CC BY
14© Коллектив авторов, 2022 https://doi.org/10.29296/24999490-2022-04-09
ВЛИЯНИЕ ДИПЕПТИДОВ НА РОСТ КЛЕТОК В ОРГАНОТИПИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЕ ТКАНЕЙ МОЛОДЫХ И СТАРЫХ КРЫС
Н.И. Чалисова1, 2, Г.А. Рыжак1, В.Х. Хавинсон1, 2
'АННО ВО НИЦ «Санкт-Петербургский Институт биорегуляции и геронтологии», Российская Федерация, '97''0, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3; 2ФГБУН «Институт физиологии им. И.П. Павлова» Российской академии наук, Российская Федерация, '99034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, д. 6
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Чалисова Наталья Иосифовна — ведущий научный сотрудник группы пептидной регуляции старения ФГБУН «Институт физиологии им. И.П. Павлова» РАН. Ведущий научный сотрудник лаборатории онкогеронтологии АННО ВО НИЦ «Санкт-Петербургский Институт биорегуляции и геронтологии». Доктор биологических наук, профессор. Тел.: +7 (921) 764-73-50. E-mail: ni_chalisova@mail.ru. ORCID: 0000-0002-2371-0043
Рыжак Галина Анатольевна — заместитель директора АННО ВО НИЦ«Санкт-Петербургский Институт биорегуляции и геронтологии» по научной работе и новым технологиям. Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор. Тел.: +7(921) 934-88-47. E-mail:galina@gerontology.ru ORCID: 0000-0003-2536-1438
Хавинсон Владимир Хацкелевич — директор АННО ВО НИЦ«Санкт-Петербургский Институт биорегуляции и геронтологии» по научной работе и новым технологиям. Заведующий группой пептидной регуляции старения ФГБУН «Институт физиологии им. И.П. Павлова» РАН. Действительный член РАН. Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор. Тел.: +7(921) 911-08-00. E-mail: khavinson@gerontology.ru ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7547-7725
Актуальность. Дипептиды являются физиологическими продуктами деградации белков и информационными молекулами. Пептиды Asp-Pro, Asp-Ala и Glu-Ala обладают репаративными и геропротективными свойствами.
Цель работы — оценить влияние пептидов Asp-Pro, Asp-Ala и Glu-Ala на развитие органотипической культуры тканей бронхов, сосудов и подкорковых структур мозга у молодых и старых крыс.
Материал и методы. Проводилось органотипическое культивирование тканей бронхов, сосудов, подкорковых структур мозга, полученных от молодых (2—3 мес) и старых (18—20 мес) крыс линии Вистар.
Результаты. Пептиды Asp-Pro, Asp-Ala и Glu-Ala стимулировали рост клеток в соответствующих тканях (бронхов, сосудов и подкорковых структур мозга) молодых и старых животных.
Заключение. Дипептиды Asp-Pro, Asp-Ala и Glu-Ala создают базу для разработки лекарственных средств, в том числе геро-протекторных, улучшающих функциональную активность тканей бронхов, сосудов, подкорковых структур мозга.
Ключевые слова: дипептиды, органотипическая культура тканей, клеточный рост, старение
EFFECT OF DIPEPTIDES ON CELLULAR GROWTH IN ORGANOTYPIC CULTURE OF TISSUES FROM YOUNG AND OLD RATS N.I. Chalisova1'2, G.A. Ryzhak1, V.Kh. Khavinson1 2
1Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, Dynamo pr., 3, Saint-Petersburg, 197110, Russian Federation;
2Pavlov Institute of Physiology, Russian Academy of Sciences, Makarova emb., 6, Saint-Petersburg, 199034, Russian Federation
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Chalisova Natalia Iosifovna — Leading researcher of Pavlov Institute of Physiology RAS, Senior researcher of the laboratory of Oncogerontology of Biogerontology department of Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology. Doctor of biologic sciences, professor. Tel.: +7(921) 764-73-50. E-mail: ni_chalisova@mail.ru ORCID: 0000-0002-2371-0043
Ryzhak Galina Anatol'evna — associate Director of Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology in scientific investigation. Doctor of medical sciences, рrofessor. Tel.: +7 (921) 934-88-47. E-mail: galina@gerontology.ru ORCID: 0000- 0003-2536-1438
Khavinson Vladimir Khatzkelevich — Director of Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology. Chief of scientific group of aging peptideregulation of Pavlov Institute of Physiology RAS. Academic of Russian Academy of Sciences. Honored Scientist RF. Doctor of medical sciences, рrofessor. Тел. +7 (921) 911-08-00. E-mail: khavinson@gerontology.ru ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7547-7725
Dipeptides are physiological products of protein degradation and informational molecules. Asp-Pro, Asp-Ala, Glu-Ala peptides have geroprotective, reparative properties.
