CC BY
10© Коллектив авторов, 2021 https://doi.org/10.29296/24999490-2021-05-04
ПРОЛИФЕРОТРОПНОЕ ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ НА ОРГАНОТИПИЧЕСКУЮ КУЛЬТУРУ ТКАНЕЙ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ПТИЦ
Н.И. Чалисова1, 2, Г.А. Рыжак2, О.М. Ивко2
ФГБУН «Институт физиологии им. И.П. Павлова» Российской академии наук, Российская Федерация, 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, д. 6; 2АННО ВО НИЦ «Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии», Российская Федерация, 197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо 3 E-mail: ni chalisova@mail.ru
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Чалисова Наталия Иосифовна — ведущий научный сотрудник Института физиологии им. И.П. Павлова Российской Академии наук, доктор биологических наук, профессор. Тел.: +7(921) 764-73-50. E-mail: ni_chalisova@mail.ru. ORCID: 0000-00022371-0043
Рыжак Галина Анатольевна — заместитель директора Санкт-Петербургского Института биорегуляции и геронтологии. Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии, доктор медицинских наук, профессор. Тел.: +7(921) 934-88- 47. E-mail:galina@gerontology.ru. ORCID: 0000-0001-6690-7391
Ивко Олег Михайлович — старший научный сотрудник Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии, кандидат биологических наук. Тел.: +7(812) 230-00-49. E-mail: secretary@gerontology.ru. 0RCID:0000-0003-0549-093
Введение. Исследование механизмов регулирования многоклеточных систем и сложного равновесного состояния между двумя основными физиологическими процессами, пролиферацией и апоптозом, является актуальной задачей современной молекулярной биологии и медицины.
Цель исследования — сравнительное влияние полипептидов и коротких пептидов на пролиферацию в различных тканях млекопитающих (крысы) и птиц (эмбрионы цыплят).
Метод — органотипическое культивирование нервной ткани, сосудов, хрящей и семенников при действии коротких пептидов (тетра- и трипептидов) и комплексных полипептидов.
Результаты. Установлено пролиферотропное тканеспецифическое влияние коротких пептидов и полипептидов в культуре тканей эмбрионов цыплят и крыс.
Заключение. Создается база для быстрого тестирования лекарственных препаратов на клеточном уровне с использованием органотипической культуры тканей куриных эмбрионов. Параллелизм стимулирующего действия пептидов на ткани млекопитающих и птиц позволяют полагать, что пептидная регуляция жизнедеятельности различных видов животных возможно является одним из древнейших механизмов эволюции живых организмов.
Ключевые слова: короткие пептиды, полипептиды, органотипическая культура ткани, пролиферация
PROLIFERATION EFFECT OF PEPTIDES ON ORGATYPIC TISSUE CULTURE OF MAMMALIAN AND BIRDS
N.I. Chalisova1,2, G.A. Rizhak2, O.M. Ivko2
Pavlov Institute of Physiology RAS, nab. Makarova 6, S-Petersburg, 199034, Russian Federation;
2Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology. Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, pr. Dinamo 3, S-Petersburg, 197110, Russian Federation E-mail: ni_chalisova@mail.ru
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Chalisova Natalia Iosifovna — Expert scientific worker Pavlov Institute of Physiology RAS, Doctor of biologic sciences, Professor. Tel.: +7(921) 764-73-50. E-mail: ni_chalisova@mail.ru. ORCID: 0000-0002-2371-0043
Rizhak Galina Anatolevna — Director Assistance of Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, Doctor of biologic sciences, Professor. Tel.: +7(921) 934-88-47. E-mail:galina@gerontology.ru. ORCID: 0000-0001-6690-7391
Ivko Oleg Mikchailovich — Senior scientific worker of St. Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, Candidate of biologic sciences. Tel.: +7(812) 230-00-49. E-mail:secretary@gerontology.ru. ORCID: 0000-0003-0549-093
Introduction. The study of the mechanisms of multicellular system regulation and of complex balance between two basic physiologic processes, proliferation and apoptosis, is actual task of the modern molecular biology and medicine.
