москва
Biosynthesis of L-Lysine-a-Oxidase, an Antitumor Enzyme, by Trichoderma spp.
I. P. SMIRNOVA, S. B. ALEKSEEV, A. A. SHEVCHENKO Russian University of Peaples' Friendship, Moscow
Изучены штаммы триходермы, являющиеся продуцентами фермента Ь-лизип-а-оксидазы, перспективного в химиотерапии злокчественных опухолей. Показано,что наилучший биосинтез фермента происходит на среде с пшеничными отрубями. При разной кислотности реакционной среды у штаммов проявляется разный спектр Ь-амипоксвдазных активностей. Наибольшую активность штаммы проявляли в отношении деструкции Ь-лизина.Продуцент Ь-лизина ЬгемЬасЫгтт ер. индуцирует Ь-лизин-а-оксидазную активность ТгкЫйегта Брр.
Ключевые слова: Trichoderma spp.,6uocmme3, L-лизин-а-оксидаза.
Strains of Trichoderma spp., producing L-lysine-a-oxidase, prospective in chemotherapy of malignant tumors, were studied. The best results of the enzyme biosynthesis were observed on the wheat bran medium. When grown on the media with various pH levels, the strains showed different spectra of the L-aminooxidase activity. The highest activity of the strains was recorded with respect to destruction of L-lysine. The lysine-producing organism Brevibacterium sp. induced L-lysine-a-oxidase activity in Trichoderma spp.
Key words: Trichoderma spp., biosynthesis, L-lysine-a-oxidase.
Оксидаза, вызывающая деструкцию L-лизина, была впервые обнаружена у Trichoderma viride Pers ex S. F. Grey японскими исследователями [1], а несколько позже — у Trichoderma spp. в России, на кафедре биохимии РУДН [2, 3]. Фермент катализирует реакцию окислительного дезаминирования L-лизина по следующей схеме:
нимой аминокислоты Ь-лизина, входящей в состав лизоцима, сыгаороточного альбумина, РНК-азы, инсулина, миоглобина, пепсина и других белков. Было показано, что фермент может быть использован как противоопухолевое средство, как иммуномодулятор, а также он обладает антивирусными и антимикробными свойствами [4—13].
NH,
NHL
а % I йт ■"'•о /■ —пт--,.ч
(СНА+(Х+Н,0 ----------------------------► (CH2)4+NH3+H202 Д-тшеридш-2-
“ “ * кярооксилэт
CH-NH,
соон
L-лтин
£H-NH,
=о соон
N СООН
а-кето-Е- ашгнокапроновая кислота
Значение этого фермента обусловлено тем, что с помощью него происходит деградация незаме-
© Коллектив авторов, 2009
Адрес для корреспонденции: 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6. РУДН
Цель настоящей работы — изучение некоторых факторов биосинтеза фермента Ь-лизин-а-оксидазы, перспективного для химиотерапии.
Материал и методы
В опытах использовали штаммы рода Тпекоёвгта поскольку активные продуценты Ь-лизин-а-оксидазы быши найдены среди
-Q-
e
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 1. Рост и образование Ь-лизин-а-оксидазы различными штаммами рода ТпеИос1егта (8-е сутки роста)
Вид гриба Рост Активность, Е/мл
ТМгШв Рек ех 8.Р.Огеу + 14,2
Т.ка^апыш ШГа1 + 15,6
Т.И^рогыш — 0
Т.котщи Ои(± ВКМР-484 — 0
Т.котщп Ои(± ВКМР-485 + 0
Т.котщи Ои(± ВКМР-1283 + 0
Т.котщи Ои(± ВКМР-2111 — 0
Т.уМв Рек ех 8.Р.Огеу ВКМР-426 + 0
ТММв Рек ех 8.Р.Огеу ВКМР-1117 + 6,8
ТММв Рек ех 8.Р.Огеу ВКМР-2113 + 0
ТЛощйгасЫаШш ШГа1 ВКМР-2025 + 6,0
Т.аыгвоутёв ШГа1 ВКМР-2026 — 0
Т.аыгвоутёв ШГа1 ВКМР-2007 + 12,2
Т.кашаШш (Воп.)8оос. ВКМР-2008 — 0
Т.катапыш ШГа1 ВКМР-2029 — 0
Т.катапыш ШГа1 ВКМР-2110 — 0
Т^выйокошщп ШШ ВКМР-2112 — 0
Tгicкodвгma Бр. ВКМР-2030 — 0
Примечание. «+» - наличие роста; « —» - отсутствие роста или слабый рост.