The aim of the work is to evaluate the effect of the Asp-Pro, Asp-Ala u Glu-Ala peptides on the development of organotypic tissue culture (bronchi, vessels, brain subcortical structures)in young and old rats.
Material and methods. Tissues for organotypic cultivation of bronchi, vessels, brain subcortical structures were obtained from young (2—3 months) and old (18—20 months) Wistar rats.
Results. Asp-Pro peptide stimulated cell growth in bronchi tissues of young and old animals. Asp-Ala peptide activated cell proliferation in vessels tissues of young and old rats. Glu-Ala peptide had a stimulating effect on the brain subcortical structures tissue of young and old rats.
Conclusion. Asp-Pro, Asp-Ala, Glu-Ala peptides have effects on corresponding tissues obtained from animals of different ages. This indicates the possibility of base formation for working of preparations, including the geroprotective, perfecting the functional activity of bronchi, vessels, brain subcortical structures.
Key words: dipeptides, organotypic cell tissue, cellular growth, aging
ВВЕДЕНИЕ
Создание эффективных биорегуляторов, способствующих сохранению ключевых физиологических функций организма, является одной их актуальных проблем современной биологии и медицины. В АННО ВО НИЦ «Санкт-Петербургский Институт биорегуляции и геронтологии» на основе частотного анализа количества кодируемых L-аминокислот в различных тканях из наиболее часто встречающихся в данной ткани аминокислот были синтезированы короткие пептиды. Эти пептиды обладают свойствами стимулировать клеточный рост в соответствующих тканях [1—3]. Методом органотипического культивирования тканей возможно осуществление быстрой скрининговой оценки действия биологически активных веществ на клеточном уровне [4]. Используя этот метод, возможно изучать влияние коротких пептидов на различные ткани организма.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Работа проведена на крысах линии Вистар из ЦКП «Биоколлекция ИФ РАН для исследования интегративных механизмов деятельности нервной и висцеральных систем». Эксперименты были выполнены на молодых (2—3-месячных) и старых (18—20-месячных) крысах. Животных умерщвляли с помощью паров эфира. Исследования проводили в соответствии с European Communities Council Directive 1986 (86/609/EEC) и Guide for the Care and Use of Laboratory Animais. В экспериментах по орга-нотипическому культивированию тканей использовано 620 эксплантатов сосудов, бронхов, подкорковых образований головного мозга от молодых и 600 эксплантатов аналогичных тканей от старых крыс.
Отпрепарированные в стерильных условиях фрагменты тканей разделяли на части величиной 1 мм3, которые помещали в чашки Петри с полили-зиновым покрытием дна. Питательная среда состояла из 35% среды Игла, 35% раствора Хенкса, 25% феталь-ной телячьей сыворотки. В среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед/мл), гентамицин (4 ед/мл). В чашки Петри с экспериментальными эксплантатами добавляли 3 мл питательной среды с исследуемыми дипептидами. В чашки Петри с контрольными эксплантатами добавляли по 3 мл питательной среды. Таким образом эксплантаты экспериментальной
и контрольной групп развивались в одинаковых объемах питательной среды. В исследовании были использованы дипептиды Asp-Pro, созданный на основе анализа аминокислотного состава ткани бронхов [5] Asp-Ala, полученный при анализе аминокислотного состава ткани сосудов [6], и Glu-Ala, созданный на основе анализа ткани подкорковых структур головного мозга [ 7].