Purpose of the study — the investigation of relative impact of polypeptides and short peptides on the proliferation in the different tissues of mammalian (rats) and birds (chickens).
Молекулярная медицина 2021, т. 19, №5
29
Methods. Organotypic culture of nervous tissue, vessels, cartilages and testis under the effect of short peptides (tetra-and three-peptides) and of complex polypeptides.
Results. The proliferation effect and tissue-specific effect of short peptides and polypeptides was established in tissue culture of rats and chick embryons.
Conclusion. The base is created for the quick testing of medical preparations on the cellular level by using of organotypic culture of chicken tissues. The parallelism of peptide stimulating effect on the tissues both of mammalian and birds can be suggested that the peptide regulation of different animals species possibly is one the most ancient mechanisms of the live organism evolution.
Key words: short peptides, polypeptides, organotypic tissue culture, proliferation
ВВЕДЕНИЕ
К актуальным направлениям медицинских и биологических наук относится изучение механизмов регулирования сложного равновесного состояния между двумя процессами — пролиферацией и апоп-тозом. Эти процессы обеспечивают развитие и жизнедеятельность организмов. Поиск биологически активных веществ, обеспечивающих сбалансированность данных процессов является одной из актуальных задач современной медицины и биологии [1]. В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии разработана технология выделения полипептидных комплексов из тканей различных органов телят. При органотипическом культивировании различных тканей экспериментальных крыс установлено, что полипептиды оказывают тканеспецифиче-ское действие, стимулируя пролиферацию в культуре соответствующей ткани [2]. На молекулярном уровне этот эффект сопровождался повышением экспрессии пролиферотропного протеина PCNA и снижением экспрессии проапоптотических факторов транскрипции р16, р21, p53 [3]. Из полипептидных комплексов были выделены их активные компоненты — короткие пептиды [4]. Например, в составе полипептидного комплекса хрящей был найден пептид Ala-Glu-Asp, в составе полипептидного комплекса коры головного мозга — трипептид Glu-Asp-Arg. Эти короткие пептиды, также как полипептидные комплексы, из которых они были выделены, обладали хондро- и ней-ропротекторными свойствами [5—7]. На основе ряда комплексных и коротких пептидов были созданы лекарственные препараты, широко применяющееся в лечении нарушений функций различных органов [8]. Однако для ускорения процесса тестирования пептидов целесообразно проводить исследования не только в экспериментах на млекопитающих, но и на тех животных, для которых не требуется их дорогостоящее и длительное выращивание в вивариях научно-исследовательских институтов. Такими организмами могут быть эмбрионы цыплят. Ранее было показано, что тетрапептид Ala-Glu-Asp-Gly стимулирующий пролиферацию в органотипической культуре эпифиза крыс, активирует дифференцировку нейронов и клеток пигментного эпителия сетчатки эмбрионов цыплят [9, 10].
Цель работы — сравнительное изучение влияния полипептидов из тканей сосудов, хрящей, семенников и коротких пептидов (Ala-Glu-Asp-Pro, Ala-Glu-Asp, Glu-Asp-Ala, Glu-Asp-Arg, Glu-Asp-Leu, Glu-Asp-
Тгр) на органотипическую культуру различных тканей млекопитающих (крысы) и птиц (эмбрионы цыплят).
МАТЕРИЛ И МЕТОДЫ
Работа проведена на самцах крыс линии Вистар массой 200—250 г из биоколлекции «Коллекция лабораторных млекопитающих разной таксономической принадлежности» Института физиологии им. И.П. Павлова РАН, поддержанной программой биоресурсных коллекций ФАНО России. Исследовались также ткани 17-дневных куриных эмбрионов из ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа им. А. А. Смородинцева». В экспериментах использовано 900 эксплантатов тканей коры головного мозга, сосудов, хряща, семенников крыс и 1100 эксплантатов таких же тканей эмбрионов цыплят.
