CC BY
13© Коллектив авторов, 2022 https://doi.org/10.29296/24999490-2022-03-09
ВЛИЯНИЕ ПОЛИПЕПТИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ НА РАЗВИТИЕ ОРГАНОТИПИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ КОЖИ КРЫС РАЗНОГО ВОЗРАСТА
Н.И. Чалисова1, 2, Е.А. Никитина1, 3, Е.О. Гутоп2, Н.В. Фридман2
'Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Российская Федерация, '99034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, д. 6; 2Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии, Российская Федерация, '97110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3; 3Российский государственный педагогический университет им. А.И. Герцена, Российская Федерация, '91186, Санкт-Петербург, наб. р. Мойки, д. 48
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Чалисова Наталья Иосифовна — ведущий научный сотрудник группы пептидной регуляции старения Института физиологии им. И.П. Павлова РАН; ведущий научный сотрудник лаборатории онкогеронтологии отдела биогеронтологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии. Доктор биологических наук, профессор. Тел. +7 (921) 764-73-50. E-mail: ni-chalisova@mail.ru. ORCID: 0000-0002-2371-0043
Никитина Екатерина Александровна — заведующая кафедрой анатомии и физиологии человека и животных Российского государственного педагогического университета им. А.И. Герцена; главный научный сотрудник лаборатории нейрогенетики Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Доктор биологических наук, доцент. Тел. +7(812) 314-46-15 (доб. 27-14). E-mail: 21074@mail.ru. ORCID: 0000-0003-1897-8392.
Гутоп Екатерина Олеговна — старший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов старения отдела биогеронтологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии. Кандидат медицинских наук. Тел. +7(812) 23000-49. E-mail: mgutop@mail.ru. ORCID: 0000-0002-1038-7785.
Фридман Наталья Владимировна — научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов старения отдела биогеронтологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии. Кандидат биологических наук. Тел. +7(921) 918-1827. E-mail: natfri@mail.ru. ORCID: 0000-0001-8929-6829.
Введение. Создание пептидных биорегуляторов, способствующих сохранению основных физиологических функций организма, является актуальной задачей современной биологии и медицины.
Цель исследования — оценить влияние полипептидных комплексов (ППК), выделенных из яичников, мышц и сосудов телят, на рост клеток кожи молодых и старых крыс.
Методы. Органотипическое культивирование ткани кожи крыс проводили при действии различных ППК. Рост ткани кожи рассчитывали по индексу площади (ИП). Оценку экспрессии маркеров пролиферации (PCNA) и апоптоза (р53) проводили методом иммуноцитохимии.
Результаты. Все изученные ППК статистически достоверно увеличивали ИП эксплантатов кожи молодых крыс на 30— 49% и старых животных — на 20—28%. Под действием ППК экспрессия белка р53 снижалась в эксплантатах кожи молодых и старых крыс соответственно на 20—30 и 17—27%. Экспрессия протеина PCNA при добавлении ППК к культурам кожи, полученным от молодых и старых животных, увеличивалась соответственно на 22—39 и 19—31%.
Заключение. Полученные данные создают базу для разработки на основе исследованных ППК новых субстанций, способствующих коррекции патологии и возрастных изменений кожи.
Ключевые слова: полипептидные комплексы, органотипическая культура ткани кожи, старение, р53, PCNA
EFFECT OF POLYPEPTIDE COMPLEXES ON THE DEVELOPMENT OF SKIN ORGANOTYPIC TISSUE CULTURE OF DIFFERENT AGE RATS N.I. Chalisova1'2, E.A. Nikitina13, E.O. Gutop2, N.V. Fridman2
Pavlov Institute of Physiology RAS, Makarova emb., 6, Saint Petersburg, 199034, Russian Federation;
2Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, Dynamo pr., 3, Saint Petersburg, 197110, Russian Federation;
3Herzen State Pedagogical University of Russia, Moika River Emb.,48, Saint Petersburg, 191186, Russian Federation
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Chalisova Natalia Iosifovna — leading researcher of Pavlov Institute of Physiology RAS; senior researcher of the laboratory of Oncogerontology of Biogerontology department of Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology. Doctor of biologic sciences, professor. Tel.: +7(921) 764-73-50. E-mail: ni_chalisova@mail.ru. ORCID: 0000-0002-2371-0043.
