CC BY
35
____________ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА_________________________
2004 Биология Вып. 2
УДК 612.017.1.018
ВЛИЯНИЕ ТЕРБУТАЛИНА СУЛЬФАТА И МОДУЛЯТОРОВ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ НА ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ IN VITRO
Ю. И. Шилова Ь, Е. Г. Орлова6, Д. В. Ланинь
а Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15 ь Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13
Установлено, что в системе in vitro тербуталина сульфат (10'6 М) угнетает фагоцитарную активность нейтрофилов. Сходное воздействие оказывает теофиллин (3 мМ). Инкубация ней-трофилов с верапамилом гидрохлоридом (0,025 мг/мл) стимулирует фагоцитарную активность нейтрофилов. Показано, что литий оксибугират (1,5 мг/мл) не оказывает влияния на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов.
Адренергические соединения являются важнейшими факторами нейроэндокринной регуляции функций иммунной системы при различных физиологических и патологических состояниях (Абрамов, 1988; Корнева, Шхинек, 1988; Крыжанов-ский и др., 1997; DelRey et al., 2002; Sanders, Straub, 2002). Направленность регуляторных эффектов катехоламинов на функцию фагоцитирующих клеток зависит от уровня экспрессии того или иного типа специфических рецепторов, причем ранее показано разнонаправленное влияние стимуляции разных типов адренорецепторов на функциональную активность клеток (Шилов, Ланин, 2001; Spengler et al., 1994; Shilov, Orlova, 2003). Основными внутриклеточными посредниками, реализующими эффекты адренергических соединений на молекулярном уровне, являются циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), продукты метаболизма фосфатидилинозитола и ионы кальция, которые через специфические протеинкиназы определяют процесс фосфорилирования соответствующих факторов транскрипции и реализацию биологических эффектов (Elenkov et al., 2000). Однако направленность изменений интегральных показателей фагоцитарной активности нейтрофилов в условиях фармакологической модуляции указанных сигнальных путей изучена недостаточно.
Цель настоящей работы - анализ воздействия Р-адренергического агониста тербуталина сульфата и модуляторов сигнальных путей на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови крыс в эксперименте in vitro.
Материалы и методы исследования
Эксперименты выполнены на 60 крысах-самцах популяции Wistar массой 188,7±6,5 г. Образцы периферической крови получали из сосудов хвоста интактных животных. Влияние Р-адренергического агониста тербуталина сульфата (10'6 М), лития окси-бутирата (1,5 мг/мл, ингибитор инозитол-1-моно-фосфатазы), теофиллина (3 мМ, ингибитор фосфо-диэстеразы цАМФ) и верапамила гидрохлорида (0,025 мг/мл, блокатор "медленных", потенциалне-зависимых кальциевых каналов) на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови оценивали в системе in vitro. При выборе концентраций ориентировались на ранее опубликованные данные (Ярилин, 1985; Ширшев, Кеворков, 1993; Шилов, Шилов, 2001). Работу проводили на забуфе-ренной питательной среде, приготовленной на среде 199 с добавлением 10 mM HEPES и 2 гпМ 1-глутамина. В опытных пробах клетки гепаринизиро-ванной крови (50 ЕД/мл) преинкубировали с вышеупомянутыми препаратами в соответствующей концентрации в течение 1 ч при 37°С. В контрольные пробы вместо препаратов вносили такое же количество забуференной питательной среды. Фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови исследовали по отношению к формалинизиро-ванным эритроцитам барана по ранее описанному методу (Каплин, 1996; Шилов и др., 1998).
Статистическую достоверность различий оценивали по парному /-критерию Стьюдента, знаковому Т-критерию Вилкоксона.
© Ю.И. Шилов, Е.Г. Орлова, Д.В. Ланин, 2004
Влияние тербутапина сульфата и модуляторов сигнальных путей.
183
Результаты и их обсуждение
Установлено, что у интактных животных преимущественная стимуляция Р-адренорецепторов при добавлении р-адренергического агониста тер-буталина сульфата угнетает фагоцитарную активность нейтрофилов как по относительным, так и по абсолютным показателям (табл. 1). При моделировании эффекта стимуляции Р-адренорецепторов добавлением теофиллина - блокатора фосфодиэ-стеразы, повышающего уровень цАМФ, также выявлено угнетение фагоцитарной активности нейтрофилов как по относительным, так и по абсолютным показателям (табл. 2). По данным литературы (Аи е1 а1., 1998), внесение других цАМФ-повышающих агентов, таких как простагландин Е2 и дибутирил-цАМФ, также оказывает супрессивное влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов. Таким образом, угнетающее действие адренергических соединений на фагоцитарную активность нейтрофилов может реализоваться через р-адренорецепторы и повышение уровня внутриклеточного цАМФ.
