CC BY
17© Коллектив авторов, 2022 https://doi.org/10.29296/24999490-2022-03-04
ВЛИЯНИЕ ТРИПЕПТИДОВ НА РАЗВИТИЕ ОРГАНОТИПИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА
Н.И. Чалисова1, 2, Г.А. Рыжак2, Р.С. Умнов2, Н.С. Линькова2, 3
'Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Российская Федерация, '99034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6; 2Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии, Российская Федерация, '97110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, 3; 3Белгородский национальный исследовательский университет, Российская Федерация, 308015, Белгород, ул. Победы, 85
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Чалисова Наталья Иосифовна — ведущий научный сотрудник группы пептидной регуляции старения ФГБУН «Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН». Ведущий научный сотрудник лаборатории онкогеронтологии АНО НИЦ «Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии». Доктор биологических наук, профессор, Тел.: +7 (921) 764-73-50. E-mail: ni-chalisova@mail.ru. ORCID: 0000-0002-2371-0043
Рыжак Галина Анатольевна — заместитель директора АНО НИЦ«Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии» по научной работе и новым технологиям. Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор. Тел. +7(921) 934-88-47. E-mail:galina@gerontology.ru. ORCID: 0000-0003-2536-1438
Умнов Роман Сергеевич—научный сотрудник лаборатории биогеронтологии отдела биогеронтологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии. Кандидат медицинских наук. Тел.: +7(911) 952-13-27. E-mail: t.kmb@mail.ru. ORCID: 0000-0001-8201-2088
Линькова Наталья Сергеевна — заведующая лабораторией молекулярных механизмов старения Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии. Ведущий научный сотрудник лаборатории проблем старения Белгородского государственного национального исследовательского университета. Доктор биологических наук, доцент. Тел.: +7 (921) 311-42-10. E-mail: miayy@yandex.ru. ORCID: 0000-0001-5156-5421
Актуальность. Трипептиды являются физиологическими продуктами фдеградации белков и информационными молекулами. Пептиды AED (Ala-Glu-Asp), EDR (Glu-Asp-Arg), EDG (Glu-Asp-Gly) обладают геропротективными, нейропротективными, репаративными и антиоксидантными свойствами.
Цель работы — оценить влияние пептидов AED, EDR, EDG на развитие органотипической культуры тканей различного генеза у молодых и старых крыс.
Материал и методы. Проводилось органотипическое культивирование тканей мезо- (семенники), экто- (кора головного мозга) и энтодермального (мочевой пузырь) генеза, полученных от молодых (2—3 мес) и старых (16—18мес) крыс линии Вистар.
Результаты. Пептид AED стимулировал рост клеток в тканях мезо- и энтодермального генеза молодых и старых животных. Пептид EDR активировал пролиферацию клеток в тканях экто- и мезодермального генеза молодых и старых крыс. Пептид EDG оказывал стимулирующее влияние на ткань мезодермального генеза молодых крыс.
Заключение. Трипептиды, в зависимости от состава и последовательности входящих в их состав аминокислот, по-разному влияют на ткани мезо-, экто- и энтодермального генеза, полученные от животных разного возраста. Это указывает на возможность таргетного геропротективного действия пептидов AED, EDR, EDG.
Ключевые слова: трипептиды, органотипическая культура тканей, ткани различного генеза, старение
EFFECT OF TRIPEPTIDES ON GROWTH OF ORGANOTYPIC CULTURE OF DIFFERENT GENESIS TISSUES N.I. Chalisova1'2, G.A. Ryzhak2, R.S. Umnov2, N.S. Linkova2 3
Pavlov Institute of Physiology RAS, Makarova emb., 6, Saint Petersburg, 199034, Russian Federation;
2Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, Dynamo pr., 3, Saint Petersburg, 197110, Russian Federation;
3Belgorod National Research University, Pobedy str., 85, Belgorod, 308009, Russian Federation
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Chalisova Natalia Iosifovna —leading researcher of Pavlov Institute of Physiology RAS, Makarova emb. 6, SaintPetersburg, Russian Federation, 199034, senior researcher of the laboratory of Oncogerontology of Biogerontology department of Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology. Doctor of biologic sciences, professor. Tel.: +7(921) 764-73-50. E-mail: ni_chalisova@mail.ru. ORCID: 0000-0002-2371-0043.