Ткани извлекали в стерильных условиях, разделяли на фрагменты размером 1 мм3 и затем 12—15 фрагментов помещали на дно чашки Петри, покрытое полилизином, на расстоянии 3 мм друг от друга. Чашки Петри с прикрепленными эксплантатами заливали 3 мл питательной среды. Используемая культуральная среда (рН 7,2) содержала 35% раствора Хенкса, 35% среды Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ЕД/мл), гентамицин (100 ЕД/мл). В куль-туральную среду добавляли исследуемые пептиды в эффективных концентрациях, 0,05 нг/мл для коротких пептидов и 50 нг/мл для полипептидов. Исследованы короткие пептиды А1а-01и-АБр-Рго, Л1а-01и-ЛБр, 01и-ЛБр-Л1а, 01и-АБр-А^, 01и-ЛБр-Ьеи, 01и-ЛБр-Тгр и полипептидные комплексы, выделенные из сосудов, хрящей и семенников телят. Культивирование эксплантатов тканей происходило в термостате при температуре 37±0,1°С, 5% СО2 в течение 3 сут. Рост эксплантатов ткани в органотипической культуре исследовали прижизненно с помощью фазово-контрастного микроскопа. Для количественной оценки влияния исследуемых препаратов использовали морфометрический метод и пакет программ РИЛоМ 1.2. Рассчитывали индекс площади (ИП), как отношение площади всего эксплантата, включая периферическую зону роста, к площади центральной зоны. За условную единицу площади принимали квадрат окуляр-сетки микроскопа. Сторона квадрата при увеличении 3,5*10 составляла 150 мкм. Значения ИП выражали в процентах по сравнению со значениями ИП контрольных эксплантатов, которые принимали за 100%. Достоверность различий ИП контрольных и экспериментальных образцов оценивали с помощью 1-критерия Стьюдента.
30
2021, т. 19, №5 Молекулярная медицина
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для исследования влияния коротких пептидов на нервную ткань культивировали эксплантаты коры головного мозга крыс, а также сетчатки глаз эмбрионов цыплят. В коре головного мозга крыс имеются пирамидные и ганглионарные нейроны. В сетчатке глаза цыплят расположен слой биполярных нейронов, к которым изнутри примыкает слой ганглионарных нейронов, аксоны которых образуют волокна зрительного нерва. В процессе культивирования вокруг эксплантатов образовывалась зона роста, состоящая из мигрирующих и пролиферирующих нейроцитов, глиоцитов и регенерирующих аксонов. При культивировании коры головного мозга крыс с добавлением в культуральную среду тетрапептида, а также три-пептидов 01и-АБр-А^ и 01и-АБр-Тгр в эффективных концентрациях наблюдалось статистически достоверное увеличение зоны роста на 20—24% по сравнению с контролем. Остальные пептиды не оказывали влияния на рост эксплантатов коры головного мозга крыс. В то же время в культурах сетчатки глаза цыпленка статистически достоверное увеличение зоны роста на 20—72%, по сравнению с контролем, происходило при действии как тетрапептида, так и всех трипептидов (см. таблицу). Необходимо отметить, что наибольшее увеличение ИП на 62—72%, по сравнению с контролем, происходило при действии пептидов 01и-АБр-А^, 01и-Авр-Ьеи, 01и-ЛБр-Тгр.
При исследовании влияния полипептидов в эффективных концентрациях на различные ткани крысы и цыпленка установлено, что эти пептиды стимулируют пролиферацию в эксплантатах обоих видов животных (см. рисунок). При добавлении в культу-ральную среду полипетидного комплекса ткани семенников (тестонорм) ИП эксплантатов семенников крыс и цыплят увеличивался на 28 и 26% соответственно по сравнению с контролем. Под действием полипетидного комплекса ткани сосудов (слави-норм) ИП эксплантатов сосудов крыс и цыплят увеличивался соответственно на 25 и 22% по сравнению с контролем. Также было отмечено статистически достоверное увеличение ИП эксплантатов хряща крыс и цыплят соответственно на 31 и 21% при добавлении в культуральную среду полипептидного комплекса из ткани хрящей (хондолюкс).