Таблица 2. Образование Ь-лизин-а- оксидазы штаммом № 2 триходермы при разных способах выращивания
(5-е сутки)
Способ выращивания pH среды Белок, мкг/мл Активность, Е/мл
Глубинный Стационарный Поверхностный 6,2 6,7 6,0 260 232 420 1,2 3,3 4,8
представителей этого рода [1]. Посевным материалом служил вегетативный мицелий грибов, выращенный в течении 8—10 сут при 28°C на среде Чапека. Культивирование проводили глубинным способом с использованием лабораторного встряхивателя № 357 (Poland) и поверхностным способом.
При изучении L-лизин-а-оксидазной активности в качестве фоновой среды служила ранее предложенная среда [1], в состав которой вносились добавки различных источников в эквивалентных количествах по углероду и азоту (0,9 и 1,4 г углерода и азота соответственно на 100 г среды).
Опыты по изучению субстратной специфичности штаммов рода Trichoderma при разных значениях рН реакционной смеси проводились с добавлением ацетатного буфера (рН 5,0) и глицин-HCl буфера рН 8,0.
Активность L-лизин-а-оксидазы в культуральной жидкости Trichoderma рассчитывали по приросту Н2О2, количество которой определяли спектрофотометрическим ортодианизидино-вым микрометодом [2]. Сущность метода заключается во взаимодействии всей образующейся в реакции Н2О2 с О-диани-зидингидрохлоридом с развитием соответствующей окраски. Инкубационная смесь содержала 20 мкг пероксидазы, 250 мкг О-дианизидингидрохлорида и 0,1—0,5 мг белка в 1 мл конечного объёма. После инкубирования в термостате в течение 20 мин при 37°C пробы охлаждали до 0—4°C. Оптическую плотность окрашенных растворов опытной и контрольной (без субстрата) проб измеряли на спектрофотометре СФ-16 при 540 нм, в качестве контрольной пробы (без пероксидазы).
Для построения калибровочной кривой молярность свежеприготовленного раствора Н2О2 определяли перманганатомет-рией. Субстратами служили L и DL-формы аминокислот (Reanal, Венгрия). Применяли 0,05 М фосфатный буфер. В качестве катализатора пероксидазной реакции использовали пе-роксидазу фирмы Reanal, а в качестве донора протонов — О-ди-анизидингидрохлорид (Merck, Германия). За единицу активности принимали количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоль Н2О2 за 1 мин при 37°С.
Удельную активность фермента выражали числом единиц активности на 1 мг белка или 1 мл культуральной жидкости. Белок определяли по методу Лоури [14]. В качестве стандарта использовали 0,05%-ный раствор кристаллического бычьего альбумина (Reanal, Венгрия).
Результаты и обсуждение
Исследован рост на среде Soda [1] и образование L-лизин-а-оксидазы различными штаммами рода Trichoderma (табл. 1). Способность к деструкции L-лизина проявляли штаммы T.viri-de Pers ex S. F. Grey, T.harzianum Rifai, T.viride Pers ex S. F. Grey BKMF-1117, T.longibrachiatum Rifai BKMF-2025, T.aureoviride Rifai BKMF-2007. Как видно из приведённых результатов, не было обнаружено корреляции роста на среде с пшеничными отрубями и биосинтезом фермента. Видимо, это объясняется различной способностью грибов использовать пшеничные отруби в качестве источника углерода.
В дальнейших экспериментах нами проведено сравнительное изучение различных способов выращивания культуры грибов с целью выяснения оптимальных условий для биосинтеза L-ли-зин-а-оксидазы ( табл. 2).
Проведённое исследование показало, что наилучший способ биосинтеза фермента — это поверхностный способ выращивания гриба. При стационарном способе выращивания активность L-лизин-а-оксидазы была несколько ниже.