Nikitina Ekaterina Alexandrovna — chief of cathedra of human and animal physiology and anatomy of Herzen State Pedagogical University of Russia; chief researcher of the laboratory of neurogenetic of Pavlov Institute of Physiology RAS. Doctor of biological sciences, associate professor. Tel.: +7 (812) 314-46-15 (add. 27-14). E-mail: 21074@mail.ru. ORCID: 0000-0003-1897-8392.
Gutop Ekaterina Olegovna — senior researcher of the laboratory of Molecular mechanisms of aging of Biogerontology department of Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology. MD, PhD. Tel.: +7(812) 230-00-49. E-mail: mgutop@mail.ru. ORCID: 00000002-1038-7785.
Fridman Natalia Vladimirovna — scientific research of the laboratory of Molecular mechanisms of aging of Biogerontology Department of Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology. MD, PhD. Tel.: +7 (921) 918-18-27. E-mail: natfri@mail.ru. ORCID: 0000-0001-8929-6829.
Introduction. The creation of peptide bioregulators that contribute to the preservation of the basic physiological functions of the body is an urgent task of modern biology and medicine.
The aim of the study was to evaluate the effect of polypeptide complexes (PPCs) isolated from the ovaries, muscles and vessels of calves on the growth of skin cells of young and old rats.
Methods. Organotypic cultivation of rat skin tissue was carried out under the action of various PPCs. The growth of skin tissue was calculated by the area index (IP). The expression of proliferation markers (PCNA) and apoptosis (p53) was evaluated by immunocytochemistry.
Results. All the studied demonstrated the statistically significantly increased the area index (IP) of skin explants in young rats by 30—49% and in old animals by 20—28%. The expression of p53protein decreased in the skin explants of young and old rats by 20—30% and 17—27%, respectively under the action of PPCs. PCNA protein expression in skin cultures obtained from young and old animals increased by 22—39% and 19—31% respectively after adding PPCs adding.
Conclusion. The obtained data create the base for the development of new substances based on the studied PPCs that contribute to the correction of pathology and age-related skin changes.
Keywords: polypeptide complexes, organotypic culture of skin tissue, aging, p53, PCNA.
ВВЕДЕНИЕ
Развитие клинической медицины сопряжено с исследованиями, проводимыми на уровне биологически активных молекул. Основу этих актуальных проблем современной физиологии и медицины составляет создание эффективных биорегуляторов, способствующих сохранению ключевых физиологических функций организма. Одной из перспективных биотехнологий является выделение ряда полипептидных комплексов (ППК) из различных органов и тканей молодых животных. ППК принимают участие в сигнальной трансдукции между различными типами клеток и регуляции физиологических процессов в организме. В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии была разработана технология выделения ППК из различных органов и тканей молодых животных (яичников, сосудов, мышц, хрящей, слизистой оболочки бронхов, головного мозга, поджелудочной железы и др.). ППК мышц содержит комплекс пептидов с молекулярной массой до 5 кДа, выделенных из тканей трехглавой мышцы молодых телят. Установлено, что ППК из сосудов телят обладает ангиопротекторными свойствами, нормализует перекисное окисление липи-дов, восстанавливает плотность микрососудов [1—4]. Кроме того, ППК сосудов обладает антиаритмическим действием, смягчает влияние катехоламинов на стенки сосудов при экстремальных воздействиях [4]. Кроме того, биорегуляторные пептиды, содержащиеся практически во всех тканях и органах, выполняют не только сигнальную роль, но и непосредственно участвуют в регуляции физиологических процессов, начиная от отдельных функций специа-
лизированных клеток и заканчивая сложными поведенческими актами [5—6]. В связи с этим актуальными являются исследования влияния ППК на ткани организма в различные возрастные периоды. Одним из первых проявлений процесса старения являются дегенеративные изменения в коже, которая, выполняя барьерную функцию, подвергается не только возрастным изменениям, но и испытывает стресс, обусловленный повреждающими факторами внешней среды [7]. Органотипическое культивирование (ОТК) тканей способствует быстрой скрининговой оценке действия биологически активных веществ на клеточном уровне. Используя этот метод, возможно изучать влияния ППК на ткани организма, в том числе кожи, в различные возрастные периоды. Дегенеративные изменения в коже являются одним из первых проявлений старения, поэтому исследования биологически активных веществ, способных замедлить эти изменения, являются одной из приоритетных задач в области физиологии и гериатрии.