Чашки Петри помещали в термостат при температуре 37°С и через 3 суток просматривали под фа-зово-контрастным микроскопом. В процессе культивирования вокруг эксплантатов образовывалась зона роста, состоящая из мигрирующих и проли-ферирующих клеток. Определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали в процентах как соотношение площади всего эксплантата (вместе с зоной выселяющихся клеток) и площади центральной зоны эксплантата. Определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали в условных единицах как соотношение площади всего эксплантата (вместе с зоной пролиферирующих и выселяющихся клеток) к площади центральной зоны эксплантата. Для визуализации эксплантатов применяли микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13 «Альфа-Телеком», Россия). Для расчета ИП эксплантатов использовали программу PhotoM 1.2. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принимали за 100%.
В периферической зоне роста эксплантатов на 3-и сутки определяли также экспрессию проапоптозного белка р53 и маркера пролиферации PCNA. Для им-муноцитохимического исследования использовали первичные моноклональные антитела к проапопто-тическому белку р53 (1:50, Dako) и пролиферотроп-ному протеину PCNA (1:100, Novocastra). В качестве вторичных антител применяли биотинилированные антимышиные иммуноглобулины (Novocastra). Пер-меабилизацию проводили с применением 0,1% тритона Х100. Визуализацию реакции выполняли с применением пероксидазы хрена и диаминобензидина (EnVision Detection System, Peroxidase/DAB, Rabbit, Mouse). Оценку результатов иммуноцитохимическо-го окрашивания проводили морфометрическим методом на микроскопе Nikon Eclipse E400 с помощью цифровой камеры Nikon DXM1200 и программного обеспечения Vidеotest Morphology 5,0.
В каждом случае анализировали 5 полей зрения при ><200. Площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивны-ми клетками, к общей площади клеток в поле зрения, и выражали в процентах. Этот параметр характеризует количество клеток, в которых экспрессируется исследуемый сигнальный белок.
Статистическая обработка экспериментальных данных включала в себя подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения от среднего и доверительного интервала для каждой выборки и проводилась в программе Statistica 7.0. Для анализа вида распределения использовали критерий Шапиро—Уилка. Для проверки статистической однородности нескольких выборок были использованы непараметрические процедуры однофакторного дисперсионного анализа (критерий Крускала-Уол-лиса). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В органотипических культурах клеток слизистой оболочки бронхов молодых крыс под действием дипептида Asp-Pro достоверно повышался ИП по сравнению с контролем на 28±3%. В органотипических культурах клеток бронхов старых крыс под действием пептида Asp-Pro ИП статистически значимо повышался по сравнению с контролем на 40±1% (см. рисунок). Добавление в органотипические культуры слизистой оболочки бронхов молодых и старых крыс аминокислот Asp или Pro не приводило к достоверному повышению (ИП увеличивался со-
Влияние дипептидов на индекс площади зоны роста эксплантатов тканей различного генеза от молодых и старых крыс Примечание: контроль — нулевая линия; * — p<0,05 — по сравнению с соответствующим контролем.
The effect of dipeptide on the area index of the growth zone of tissue explants of various genesis from young and old rats
Note: Control is the zero line; * — p<0.05 — compared to the corresponding control.
ответственно на 4±1 и 8±2% по сравнению с контролем). Таким образом, пептид Asp-Pro стимулирует рост органотипической культуры тканей слизистой оболочки бронхов крыс, причем его эффект более выражен при воздействии на культуры, полученные от старых животных.
Аминокислоты, входящие в состав изучаемого пептида, не влияют на ИП зоны роста эксплантатов тканей слизистой оболочки бронхов молодых и старых крыс, что указывает на важную роль пептидной связи в структуре пептида Asp-Pro в стимуляции роста клеток слизистой оболочки бронхов. Пептид AspPro снижал площадь экспрессии проапоптотического белка р53 в органотипических культурах ткани бронхов молодых крыс и старых крыс на 20±3 и 32±7% соответственно, а площадь экспрессии маркера клеточной пролиферации PCNA увеличивалась в культурах ткани бронхов молодых и старых животных на 25±3 и 29±5% соответственно.