Є
Таблица 3. Изменения субстратной специфичности штаммов рода ТпсИос1егта при разных значениях рН реакционной смеси (8-е сутки роста)
Штамм № 2
Штамм № 13
pH буфера
Субстрат* Акт. по лизину, Е/мл 5,0 8,0 5,0 8,0
ОЬ-лизин 100% 100% 100% 100%
ОЬ-фенил аланин 8,6% 2,0% 5,6% 6,8%
Ь-гистидин 0 0 7,4% 5,2%
Ь-аргинин 0 13,1% 2,0% 22,0%
ОЬ-метионин 0,7% 0 2,4% 3,7%
Ь-глутамин 0 0 1,5% 0,8%
Примечание. * — штаммы № 2, № 13 не проявляли оксидазной активности в отношении аминокислот: валина, тре-
онина, серина, триптофана , аланина, пролина, цистеина, аспарагина, аспартата, изолеицина, тирозина, глицина,
глутамата, леицина.
Таблица 4. Образование 1 -лизин-а-оксидазы штаммом ТгісИосІегтав зависимости от длительности выращи-
вания на твёрдой питательной среде с пшеничными отрубями
Сутки роста рН экстракта Белок, мкг/мл Активность, Е/мл Активность, Е/мг
5-е 6,0 420 4,8 0,31
6-е 6,3 354 18,0 0,51
7-е 6,4 300 12,8 0,43
8-е 6,5 264 17,3 0,65
12-е 6,7 — 17,1 0,20
Таблица 5. Влияние источников углерода на Ь-лизин-а-оксидазную активность ТмсИоСегта sp. (глубинное культивирование)
Источник углерода
рН-среды
Белок, мг/мл
Активность, Е/мл
сутки роста
сутки роста
сутки роста
0 3 4 5 6 7 0 3 4 5 6 7 0 3 4 5 6 7
Сложный источник углерода*(контроль) 6,0 8,1 8,1 7,9 7,8 5,5 0 0,5 0,6 0,7 0,6 0,9 0 3,9 3,8 3,5 3,4 1,6
Глицерин 6,0 5,8 5,9 5,1 5,2 4,5 0 0,3 0,4 0,4 0,4 0,5 0 2,1 1,5 0 0 0
Лактоза 6,0 5,9 6,0 6,3 6,0 5,5 0 0,2 0,3 0,3 0,3 0,4 0 1,8 1,9 2,5 2,0 0
Этанол 6,0 5,6 6,2 6,0 5,1 5,0 0 0,3 0,4 0,5 0,4 0,4 0 1,5 2,1 0,9 0 0
Примечание. * — пшеничные отруби.
Известно, что скорость любой ферментативной реакции зависит от рН реакционной среды. Поэтому, логичным бышо исследование субстратной специфичности оксидаз Ь-аминокислот штаммов Тпекойггта при разных значениях рН реакционной среды. С этой целью были отобраны два штамма, активные в отношении деструкции Ь-лизина: T.aureoviride ЯНМ и ТМапМпит ЯНМ.
Наибольшая оксидазная активность была в отношении Ь-лизина, однако в количественном и качественном отношении быши существенные различия (табл. 3).
Таким образом, при отборе штамма-проду-цента фермента Ь-лизин-а-оксидазы с наиболее высокой субстратной специфичностью необходимо учитывать рН реакционной среды, так как специфичность в отношении деструкции разных аминокислот проявляется в неодинаковой степени при разном значении рН у разных штаммов.
Далее исследовали изменение активностей оксидаз Ь-аминокислот в зависимости от возраста культуры Trichodehma 8рр. Было отмечено,что с возрастом культуры расширялся спектр деструкции аминокислот, однако, как и в предыщущем
эксперименте, в отношении аминокислоты лизина оксидазная активность всегда быша наибольшей (см. табл. 3).
Для продуцента Ь-лизин-а-оксидазы Т.у^е V 244-2 [1] известно,что максимальное образование фермента на твёрдой питательной среде с пшеничными отрубями наблюдалось на 14-е сутки роста культуры.
Исследование динамики биосинтеза Ь-лизин-а-оксидазы активным продуцентом Trichoderma 8р. (отечественный штамм) показало возможность максимального образование фермента на 8-е сутки роста культуры (табл. 4).