В настоящее время также накапливаются сведения о протекторном влиянии коротких пептидов на различные виды живых организмов. Показано стимулирующее и модулирующее влияние коротких пептидов, в том числе 01и-АБр-А^, на кратковременную и долговременную память у насекомых — пчел [11]. У мух стимулирующее влияние коротких пептидов коррелировало с изменением экспрессии генов, реализующих механизмы запоминания [12]. Также было показано, что короткие пептиды регулируют экспрессию генов, синтез белков, нормализует морфологию нейронов у мышей и человека, в том числе при нейродегенеративных заболеваниях, связанных с нарушениями памяти [13—15].
Таким образом, у разных видов живых организмов — млекопитающие, птицы, насекомые, наблюдается параллелизм стимулирующего действия пептидов в ультрамалых концентрациях, на ткани этих организмов. Известно, что кодируемые аминокислоты не обладают специфичностью и в органоти-пической культуре стимулируют пролиферацию во многих тканях [16]. В то же время ди- и трипептиды оказывают пролиферотропное действие на 2—3 типа тканей, а тетрапептиды обладают специфичностью, стимулируя пролиферацию лишь соответствующей ткани [17]. Установлено также, что пептиды обладают возможностями эпигенетического действия [13]. Эти данные отражают эволюционную закономерность усложнения регуляторных процессов в живых системах.
Влияние коротких пептидов на ИП эксплантатов нервной ткани Effect of short peptides on PI of nerve tissue explants
Короткие Кора головного мозга крысы Сетчатка глаза цыпленка
пептиды индекс площади (ИП)
Ala-Glu-Asp-Pro 24* 21*
Ala-Glu-Asp 7 20*
Glu-Asp-Ala 12 31*
Glu-Asp-Arg 23* 62*
Glu-Asp-Leu 15 46*
Glu-Asp-Trp 20* 72*
Примечание. * — р<0,01 по сравнению с контролем. Notes. * — р<0,01 in comparison with control.
35
30
25
« 20 G
S 15 10 5
0
г-Н
• ' H
1
L
1
2
3
Влияние в культуре тканей полипептида тестонорма (1) на семенники, славинорма (2) на сосуды, хондро-люкса (3) на хрящи крыс (светлые столбики) и цыплят (темные столбики) на ИП (%) Примечание. * — р=0,01 по сравнению с контролем (нулевая линия).
The influence in tissue culture of polypeptides testonorm (1) on testis, slavinorm (2) on vessels, khondrolux (3) on cartilages in rats (light columns) and chicks (dark columns) on IP (%) Notes. * — р=0,01 in comparison with control (zero line).
Молекулярная медицина 2021, т. 19, №5
31
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Выявление пролиферотропного тканеспецифи-ческого влияния коротких пептидов и полипептидов на ткани эмбрионов цыплят создает базу для быстрого тестирования пролиферотропных биологически активных веществ с использованием менее дорогостоящих экспериментальных млекопитающих (крыс, мышей). Стимулирующее влияние коротких пептидов на органотипическую культуру нервной ткани сетчатки глаза цыпленка в ряде случаев регистрируется более выраженным, чем в органотипической культуре нервной ткани коры головного мозга крыс.
Параллелизм стимулирующего действия пептидов на ткани млекопитающих и птиц позволяет выЛ И Т Е РАТУ РА / R E F E R E N C E S
1. Anisimov V.N., Khavinson V.Kh. Peptide bioregulation of aging: results and prospects. Biogerontology. 2010; 11: 139-49.
2. Рыжак А.П., Чалисова Н.И., Линькова Н.С., Халимов Р.И., Рыжак Г.А., Жекалов. Влияние полипептидов на регенерацию клеток в культуре разных тканей молодых и старых крыс. Успехи геронтологии. 2015; 28 (1): 97-103.