В органотипических культурах сосудов молодых крыс под действием пептида Asp-Ala ИП достоверно повышался по сравнению с контролем на 29±1%, а в органотипических культурах сосудов старых крыс под действием пептида Asp-Ala ИП — на 56±2%. При добавлении в органотипические культуры сосудов молодых и старых крыс аминокислот Asp или Ala не происходило достоверного повышения ИП (на 3±1 и 5±3% соответственно по сравнению с контролем). Пептид Asp-Ala снижал площадь экспрессии проапоптотического белка р53 в органо-типических культурах сосудов молодых крыс на 25±3%, в культурах ткани старых крыс — на 39±9%.
Площадь экспрессии белка PCNA в культурах ткани сосудов молодых и старых крыс увеличивалась на 27±3 и 31+7% соответственно.
Дипептид Glu-Ala исследован в культуре ткани подкорковых структур головного мозга крыс. У молодых животных ИП эксплантатов увеличивался на 23+1% по сравнению с контролем и на 34+5% — в культуре ткани от старых крыс. Пептид Glu-Ala снижал площадь экспрессии проапоптотиче-ского белка р53 в органотипических культурах подкорковых структур молодых крыс на 27+3%, старых крыс — на 30+5%. При добавлении по отдельности в культуры сосудов молодых и старых крыс аминокислот Glu или Ala достоверного повышения ИП, который по сравнению с контролем составлял 5+1 и 7+2% соответственно, не выявлялось. Площадь экспрессии белка PCNA в культурах ткани подкорковых структур голов -ного мозга молодых и старых крыс увеличивалась на 26+3 и 28+7% соответственно.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, влияние исследованных дипептидов на зону роста эксплантатов различных тканей связано с их стимулирующим действием на про-лиферационные процессы и снижением апоптоза в тканях. Эти эффекты дипептидов обусловлены их структурой, а именно — наличием пептидной связи, так как отдельно взятые аминокислоты, входящие в состав дипептидов, не влияют на рост органотипической культуры тканей. При исследовании данных дипептидов установлено, что они являются эффективными средствами для стимуляции процессов клеточного обновления и повышения функциональной активности клеток соответствующих тканей от молодых и старых крыс.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Журкович И.К., Ковров Н.Г., Рыжак Г.А., Миронова Е.С., Хавинсон В.Х. Идентификация коротких пептидов в составе полипептидных комплексов, выделенных из органов животных. 5. Успехи современной биологии. 2020; 140 (2): 140-8. https://doi.org/10.31857/ S004213242002012X. / [Zhurkovich I.K., Kov-rov N.G., Ryzhak G.A., Mironova E.S., Khav-inson V.Kh. Identification of short peptides in the composition of polypeptide complexes isolated from animal organs. Biology Bulletin Review. 2020; 140 (2): 140-8. https:// doi.org/10.31857/S004213242002012X (In Russian)),
2. Khavinson V., Ilina A., Kraskovskaya N., Linkova N., Kolchina N., Mironova E., 6. Erofeev А., Petukhov M. Neuroprotective Effects of Tripeptides - Epigenetic Regulators in Mouse Model of Alzheimer's Disease. Pharmaceuticals. Special Issue Epigenetic Drugs. 2021; 14 (6): 515. https:// doi.org/10.3390/ph14060515.
3. Avolio F., Martinotti S., Khavinson V.Kh., Esposito J.E., Giambuzzi G., Marino A., Mironova E., Pulcini R., Robuffo I., Bologna G., Simeone P., Lanuti P., Guarnieri S., Trofimova S., Procopio A.D., Toniato E. Pep-tides Regulating Proliferative Activity and Inflammatory Pathways in the Monocyte/ 7. Macrophage THP-1 Cell Line International J. of Molecular Sciences 2022; 23: 3607-9.