Ryzhak Galina Anatol'evna —associate Director of Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology in scientific investigation. Doctor of medical sciences, рrofessor. Tel.: +7 (921) 934-88-47. E-mail: galina@gerontology.ru. ORCID: 0000- 0003-2536-1438
30
2022, т. 20, №3 Молекулярная медицина
Umnov Roman Sergeevich — the scientific researcher of the Laboratory ofBiogerontology of the Department ofBiogerontology, Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology. MD, PhD. Tel.: +7(911) 952-13-27. E-mail: t.kmb@mail.ru. ORCID: 0000-0001-8201-2088
Linkova Natalia Sergeevna — the head of the laboratory of molecular mechanisms of aging of Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology. Senior researcher of the Laboratory "Problem of Aging", Belgorod National Research University. Doctor of biological sciences, docent. Tel.: +7(921) 311-42-10. E-mail: miayy@yandex.ru. ORCID: 0000-0001-5156-5421
Tripeptides are physiological products of protein degradation and informational molecules. AED (Ala-Glu-Asp), EDR (Glu-Asp-Arg), EDG (Glu-Asp-Gly) peptides have geroprotective, neuroprotective, reparative and antioxidant properties.
The aim of the work is to evaluate the effect of the AED, EDR, EDG peptides on the development of organotypic tissue culture of various genesis in young and old rats.
Material and methods. Tissues for organotypic cultivation of mesodermal genesis (testis), ectodermal genesis (cerebral cortex) and entodermalgenesis (bladder) were obtained from young (2—3 months) and old (16—18 months) Wistar rats.
Results. AED peptide stimulated cell growth in meso- and endodermal tissues of young and old animals. EDR peptide activated cell proliferation in ecto- and mesodermal tissues of young and old rats. EDG peptide had a stimulating effect on the mesodermal tissue of young rats.
Conclusion. Tripeptides, depending on the composition and sequence of their amino acids, have different effects on meso-, ecto- and endodermal genesis tissues obtained from animals of different ages. This indicates the possibility of targeted geroprotective action of AED, EDR, EDG peptides.
Key words: tripeptides, organotypic cell tissue, tissues of various genesis, aging
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время актуальными являются вопросы усиления клеточной пролиферации при патологических изменениях в различных тканях организма. К перспективным лекарственным препаратам относятся пептиды, обладающие низкой иммуноген-ной активностью и высокой физиологической активностью [1, 2]. В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии методом хроматогра-фического частотного анализа выявлены наиболее часто встречающиеся кодируемые L-аминокислоты в каждой из различных типов тканей. На основе этих данных синтезирован ряд коротких пептидов из 2—4 аминокислотных остатков [3]. Короткие пептиды способны, регулируя экспрессию генов функциональной активности клеток [4, 5], влиять на пролиферацию и апоптоз в различных тканях организма [6].
Пептиды EDG (Glu-Asp-Gly, Т-34), EDR (Glu-Asp-Arg, Т-33), AED (Ala-Glu-Asp, Т-31), обладают геропротективными, нейропротективными и анти-оксидантными свойствами. Пептид EDG обладает антиоксидантным и репаративным действием в модели индуцированной язвы желудка у крыс линии Sprague-Dawley. Методами ПЦР в режиме реального времени и анализа вестерн-блотт показано, что этот трипептид снижал экспрессию генов и синтез белков супероксиддисмутазы (SOD), циклооксигеназы (SOX-2) и апоптоза (р65). Кроме того, пептид EDG регулировал синтез индуцибельной и конститутивной форм NO-синтазы в указанной экспериментальной модели [7]. Геропротективные свойства пептидов EDR и EDG выражаются в их способности норма-лизовывать гистоархитектонику кожи у женщин пожилого возраста по результатам сканограмм УЗИ [8]. Кроме того, пептид EDR оказывает нейропротектив-ное действие в моделях болезни Альцгеймера in vitro и in vivo [9], описаны его антиоксидантный свойства [10]. Геропротективное действие пептида AED выражается в его способности нормализовывать профиль синтеза сигнальных молекул в фибробластах кожи при их репликативном старении [11].