Целью работы было исследование влияния ППК, выделенных из яичников, мышц, сосудов, на развитие ОТК ткани кожи молодых и старых крыс.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Работа проведена на крысах линии Вистар из ЦКП «Биоколлекция ИФ РАН для исследования интегративных механизмов деятельности нервной и висцеральных систем». Эксперименты были выполнены на молодых (2—3-месячных) и старых (18—20-месячных) крысах. Животных умерщвляли с помощью паров эфира. Исследования проводили в соответствии с European Communities Council
Directive 1986 (86/609/EEC) и Guide for the Care and Use of Laboratory Animais. В экспериментах по ОТК тканей использовано 450 эксплантатов кожи молодых и 400 эксплантатов кожи старых крыс.
Отпрепарированные в стерильных условиях фрагменты кожи разделяли на части величиной 1 мм3, которые помещали в чашки Петри с полили-зиновым покрытием дна. Питательная среда состояла из 35% среды Игла, 35% раствора Хенкса, 25% фетальной телячьей сыворотки. В среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед/мл), гентамицин (4 ед/мл). В чашки Петри с экспериментальными эксплантатами добавляли 3 мл питательной среды с ППК яичников, мышц и сосудов. В чашки Петри с контрольными эксплантатами добавляли по 3 мл питательной среды. Таким образом эксплантаты экспериментальной и контрольной групп развивались в одинаковых объемах питательной среды. В исследовании были использованы ППК сосудов и мышц, так как ткань кожи содержит названные компоненты. Функции клеток кожи, в том числе фибробластов, регулируются сигнальными молекулами и пептидами, выделяемым миоцитами и эндотелиоцитами. ППК яичников был исследован в связи с тем, что он, предположительно, участвует в нейроиммуноэндокрин-ной регуляции функций кожи. ППК, выделенные из тканей мышц, сосудов и яичников телят исследованы в концентрации 20 нг/мл [3—4]. Ранее было показано, что для ППК именно такая концентрация является эффективной [8].
ьг Œ R s
о ч
Й °
со
ей ' «
С С <и В Œ <и Œ <и
50
40
30
20
10
с
е
Œ
с «
с Я
Л
р
к -20
о с
IS.
о
-10
30
I I
А
-40
Молодые Старые Молодые Старые Молодые Старые животные животные животные животные животные животные ППК мышц ППК сосудов ППК яичников
PCNA
p53
Влияние полипептидных комплексов сосудов, мышц и яичников на экспрессию белков р53 и PCNA в эксплантатах кожи молодых и старых крыс (контроль — нулевая линия, * — p<0,05).
The effect of vascular, muscle and ovarian polypeptide complexes on p53 and PCNA expression in skin explants of young and old rats (control — zero line, * -p<0,05).
Чашки Петри помещали в термостат при температуре 37°С и через 3 сут просматривали под фазо-воконтрастным микроскопом. Определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали в условных единицах как соотношение площади всего эксплантата (вместе с зоной пролиферирующих и выселяющихся клеток) к площади центральной зоны эксплантата. Для визуализации эксплантатов применяли микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13 «Альфа-Телеком», Россия). Для расчета ИП эксплантатов использовали программу PhotoM 1.2. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принимали за 100%.