[Rizhak G.A., Chalisova N.I., Linkova N.S., Khalimov R.I., Ryzhak G.A., Zhekalov A.N. Polypeptide effect on cellular regeneration in different tissue culture of young and old rats. Advances in Gerontology. 2015; 28 (1): 97-103 (In Russian)]
3. Sinjari B., Diomede F., Khavinson V., Mironova E., Linkova N., Trofimova S., Trubiani O., Caputi S. Short peptides protect oral stem cells from ageing. Stem Cell Reviews and Reports. 2020; 16: 159-66. https://doi. org/ 10.1007/s12015-019-09921-3].
4. Журкович И.К., Ковров Н.Г., Рыжак Г.А., Миронова Е.С., Хавинсон В.Х. Идентификация коротких пептидов в составе полипептидных комплексов, выделенных из органов животных. Успехи современной биологии. 2020; 140 (2): 140-8. https://doi. org/10.31857/S004213242002012X [Zhurkovich I.K., Kovrov N.G., Rizhak G.A., Mironova E.S., Khavinson V. Rh. Identification of short peptides in the composition of polypeptide complexes from animal organs. Advances of modern biology. 2020; 140 (2): 140-8. https://doi.org/10.31857/ S004213242002012X (In Russian)].
5. Чалисова Н.И., Линькова Н.С., Ничик Т.Е., Рыжак А.П., Дудков А.В., Рыжак Г.А. Пептидная регуляция клеточного обновления в культурах тканей почек молодых и старых животных. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2015; 1: 10-4. [Chalisova N.I., Linkova N., Nichik T.E., Rizhak A.P.,Dudkov A.V. Rizhak G.A. Peptide regulation of the cellular renewal in kidney tissue culture of young and old animals. Cell technologies in biology and medicine. 2015; 1: 10-4 (In Russian)].
6. Khavinson V., Linkova N., Diatlova A., Trofimova S. Peptide regulation of cell differentiation. Stem Cell Reviews and Reports.
двинуть предположение, что пептидная регуляция жизнедеятельности различных видов животных возможно является одним из древнейших механизмов эволюции живых организмов. В связи с этим можно полагать, что существует единый механизм пептидер-гической регуляции экспрессии генов и синтеза белков в живой природе.
* * *
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
2020; 16: 118-25. https://doi.org/10.1007/ s12015-019-09938-8.
7. Khavinson V., Linkova N., Kozhevnikova E., Trofimova S. EDR Peptide: Possible Mechanism of Gene Expression and Protein Synthesis Regulation Involved in the Pathogenesis of Alzheimer's Disease. J. Molecules. Special Issue Peptide Therapeutics 2021; 26: 1-16. https://doi.org/10.3390/molecules26010159.
8. Хавинсон В.Х., Соловьев А.Ю., Жилин-ский Д.В. Шатаева Л. К., Ванюшин Б. Ф.. Эпигенетические аспекты пептидной регуляции старения. Успехи геронтологии. 2012; 25 (1): 11-6.
[Khavinson V. Kh., Solovyev A. Yu., Zhilinski D. V., Shataeva L. K., Vanyushin B. F. Epige-netic aspects of aging peptide regulation. Advances in Gerontology. 2012; 25 (1): 11-6 (In Russian)].
9. Хавинсон В.Х., Проняева В.Е., Линькова Н.С., Трофимова С.В. Пептидэргическая регуляция дифференцировки эмбриональных клеток сетчатки. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2013; 1: 57-60. [Khavinson V. Kh., Pronyaeva V.E., Linkova N.S., Trofimova S.V. Peptide regulation of embryonal retinal cell differentiation. Cell technologies in biology and medicine. 2013; 1: 57-60 (In Russian)].
10. Khavinson V., Linkova N., Diatlova A., Tro-fimova S. Peptide regulation of cell differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 2020; 16: 118-25. https://doi.org/10.1007/ s12015-019-09938-8.].