Однако, изучать регуляцию биосинтеза фермента целесообразно, по известным причинам, на искусственной среде. Поэтому в дальнейших исследованиях мы предприняли попытку заменить используемые в качестве источника углерода пшеничные отруби на более простые компоненты (табл. 5).
Как видно из табл. 5, среды с использованием в качестве источника углерода глицерина, лактозы, этанола не являлись оптимальными субстратами для штамма и Ь-лизин-а-оксидазная актив-
Є
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 6. Изучения динамики биосинтеза фермента в зависимости от продолжительности хранения посевного материала
Длительность хранения посевного материала рН-среды Активность Ь-лизин-а-оксидазы, Е/мл
сутки роста сутки роста
0 4 5 6 7 0 4 5 6 7
10 сут (контроль) 120 сут 6.0 8,1 8,0 7,9 5,5 6.0 5,8 5,7 6,6 7,9 0 1,9 1,8 1,8 1,9 0 0 0,2 1,5 2,3
Таблица 7. Влияние биологически активных добавок на ( 4-е сутки роста) Ь-лизин-а-оксидазную активность Trichoderma sp.
Биологически активная добавка* Активность Ь-лизин-а-оксидазы, Е/мл
Контроль (без добавок) в-индолилуксусная кислота 6-Бензиламинопурин Гибберелловая кислота Ь-лизин Ь-лизин, Ь-фенилаланин, Ь-метионин Стерильная культуральная жидкость ВгєуіЬасієгіит Бр. — продуцент Ь-лизина 3.5 4,3 3.6 3,9 4.8 4.9 9,5
Примечание. * — вещества добавлялись в одинаковых количествах, кроме стерильной культуральной жидкости Brevibacterium Бр. — продуцента 1_-лизина.
ность проявлялась в значительно меньших количествах по сравнению с использованием в среде с пшеничных отрубей.
Максимальное образование фермента на среде с трудноусвояемым субстратом глицерином происходило на 3-и, на среде с лактозой — на 5-е, на среде с этанолом — на 4-е сутки роста. Очевидно, что эти среды не могут быть использованы для накопления фермента в достаточном количестве. Максимальное образование фермента происходит на среде с использованием в качестве источника углерода пшеничных отрубей на 3—4-е сутки роста гриба.
Исследование динамики биосинтеза Ь-ли-зин-а-оксидазы в зависимости от сроков хранения посевного материала показало, что даже длительное хранение (120 сут) не снижает активности фермента в ферментационной среде (табл. 6). Однако биосинтез фермента начинается только к шестым суткам роста и превышает активность в контроле. Видимо, это связано с адаптацией и переходом клеток гриба из состояния биологческого покоя к состоянию физиолого-биохимической активности.
В настоящее время часто в процессах получения биологически активных соединений с успехом используют неспецифические и специфические индукторы биосинтеза. Иногда индукторы синтезируют химическим путём, часто в этих целях используют широко распространённые в природе активные вещества. Известно, например, что представители рода Тпекойгта синтезируют в-индолилуксусную кислоту, которая, вероятно, в физиологических концентрациях способна оказать существенное влияние на метаболизм грибов. Учитывая эти обстоятельства,
были проведены исследования, в которых к питательной среде добавляли растворы фитогормонов, аминокислот, а также было проанализировано добавление в ферментационную среду стерильной культуральной жидкости ВгєуіЬасїєгіит Бр. — продуцента Ь-лизина (табл. 7).
Как видно из приведённых результатов, повышение активности Ь-лизин-а-оксидазы отмечалось при добавлении в ферментационную среду в-индолилуксусной кислоты, Ь-лизина, смеси аминокислот Ь-лизина, Ь-фенилаланина, Ь-ме-тионина (субстратная специфичность штамма была проявлена именно к этим аминокислотам), но особенно высокая активность фермента наблюдалась при добавлении в ферментационную среду стерильной культуральной жидкости ВгєуіЬасїєгіит Бр. — продуцента Ь-лизина (почти в три раза).
Можно предположить, что с целью получения максимального биосинтеза фермента Ь-лизин-а-оксидазы при ферментации в промышленных условиях возможно использования стерильной культуральной жидкости ВгєуіЬасїєгіит Бр. — продуцента Ь-лизина.