В периферической зоне роста эксплантатов на 3-и сутки определяли экспрессию проапоптозно-го белка р53 и маркера пролиферации PCNA. Для иммуноцитохимического исследования использовали первичные моноклональные антитела к про-апоптотическому белку р53 (1:50, Dako) и проли-феротрпному протеину PCNA (1:100, Novocastra). В качестве вторичных антител применяли биоти-нилированные антимышиные иммуноглобулины (Novocastra). Пермеабилизацию проводили с применением 0,1 % тритона Х100. Визуализацию реакции выполняли с применением пероксидазы хрена и диаминобензидина (EnVision Detection System, Peroxidase/DAB, Rabbit, Mouse). Оценку результатов иммуноцитохимического окрашивания проводили морфометрическим методом на микроскопе Nikon Eclipse E400 с помощью цифровой камеры Nikon DXM1200 и программного обеспечения Vidеotest Morphology 5,0. В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении х200. Площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения (%). Этот параметр характеризует количество клеток, в которых экспрессируется исследуемый сигнальный белок.
Статистическая обработка экспериментальных данных включала в себя подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения от среднего и доверительного интервала для каждой выборки и проводилась в программе Statistica 7.0. Для анализа вида распределения использовали критерий Шапиро—Уил-ка. Для проверки статистической однородности нескольких выборок были использованы непараметрические процедуры однофакторного дисперсионного анализа (критерий Крускала-Уоллиса). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.
I
*
*
*
*
*
*
*
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При введении ППК, выделенных из тканей яичников, ИП эксплантатов кожи, полученных от молодых животных, достоверно увеличивался на 49±11%, а ИП эксплантатов от старых животных — на 28±5%. При действии полипептидов, выделенных из тканей мышц, ИП статистически значимо повышался на 39±7 и 20±4% в эксплантатах кожи, полученных от молодых и старых животных соответственно. ППК, выделенные из тканей сосудов, вызывали достоверную стимуляцию зоны роста эксплантатов на 30±7 и 21±3% в эксплантатах кожи, полученных от молодых и старых животных. Таким образом, протекторный эффект всех изученных ППК больше проявлялся в эксплантатах кожи, полученных от молодых крыс по сравнению с данными, полученным на ткани кожи от старых животных.
При иммуноцитохимическом исследовании влияния ППК сосудов, мышц и яичников на эксплантаты кожи молодых крыс обнаружено снижение экспрессии проапоптозного белка р53 на 17—30% и повышение экспрессии белка PCNA на 19—39% (см. рисунок). Уменьшение площади экспрессии р53 находилось в отрицательной корреляции, а увеличение площади экспрессии маркера клеточной пролиферации PCNA — в положительной корреляции с увеличением зоны роста эксплантата под действием полипептидов. ППК мышц повышал синтез проли-феротропного белка PCNA в ОТК ткани кожи молодых и старых животных соответственно на 28 и 20%. ППК мышц снижал экспрессию проапоптотического протеина р53 в ОТК ткани кожи молодых и старых животных соответственно на 20% и 17%. ППК сосудов повышал синтез белка PCNA в ОТК ткани кожи молодых и старых крыс соответственно на 39% и 31%. ППК сосудов снижал синтез протеина р53 в ОТК ткани кожи молодых и старых животных соответственно на 30 и 27%. ППК яичников повышал синтез белка PCNA в ОТК ткани кожи молодых и старых крыс соответственно на 22 и 19%, но не влиял на синтез протеина р53.