Цель работы — исследование влияния пептидов АЕБ, ЕБЯ, EDG на развитие органотипической культуры тканей различного генеза у молодых и старых крыс.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Изучено влияние трипептидов AED, EDR, EDG в эксплантатах культивированных тканей мезодер-мального (семенники, п=120), эктодериального (кора головного мозга, п=140) и энтодермального (мочевой пузырь, п=100) генеза. Исследования проводили в соответствии с «Европейской конвенцией по защите животных, используемых для научных целей» на крысах линии Вистар, которых умерщвляли при вдыхании паров эфира. Молодые (2-3-месячные) и старые (16-18-месячные) крысы были получены из биоколлекции лабораторных млекопитающих разной таксономической принадлежности Института физиологии им. И.П. Павлова РАН, поддержанной программой биоресурсных коллекций ФАНО России. Для взятия тканей и их препаровки использовали набор инструментов для микрохирургии глаза. Ткани извлекали в стерильных условиях, разделяли на фрагменты величиной 1 мм3. 20—25 таких фрагментов помещали на дно чашки Петри, покрытое поли-Е-лизином, на расстоянии 3 мм друг от друга. Чтобы эксплантаты прикрепились к подложке, герметично закрытые чашки Петри помещали в С02-инкубатор при температуре 37±0,1°С на 30 мин. Далее чашки Петри с прикрепленными эксплантатами заливали 3 мл питательной среды. Используемая культуральная среда (рН 7.2) содержала 35% раствора Хенкса, 35% среды Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ЕД/мл), гентамицина (100 ЕД/мл). В культуральную среду добавляли исследуемые три-пептиды в эффективной концентрации 0,05 нг/мл. Культивирование эксплантатов тканей осуществляли при 37±0,1°С и 5% СО2 в течение 3 сут в соответствии с ранее разработанной методикой [6, 12].
Для визуализации эксплантатов использовали микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13
Молекулярная медицина 2022, т. 20, №3
31
«Альфа-Телеком», Россия). Количественную оценку роста эксплантатов осуществляли морфометрическим методом с помощью пакета программ PhotoM 1.2. Учитывая неоднородность морфологической картины эксплантатов, с целью унификации конечных показателей использовали относительный критерий — индекс площади (ИП), который рассчитывали, как отношение площади всего эксплантата, включая периферическую зону роста, к площади центральной зоны. За условную единицу площади принимали квадрат окуляр-сетки микроскопа. Сторона квадрата при увеличении 3,5*10 равнялась 150 мкм. Значения ИП выражали в условных единицах, контрольное значение ИП принимали за 100% [6, 12]. Достоверность
Рис. 1. Влияние пептида AED на индекс площади зоны роста эксплантатов тканей различного генеза. Контроль — нулевая линия. * — p<0,05 — по сравнению с контролем
Fig. 1. The effect of AED peptide on the area index of the growth zone of tissue explants of various genesis. Control is the zero line. * — p<0.05 — compared to the control
различий сравниваемых средних значений ИП контрольных и опытных образцов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В типичной картине структурной организации периферической зоны эксплантатов различных тканей выделяется, прежде всего, периферическая зона роста в подкапсульной области, в которой проводился морфометрический анализ ИП эксплантатов. Затем выявляется капсула эксплантата, представленная 1—2 слоями клеток веретеновидной формы. С поверхности капсула покрыта мезотелием — однослойным плоским эпителием. Обращает на себя внимание отсутствие сплошного мезотелиального пласта. Клетки мезотелия часто отходят друг от друга, округляются и, по-видимому, отрываются от базальной мембраны. В результате на месте вступивших в апоптоз и мигрировавших клеток образуются просветы, через которые часть клеток мигрирует за пределы эксплантата. Среди мигрирующих клеток типируются макрофаги, фибробласты и специализированные клетки, соответствующие типу ткани, встречаются фигуры митозов. За счет этого формируется периферическая зона роста эксплантатов, при измерении которой определяется ИП. Через 3 сут, если в эксперименте имела место стимуляция развития зоны роста, ИП экспериментальных эксплантатов увеличивался по сравнению с ИП контрольных эксплантатов.