Таблица 1
Влияние тербуталина сульфата (106 М) in vitro на показатели фагоцитарной активности ней-
трофилов перш >ерической крови крыс
Показатели Контроль (пре-инкубация со средой) Тербуталин сульфат
Фагоцитарное число 0,32±0,02 0,24±0,02Tt
Фагоцитарный индекс 1,35±0,04 1,33±0,04
Процент фагоцитоза 23,7±0,8 18,2±0,8Т'
Абс. число объектов 731,0±84,4 491,7±68,3Tt
Абс. число фагоцитирующих нейтрофилов 530,4±54,0 372,5±53,0Tt
Примечание. Здесь и в табл. 2 Т - р<0,05 в сравнении с показателями контроля по Т-критерию Вилкоксо-на, t - р<0,05 в сравнении с показателями контроля по парному г-критерию Стьюдента.
Ранее в наших работах было показано, что преимущественная стимуляция адренергическими соединениями а-адренорецепторов при остром им-мобилизационном стрессе повышает фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови крыс, поскольку введение p-адреноблокатора про-пранолола усиливает активирующее влияние стресса на функции фагоцитирующих клеток (Shilov, Orlova, 2003). Известно, что трансдукция сигнала через агадренорецепторы реализуется при участии фосфатидилинозитольного сигнального пути, а аг-адренорецепторов - за счет снижения концентрации внутриклеточного цАМФ (Elenkov et al., 2000). В связи с этим в данной работе проанализированы эффекты модуляторов вышеуказанных сигнальных путей. Установлено, что блокада метаболизма фосфатидилинозитола литием оксибутиратом в эксперименте in vitro не влияет на
показатели фагоцитарной активности нейтрофилов (табл. 2). По-видимому, активирующее влияние катехоламинов на фагоцитарную активность нейтрофилов реализуется преимущественно через снижение уровня цАМФ при участии а2-адренорецеп-торов.
Таблица 2
Влияние теофиллина (3 мМ), верапамила гидрохлорида (0,025 мг/мл), лития оксибутирата (1,5 мг/мл) in vitro на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов периферической кро-
ви крыс
Показатели Контроль (преинку- бациясо средой) Теофил- лин Вера- памила гидро- хлорид Литий оксибу- тират
Фагоцитарное число 1,00± 0,10 0,81± 0,07 1,21± 0,09 ‘ 0,93± 0,12
Фагоцитарный индекс 2,09± 0,08 1,84± 0,081 2,09+ 0,07 1,89± 0,1
Процент фагоцитоза 46,24+ 3,20 43,47+ 2,57 56,5± 2,54* 46,75± 3,61
Абс. число объектов 2705± 814 2161± 622т 3325± 875т 2769± 903
Абс. число фагоцитирующих нейтрофилов 1240± 304 1181± 274 1465± 298т 1317± 319
Известно, что необходимым условием осуществления фагоцитоза является реорганизация цитоскелета клетки при участии ионов кальция, выброс которых осуществляется также при взаимодействии объектов фагоцитоза с рецепторами фагоцита (Е1-ferink, deKoster, 2000; Stone et al., 2000). Увеличение уровня внутриклеточного кальция связано с его поступлением как извне, через "медленные", потенци-алнезависимые кальциевые каналы, так и из эндо-плазматического ретикулума. Установлено, что блокада "медленных", потенциалнезависимых кальциевых каналов при инкубации с верапамилом стимулирует фагоцитарную активность нейтрофилов (табл. 2). Этот эффект является несколько необычным, так как снижение уровня кальция, по данным большинства исследователей, должно приводить к угнетению функций фагоцитирующих клеток. Ранее было показано, что, хотя блокаторы кальциевых каналов снижают продукцию активных форм кислорода и провоспалительных цитокинов (Stone et al., 2000), повышение уровня кальция тапсигаргином (специфическим препаратом, высвобождающим его из внутриклеточных депо) приводит к угнетению хемотаксиса человеческих нейтрофилов, индуцированного интерлейкином-8 (Elferink et al., 2000). Блокаторы кальциевых каналов (верапамил, эконазол) действовали в этой тест-системе прямо противоположно, т. е. активировали хемотаксис. По данным литературы (Stone et al., 2000), блокада кальциевых каналов может приводить не только к снижению концентрации внутриклеточного кальция за счет торможения его поступления в клетку извне, но и,
184
Ю. И. Шилов, Е. Г. Орлова, Д. В. Ланин
напротив, к увеличению его уровня за счет высвобождения из эндоплазматической сети по механизмам обратных связей. К сожалению, в доступной литературе не удалось найгги данных о влиянии бло-каторов кальциевых каналов именно на фагоцитарную, в узком смысле термина, или поглотительную активность изучаемых клеток. Таким образом, выявленная стимуляция фагоцитарной активности ней-трофилов в условиях блокады кальциевых каналов может быть опосредована компенсаторным выбросом ионов кальция из внутриклеточных депо в ответ на взаимодействие клетки с объектом фагоцитоза.