Таким образом, ППК мышц и сосудов регулируют пролиферацию и запрограммированную клеточную гибель клеток кожи, в том числе при ее старении. При исследовании влияния ППК, вы-
деленных из тканей яичников, мышц и сосудов, установлено, что они влияют на клеточное обновление в коже молодых и старых крыс. Методом ультраэффективной жидкостной хроматомасс-спек-трометрии ранее была проведена идентификация трипептида KED в ППК сосудов [9]. Этот трипеп-тид, связывающийся с промоторным участком гена MKI67 (ген, кодирующий белок пролиферации Ki67) может играть важную роль в усилении процессов клеточной регенерации, наблюдаемой при действии ППК сосудов [5].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Стимуляция пролиферации клеток кожи молодых и старых животных при действии экстрагированных из различных тканей ППК свидетельствует о перспективности разработки на их основе субстанций как для лечения патологии кожи, так и для их использования в геронтокосметологии. Наиболее эффективным для стимуляции клеточного обновления ткани кожи в норме и при ее возрастной инволюции были ППК, выделенный из яичников [10] и сосудов [1]. Возможно, такой эффект наблюдается потому, что ППК яичников регулирует эндокринную функцию различных типов клеток, в том числе фибробла-стов кожи [11]. ППК сосудов содержит пептид KED, который также обладает протекторными свойствами в отношении фибробластов кожи при их репликатив-ном старении [12].
* * *
Работа выполнена при поддержке Государственной программы РФ 47 ГП «Научно-технологическое развитие Российской Федерации» (2019—2030) (тема 63.1).
This study was supported by the State Program of the Russian Federation 47 GP «Scientific and Technological Development of the Russian Federation» (2019—2030) (theme 63.1).
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Кузник Б.И., Рыжак Г.А., Хавинсон В.Х. Полипептидный комплекс сосудов и его роль в регуляции физиологических функций при возрастной патологии. Успехи геронтологии. 2019; 32 (1-2): 174-9.
[Kuznik B.I., Ryzhak G.A., Khavinson V.K. Polypeptide vessel complex and its role in physiology function regulation in aging pathology. Adv. Gerontol. 2019; 32 (1-2): 174-9 (In Russian)].
2. Соколова И.Б., Рыжак Г.А., Хавинсон В.Х. Функциональная кумуляция влияния пептидного биорегулятора сосудов
на микроциркуляцию в коре головного мозга у спонтанно гипертензивных крыс. Успехи геронтологии. 2017; 30 (5): 671-5. [Sokolova I.B., Ryzhak G.A., Khavinson V.K. Functional cumulation of influence of vascular peptide bioregulator on microcirculation in the brain cortex of spontaneously hypertensive rats. Adv. Gerontol. 2017; 30 (5): 671-5 (In Russian)].
3. Хавинсон В.Х. Лекарственные пептидные препараты: прошлое, настоящее, будущее. Клиническая медицина. 2020; 98 (3): 165-77.
[Khavinson V.Kh. Peptides medicines: past, present, future. Clinical Medicine. 2020; 98 (3): 165-77 (In Russian)].
4. Sokolova I.B., Mel'nikova N.N., Sergeev I.V., Sergeev I.V., Khavinson V.Kh. Effects of vascular peptide bioregulator on the density of microvascular network in the brain cortex of aged rats. Bull. Exp. Biol. Med. 2016; 161 (2): 300-3. https://doi.org/:10.1007/ s10517-016-3400-8.
5. Khavinson V.Kh., Tarnovskaia S.I., Lin'kova N.S., Guton E.O., Elashkina E.V. Epigenetic aspects of peptidergic regulation of vascular endothelial cell proliferation during aging. Adv. Gerontol. 2014; 27 (1): 108-14.
6. Хавинсон В., Рывкин А., Трофимова С.,
Ильницкий А., Трофимов А., Прощаев К., Лыщев А. Персонализированная профилактика возрастной патологии как одно из условий оздоровления населения России. Врач. 2019; 30 (7): 18-22. https://doi.org/:10.29296/25877305-2019-07-03.
[Khavinson V., Ryvkin A., Trifimova S., Ilnitski A., Trifimov A., Prashchayeu K. Lyshchev A. Personalized prevention of age-related pathology as one of the health improvement conditions in Russian population. Vrach. 2019; 30 (7): 18-22. https://doi. org/:10.29296/25877305-2019-07-03 (In Russian)].