Выводы
1. Не все исследованные штаммы рода Тгіскойєгта обладает Ь-лизин-а-оксидазной активностью. Из 18 исследованных штаммов Тгіскойєгта способность к образованию Ь-лизин-а-оксидазы обладали 5 штаммов.
2. Наибольший биосинтез Ь-лизин-а-ок-сидазы штаммом № 2 Тгіскойєгта наблюдался при стационарном и поверхностном способе выращивания гриба на среде с пшеничными отрубями.
e
3. Поиск продуцентов оксидаз L-аминокислот среди штаммов рода Trichoderma необходимо проводить как в кислой (pH 5,0), так и щелочной (pH 8,0) pH реакционной среде.
4. Максимальный биосинтез L-лизин-а-оксидазы Trichoderma sp. происходит на восьмые сутки роста культуры на твёрдой питательной среде с пшеничными отрубями, а при
ЛИТЕРАТУРА
1. Kusakabe H, Kodama K.,Kuninaka A. et al. New antitumor enzyme L-lysine-а-oxidase from Trichoderma viride. J Biol Chem 1980; 255: 3: 976-981.
2. Смирнова И. П., Сяткин С. П., Берёзов Т. Т. Спектрофотометрический микрометод определения L-лизин-а-оксидазы. Вопр мед хим 1984; 1: 133-136.
3. Смирнова И. П. Продуценты оксидаз L-аминокислот и возможные области их практического применения. Биотехнология 1991; 3: 3-7.
4. Смирнова И. П., Алексеев С. Б., Подборонов В. М. Изучение влияния гелевой формы L-лизин-а-оксидазы на развитие офтальмогерпеса и герпетических поражений кожи кролика. Антибиотики и химиотер 2003; 48: 11: 11—13.
5. Смирнова И. П., ДиджяпетренеЯ., Алексеев С. Б. и др. Воздействие L-лизин-а-оксидазы на карциному кожи мышей, индуцированную метилхолантреном. Там же; 2001; 46: 4: 13—15.
6. Селищева А. А., Алексеев С. Б., Смирнова И. П., Подборонов В. М. Эффективность антигерпетического действия различных лекарственных форм L-лизин-а-оксидазы. Там же, 2003; 48: 1: 9—12.
глубинном культивировании на 3—4-е сутки роста.
5. Среды, содержащие в качестве источника углерода глицерин, лактозу и этанол, неблагоприятны для образования фермента.
6. Продуцент L-лизина Brevibacterium sp. индуцирует L-лизин-а-оксидазную активность Trichoderma spр.
7. Жукова О. С., Хадуев С. Х., Берёзов Т. Т. Влияние L-лизин-а-окси-дазы из Trichoderma sp. на кинетику цикла культивируемых клеток лимфомы Беркитта. Экспер онкол 1985; 6: 42—44.
9. Хадуев С. Х., Жукова О. С., Добрынин Я. В. и др. Цитостатический эффект L-лизин-а-оксидазы из Trichoderma sp. и из Trichoderma viride. Бюлл экспер биол мед 1987; 4: 458—460.
10. Хадуев С. Х., Глазкова Т. Ю., Веса В. С. и др. Оценка противолей-козной активности L-лизин-а-оксидазы из Trichoderma sp. в химиотерапевтических опытах. Там же; 1980: 10: 476.
11. Уманский В. Ю., Хадуев С. Х., Зааеток С. П. и др. Антиметастати-ческий эффект L-лизин-а-оксидазы. Там же; 1990; 5: 458—459.
12. Смирнова И. П., Алексеев С. Б., Подборонов В. М., Гришин В. М. Влияние L-лизин-a-оксидазы,как ингибитора репродукции ВИЧ на специфичность синтеза клеточных белков. Аллергол иммунол 2005; 6: 3: 36—30.
13. Смирнова И. П., Гусъкова Т. А., Пушкина Т. В., Подборонов В. М. Антибактериальная и антигрибковая активность L-лизин-а-ок-сидазы Trichoderma. Сибирь-Восток 2003; 1: 61: 10—12.
14. Lowry O. H., Rosebrough N. J, Farr A. L., Randall R. J. J Biol Chem 1951; 193: 265.