В культуре ткани семенников крыс все 3 пептида вызывали выраженную стимуляцию зоны роста (рис. 1—3). При действии пептида AED ИП увеличивался на 24% в эксплантатах семенников молодых и на 21% в эксплантатах семенников старых крыс по сравнению с контролем. Пептиды EDR и EDG статистически достоверно стимулировали рост эксплантатов семенни-
Рис. 2. Влияние пептида EDR на индекс площади зоны роста эксплантатов тканей различного генеза. Контроль — нулевая линия. * — p<0,05 — по сравнению с контролем
Fig. 2. The effect of EDR peptide on the area index of the growth zone of tissue expiants of various genesis. Control is the zero line. * — p<0.05 — compared to the control
Рис. 3. Влияние пептида EDG на индекс площади зоны роста эксплантатов тканей различного генеза. Контроль — нулевая линия. * — p<0,05 — по сравнению с контролем
Fig. 3. The effect of EDG peptide on the area index of the growth zone of tissue expiants of various genesis. Control is the zero line. * — p<0.05 — compared to the control
32
2022, т. 20, №3 Молекулярная медицина
ков молодых животных на 20 и 21%. ИП эксплантатов коры головного мозга молодых и старых крыс статистически значимо увеличивался на 26 и 22% только при воздействии пептида EDR. В эксплантатах мочевого пузыря ИП статистически достоверно увеличивался только под действием пептида AED на 24 и 22% соответственно у молодых и старых крыс.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Установлено, что метод органотипического культивирования может быть использован при тестировании ряда различных биологически активных веществ, в том числе пептидов, для выявления их способности влиять на рост тканей различного генеза. Методом органотипического культивирования показано, что три-пептид AED оказывает стимулирующее действие на две ткани — мезодермального (семенники) и энтодер-мального (мочевой пузырь) генеза. Трипептид EDR также стимулирует клеточную регенерацию в двух тканях — мезодермального (семенники) и эктодер-мального (кора головного мозга) генеза. Пептид EDG, несмотря на то, что имеет в своем составе те же 2 аминокислоты, что и пептиды AED и EDR (глутаминовая кислота (Е, Glu) и аспарагиновая кислота D, Asp) проявляет тканеспецифичность и стимулирует клеточную
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Хавинсон В.Х. Лекарственные пептидные 4. препараты: прошлое, настоящее, будущее. Клиническая медицина. 2020; 98 (3): 165-77. https://doi.org/10.30629/0023-2149-2020-98-3-165-177. https://doi. org/10.30629/0023-2149-2020-98-3-165-177 5. [Khavinson V.Kh. Medicinal peptide drugs: past, present, future. Clinical Medicine. 2020; 98 (3): 165-77. https://doi.org/10.30629/0023-2149-2020-98-3-165-177. (In Russian)].
2. Хавинсон В.Х., Попович И.Г, Рыжак Г.А., Сафарова Г.Л., Вершинина Е.А. 6. Лекарственные пептидные препараты в аспекте доказательной медицины. Патогенез. 2021; 19 (1): 19-29. https://doi. org/10.25557/2310-0435.2021.01.19-29. [Khavinson V.Kh., Popvich I.G., Ryzhak G.A., 7. Safarova G.L., Vershinina E.A. Medicinal pep-tide preparations in the aspect of evidence-based medicine. Pathogenesis. 2021; 19 (1): 19-29. https://doi.org/10.25557/2310-0435.2021.01.19-29. (In Russian)].
3. Журкович И.К., Ковров Н.Г, Рыжак 8. Г.А., Миронова Е.С., Хавинсон В.Х. Идентификация коротких пептидов в составе полипептидных комплексов, выделенных из органов животных. Успехи современной биологии. 2020; 140 (2): 140-8. https://doi.org/10.31857/S004213242002012X. [Zhurkovich I.K., Kovrov N.G., Ryzhak G.A., Mironova E.S., Khavinson V.Kh. Identification of short peptides in the composition of polypeptide complexes isolated from animal organs. Biology Bulletin Review. 2020; 140 (2): 140-8. https://doi.org/10.31857/S004213242002012X. (In Russian)].
Для цитирования: Чалисова Н.И., Рыжак Г.А., Умнов Р.С., Линькова Н.С. Влияние трипептидов на развитие органотипической культуры тканей различного генеза. Молекулярная медицина. 2022; 20 (3): 30-33. https://doi.org/10.29296/24999490-2022-03-04
пролиферацию только в одной из тканей, а именно — в ткани мезодермального генеза (семенники). Можно полагать, что наличие различных аминокислот (Ala, Arg, Glu, Gly) определяет тканеспецифическое действие этих коротких пептидов. Это создает базу для разработки лекарственных средств на основе либо одного пептида, либо их комбинаций. Следует отметить, что трипептид AED в двух тканях, а трипептид EDR в одной ткани оказывали стимулирующее влияние и в культуре тканей старых крыс, что подтверждает ранее выявленное геропротективное действие этих пептидов [S, 9, 11]. Таким образом, трипептиды EDG, EDR и AED в зависимости от состава и последовательности входящих в их состав аминокислот по-разному влияют на ткани мезо-, экто- и энтодермального генеза, полученные от животных разного возраста. Полученные данные открывают перспективы разработки тар-
гетного геропротективного действия трипептидов.