Выводы
1. Установлено, что в системе in vitro (3-адре-нергический агонист тербуталина сульфат (10"6 М) угнетает фагоцитарную активность нейтрофилов. Сходные эффекты оказывает модулятор цАМФ-зависимых путей теофиллин (3 мМ).
2. Показано, что инкубация нейтрофилов с бло-катором кальциевых каналов верапамилом гидрохлоридом (0,025 мг/мл) стимулирует фагоцитарную активность нейтрофилов. Литий оксибутират (1,5 мг/мл) не оказывает влияния на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов.
Библиографический список
Абрамов В.В. Взаимодействие иммунной и нервной систем. Новосибирск: Наука, 1988.
Катин В.Н. Нетрадиционная иммунология инфекций.
Пермь: Изд-во Перм. гос. мед. академии, 1996. Корнева Е.А., Шхинек Э.К. Гормоны и иммунная система. Л.: Наука, 1988.
Крыжановский Г.Н., Магаева С.В., Макаров С.В.
Нейроиммунопатология. М., 1997.
Шилов Ю.И., Владыкина В.П., Атнагузина А.Т. Некоторые методические подходы к оценке показателей общего и дифференцированного фагоцитоза лейкоцитов периферической крови. Характеристика различий у здоровых людей // Перм. мед. журн. 1998. Т. 15, № 2. С. 3-6. Шилов Ю.И., Ланин Д. В. Влияние гидрокортизона на функции фагоцитирующих клеток брюшной полости крыс в условиях блокады р-адренорецепторов // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2001. Т. 131, № 10. С. 439-442.
Шилов Ю.И., Шилов Д. Ю. Влияние стимуляции бета-адренергических рецепторов in vitro тербута-лином сульфатом на фагоцитарную активность нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов крыс // Вестник Перм. ун-та. 2001. Вып. 4. С. 220-226.
Ширшев С.В., Кеворков Н.Н. Вторичные мессенджеры в реализации иммуномодулирующих эффектов хорионического гонадотропина // Молекулярная биология. 1993. Т. 27, вып. 3. С. 500-506.
Ярилин А.А. Чувствительность Т-лимфоцитов человека к теофиллину (биологическая и клиническая интерпретация) // Клеточные факторы регуляции иммуногенеза. Новосибирск, 1985. С. 24-39.
Аи В.Т., Teixeira М.М., Collins P.D., Williams T.J. Effect of PDE4 inhibitors on zymosan-induced IL-8 release from human neutrophils: synergism with prostanoids and salbutamol // Br. J. Pharmacol. 1998. Vol. 123, № 1-2. p. 1260-1266.
DelRey A., Kabiersch A., Petzoldt S., Besedovsky H. O. Involvement of noradrenergic nerves in the activation and clonal deletion of T cells stimulated by superantigen in vivo II J. Neuroimmunol. 2002. Vol. 127, № 1-2. P. 44-53.
Elenkov I.J., Wilder R.L., Chrousos G.P., Vizi E.S. The sympathetic nerve - an integrative interface between two supersystems: the brain and the immune system // Pharmacol. Rev. 2000. Vol. 52, № 4. P. 595-638.
ElferinkJ.G., deKostef B.M. Inhibition of interleukm-8-activated human neutrophil chemotaxis by thapsi-gargin in a calcium - and cyclic AMP-dependent way // Biochem. Pharmacol. 2000. Vol. 59, № 4. P. 369-375.
Sanders V.M., Straub R.H. Norepinephrine, the beta-adrenergic receptor, and immunity // Brain Behavior and Immunity. 2002. Vol. 16, № 4. P. 290-332.
Shilov Jul, Orlova E.G. Role of adrenergic mechanisms in regulation of phagocytic cell functions in acute stress response // Immunol. Lett. 2003. Vol. 86, № 3. P. 229-233.
Spengler R.N., Chensue S. W., Giacherio D.A., Blenk N.. Kunkel S.L. Endogenous norepinephrine regulates tumor necrosis factor-а production from macrophages in vitro II J. Immunol. 1994. Vol. 152, №6. P. 3024-3031.
Stone V., Tuinman M, Vamvakopoulos J.E., Shaw J., Brown D., Petterson S., Faux S.P., Borm P., Mac-Nee W., Michaelangeli F., Donaldson K. Increased calcium influx in a monocytic cell line on exposure to ultrafine carbon black // Europ. Resp. J. 2000. Vol. 15, №2. P. 297-303.
Effect of terbutaline hemisulfate and signal pathway modulators on phagocytic activity of neutrophils in vitro
Yu.I. Shilov, E.G. Orlova, D.V. Lanin
It has been established that terbutaline hemisulfate in vitro (10”6 M) decreases the phagocytic activity of the rat neutrophils. The effects of theophillin (3 mM) are similar. Preincubation with verapamil hydrochloride (0,025 mg/ml) stimulates the phagocytic activity of the rat neutrophils. Lithium oxybutyrate (1,5 mg/ml) has no influence on the neutrophil phagocytic activities.