7. Gu Y., Han J., Jiang C., Zhang Y. Biomark-ers, oxidative stress and autophagy in skin aging. Ageing Res. Rev. 2020; 59: 101036. https://doi.org/:10.1016/j.arr.2020.101036.
8. Рыжак Г.А., Чалисова Н.И., Ивко О.М., Заломаева Е.С., Иванова П.Н. Протекторное влияние биорегуляторных пептидов на развитие органотипической культуры тканей в присутствии цитостатика. Молекулярная медицина. 2020; 18 (6): 52-6. https://doi. org/10.29296/24999490-2020-06-08. [Ryzhak G.A., Chalisova N.I., Ivko O.M., Zalomaeva E.S., Ivanova P.N. Protective influence of bioregulatory peptides on the development of organothyypic cell tissues in the presence of cytostatic. Molecular Medicine. 2020; 18 (6): 52-6. https://doi. org/10.29296/24999490-2020-06-08 (In Russian)].
9. Журкович И.К., Ковров Н.Г., Рыжак Г.А., Миронова Е.С., Хавинсон В.Х. Идентификация коротких пептидов в составе полипептидных комплексов, выделенных из органов животных. Успехи современной биологии. 2020; 140 (2): 140-8. https://doi.org/10.31857/ S004213242002012X.
[Zhurkovich I.K., Kovrov N.G., Ryzhak G.A., Mironova E.S., Khavinson V.Kh. Identification of short peptides in the composition of polypeptide complexes isolated from animal organs. Biology Bulletin Review. 2020; 140 (2): 140-8. https://doi.org/10.31857/ S004213242002012X (In Russian)].
10. Khavinson V.Kh., Malinin V.V., Ryzhak G.A. Pharmaceutical substance normalizing female reproductive function and method for producing the same. Eurasia Patent. ЕА 010736. 30.10.2008.
11. Фридман Н.В., Линькова Н.С., Бойко Л.В., Кахели М.А. Влияние пептидных биорегуляторов на структурно-функциональные особенности кожи лица женщин пожилого возраста. Молекулярная медицина. 2021; 4: 42-6. https://doi.org/10.29296/24999490-2021-04-07.
[Fridman N.V., Linkova N.S., Bijko L.V., Kacheli M.A. The effect of peptide bioregulators on the structural and functional features of the facial skin of elderly women. Molecular Medicine. 2021; 4: 42-6. https:// doi.org/10.29296/24999490-2021-04-07 (In Russian)].
12. Линькова Н.С., Чалисова Н.И., Рыжак Г.А., Гутоп Е.О., Кожевникова Е.О., Фридман Н.В. Влияние вазопротекторных пептидов на апоптоз органотипической культуры кожи крыс. Современные проблемы науки и образования. 2021; 3. http:// www.science-education.ru/article/ view?id=30893.
[Linkova N.S., Chalisova N.I., Ryzhak G.A., Gutop E.O., Kozhevnikova E.O., Fridman N.V. Influence of vasoprotective peptides on the apoptosis of organothypic skin cell culture of rats. Modern Problems of Science and Education. 2021; 3. http:// www.science-education.ru/article/ view?id=30893 (In Russian)].
Для цитирования: Чалисова Н.И., Никитина Е.А., Гутоп Е.О., Фридман Н.В. Влияние полипептидных комплексов на развитие органотипической культуры ткани кожи крыс разного возраста. Молекулярная медицина. 2022; 20 (3): 60-64. Ь1^рз://Со1. огд/10.29296/24999490-2022-03-09
Поступила 17 апреля 2022 г.
For citation: Chalisova N.I., Nikitina E.A., Gutop E.O., Fridman N.V. Effect of polypeptide complexes on the development of skin organotypic tissue culture of different age rats. Molekulyarnaya meditsina. 2022; 20 (3): 60-64 (in Russian). https://doi.org/10.29296/24999490h 2022-03-09