* * *
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
9. Khavinson V., Ilina A., Kraskovskaya N., Linkova N., Kolchina N., Mironova E., Erofeev A., Petukhov M. Neuroprotective Effects of Tripeptides—Epigenetic Regulators in Mouse Model of Alzheimer's Disease. Pharmaceuticals. Special Issue Epigenetic Drugs. 2021; 14 (6): 515. https://doi.org/10.3390/ph14060515.
10. Khavinson V., Ribakova Y., Kulebiakin K., Vladychenskaya E., Kozina L., Arutjunyan A., Boldyrev A. Pinealon increases cell viability by suppression of free radical levels and activating proliferative processes. Rejuvenation Res. 2011; 14 (5): 535-41. https://doi. org/10.1089/rej.2011.1172.
11. Fridman N.V., Linkova N.S., Kozhevnikova E.O., Gutop E.O. Khavinson V.Kh. Comparison of the effects of KE and AED peptides on functional activity of human skin fibro-blasts during their replicative aging. Bull. Exp. Biol. Med. 2020; 3: 154-7. https://doi. org/0.47056/1814-3490-2020-3-197-201.
12. Рыжак Г.А., Чалисова Н.И., Ивко О.М., Заломаева Е.С., Иванова П.Н. Протекторное влияние биорегуляторных пептидов на развитие органотипической культуры тканей в присутствии цитостатика. Молекулярная медицина. 2020; 18 (6): 52-6. https://doi.org/10.29296/24999490-2020-06-08. [Ryzhak G.A., CHalisova N.I., Ivko O.M., Zalomaeva E.S., Ivanova P.N. Protective effect of bioregulatory peptides on the development of organotypic tissue culture in the presence of cytostatics. Molekulyar-naya medicina. 2020; 18 (6): 52-6. https:// doi.org/10.29296/24999490-2020-06-08. (In Russian)].
Поступила 2 февраля 2022 г.
For citation: Chalisova N.I., Ryzhak G.A., Umnov R.S., Linkova N.S. Effect of tripeptides on growth of organotypic culture of different genesis tissues. Molekulyarnaya meditsina. 2022; 20 (3): 30-33 (in Russian). https:// doi.org/10.29296/24999490-2022-03-04
Khavinson V.Kh., Popovich I.G., Linkova N.S., Mironova E.S., Ilina A.R. Peptide Regulation of Gene Expression: A Systematic Review. Molecules. 2021; 26: 1-22. https://doi. org/10.3390/molecules26227053. Ashapkin V., Khavinson V., Shilovsky G., Linkova N., Vanuyshin B. Gene expression in human mesenchymal stem cell aging cultures: modulation by short peptides. Molecular Biology Reports. 2020; 47: 4323-9. https://doi.org/10.1007/s11033-020-05506-3. Chalisova N.I. Effect of synthesized dipep-tide L-Leu-Lys on cell proliferation and apoptosis in organotypic tissue culture from rat spleen. Applied Cell Biology. 2015; 4 (2): 27-31.
Khavinson V.Kh., Linkova N.S., Dudkov A.V., Polyakova V.O., Kvetnoi I.M. Peptidergic Regulation of Expression of Genes Encoding Antioxidant and Anti-Inflammatory Proteins. Bull. Exp. Biol. Med. 2012; 152 (5): 615-8. https://doi.org/10.1007/s10517-012-1590-2. Фридман Н.В., Линькова Н.С., Бойко Л.В., Кахели М.А. Влияние пептидных биорегуляторов на структурно-функциональные особенности кожи лица женщин пожилого возраста. Молекулярная медицина. 2021; 4: 42-6. https:// doi.org/10.29296/24999490-2021-04-07. [Fridman N.V., Linkova N.S., Bijko L.V., Kacheli M.A. The effect of peptide bioregulators on the structural and functional features of the facial skin of elderly women. Molecular Medicine. 2021; 4: 42-6. https:// doi.org/10.29296/24999490-2021-04-07 (In Russian)].
Молекулярная медицина 2022, т. 20, №3
33