11. Хавинсон В.Х., Лопатина Н.Г., Чалисова Н.И., Линькова Н., Халимов Р.И. Влияние трипептида пинеалона на формирование условно-рефлекторной деятельности у медоносной пчелы. Фундаментальные исследования. 2015; 2: 491-6. [Khavinson V.H., Lopatina N.G., Chalisova N.I., Linkova N.S., Khalimov R.I. Tripeptide pinealon effect on the generation of conditional reflex function in honey bee apis. Fundamental Researches. 2015; 2: 491-6 (In Russian)].
12. Саватеева-Попова Е.В., Захаров Г.А. Нейропротекторное действие пептида EDR в модели болезни Паркинсона у Drosophila melanogaster. В кн. Молеку-лярно-клеточные механизмы пептидер-
гической регуляции функций мозга М.: Наука, 2018; 141-59. [Savateeva-Popova E.V., Zakharov G.A. Neuroprotector effect of EDR peptide in Parkinson disease in Drosophila melanogaster. In book Molecular-cellular mechanisms of bran function peptidergic regulation. M.: Nauka, 2018; 141-59 (In Russian)].
13. Khavinson V., Diomede F., Mironova E., Linkova N., Trofimova S., Trubiani O., Caputi S., Sinjari B. AEDG Peptide (Epitalon) Stimulates Gene Expression and Protein Synthesis during Neurogenesis: Possible Epigenetic Mechanism. Molecules. 2020; 25: 1-17. htt-ps://doi.org/10.3390/molecules25030609;
14. Ashapkin V., Khavinson V, Shilovsky G., Linkova N., Vanuyshin B. Gene expression in human mesenchymal stem cell aging cultures: modulation by short peptides. Molecular Biology Reports. 2020; 47 (6): 4323-29. https://doi.org/10.1007/s11033-020-05506-3.
15. Caputi S., Trubiani O., Sinjari B., Trofimova S., Diomede F., Linkova N., Diatlova A., Khavinson V. Effect of short peptides on neuronal differentiation of stem cells. International Journal of Immunapathology and Farma-cology. 2019; 33: 1-12.
16. Чалисова Н. И., Концевая Е. А., Войцехов-ская М. А., Комашня. А. В. Регуляторное влияние кодируемых аминокислот на основные клеточные процессы молодых и старых животных. Успехи геронтологии. 2011; 24 (2):189-97.
[Chalisova N.I., Kontzevaya E.A., Voitzek-hovskaya M.A., Komashnya A.V.Regulating effect of coded amino acids on basic cellular processes of young and old animals. Advances in Gerontology. 2011; 24 (2): 189-97 (In Russian)].
17. Хавинсон В.Х.. Чалисова Н.И., Линькова Н.С., Халимов Р.И., Ничик Т.Е. Зависимость тканеспецифического действия пептидов от их количественного аминокислотного состава. Фундаментальные исследования. 2015; 2: 497-503. [Khavinson V.H., Chalisova N.I., Linkova N.S., Khalimov R.I., Nichik T.E. The dependence of tissue-specific peptides activity on the number of amino acids in the peptides. Fundamental Researches. 2015; 2: 497-503 (In Russian)].
Для цитирования: Чалисова Н.И., Рыжак Г.А., Ивко О.М. Пролиферотропное влияние пептидов на органотипическую культуру тканей млекопитающих и птиц. Молекулярная медицина. 2021; 19 (5): 29-32. https://doi.org/10.29296/24999490-2021-05-04
Поступила 22 января 2021 г.
For citation: Chalisova N.I., Rizhak G.A., Ivko O.M. Рroliferation effect of peptides on orgatypic tissue culture of mammalian and birds. Molekulyarnaya meditsina. 2021; 19 (5): 29-32 (in Russian). https://doi. org/10.29296/24999490-2021-05-04
32
2021, т. 19, №5 Молекулярная медицина