4. Chalisova N.I. Effect of synthesized dipep-
Для цитирования: Чалисова Н.И., Рыжак Г.А., Хавинсон В.Х. Влияние дипептидов на рост клеток в органотипической культуре тканей молодых и старых крыс. Молекулярная медицина. 2022; 20 (4): 56-59. https://doi.org/10.29296/24999490-2022-04-09
Так же, как исследованные ранее другие короткие пептиды [8, 9, 10] — дипептиды Asp-Pro, Asp-Ala и Glu-Ala — создают базу для разработки лекарственных средств, в том числе геропротекторных, улучшающих функциональную активность тканей бронхов, сосудов, подкорковых структур мозга. Создаются условия для улучшения способов профилактики и лечения дисфункции в органах и тканях организма.
* * *
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
обучению и формированию памяти, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения. Патент РФ RU 2 768 475 C1. Бюл. №9 от 24.03.2022. [Khavinson V., Ryzhak G.A., Linkova N.S, Mironova E.S. Peptide possessed a neu-ritstimulating action and restoring ability to learning and the memory formation, pharmaceutic composition on its basis and its using method. Patent RF RU 2 769 051 C1 Bul. №9 from 24.03.2022 (In Russian)).
8. Ilina A., Khavinson V., Linkova N., Petukhov M. 4,5-Neuroepigenetic Mechanisms of Action of Ultrashort Peptides in Alzheimer's Disease. Int. J. Mol. Sci. 2022; 23: 4259. https://doi.org/10.3390/ijms23084259
9. Хавинсон В.Х. Лекарственные пептидные препараты: прошлое, настоящее, будущее. Клиническая медицина. 2020; 98 (3): 165-77. https://doi. org/10.30629/0023-2149-2020-98-3-165-177. [Khavinson V.Kh. Medicinal peptide drugs: past, present, future. Clinical Medicine. 2020; 98 (3): 165-77. https://doi. org/10.30629/0023-2149-2020-98-3-165-177 (In Russian)).
10. Fridman N.V., Linkova N.S., Kozhevnikova, E.O., Gutop E.O. Khavinson V.Kh. Comparison of the effects of KE and AED peptides on functional activity of human skin fibro-blasts during their replicative aging. Bull. Exp. Biol. Med. 2020; (3): 154-7. https://doi. org/0.47056/1814-3490-2020-3-197-201.
Поступила 17 мая 2022 г.
For citation: Chalisova N.I., Ryzhak G.A., Khavinson V.Kh. Effect of di-peptides on cellular growth in organotypic culture of tissues from young and old rats. Molekulyarnaya meditsina. 2022; 20 (4): 56-59 (in Russian). https://doi.org/10.29296/24999490-2022-04-09
tide L-Leu-Lys on cell proliferation and apoptosis in organotypic tissue culture from rat spleen. Applied Cell Biology. 2015; 4 (2): 27-31.
Хавинсон В.Х., Рыжак Г.А., Линькова Н.С., Миронова Е.С. Пептид, обладающий бронхопротекторным действием, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения. Патент РФ RU 2 767 532 C1. Бюл. №8 от 17.03.2022. [Khavinson V., Ryzhak G.A., Linkova N.S., Mironova E.S. Peptide possessed a bronchi-tropic action, pharmaceutic composition on its basis and its using method. Patent RF RU 2 767 532 C1. Bul. №8 from 17.03.2022 (In Russian)).
Хавинсон В.Х., Рыжак Г.А., Линькова Н.С., Миронова Е.С. Пептид, улучшающий функциональные свойства эндотелия сосудов, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения. Патент РФ RU 2 769 051 C1. Бюл. №10 от 28.03.2022. [Khavinson V., Ryzhak G.A., Linkova N.S., Mironova E.S. Peptide perfect the vessel endothelium functional characters, pharmaceutic composition on its basis and its using method. Patent RF RU 2 769 051 C1 Bul. №10 from 28.03.2022 (In Russian)).
Хавинсон В.Х., Рыжак Г.А., Линькова Н.С., Миронова Е.С. Пептид, обладающий нейростимулирующей активностью и восстанавливающий способность к
