CC BY
36
А.Н. Трухин, Е.Н Сизова, В.И. Циркин, С.А. Дворянский ВЛИЯНИЕ СЫВОРОТКИ ПУПОВИННОЙ КРОВИ НА М-ХОЛИНОРЕАКТИВНОСТЬ
ИЗОЛИРОВАННОГО СЕРДЦА ЛЯГУШКИ
Вятский государственный гуманитарный университет Вятский социально-экономический институт Кировская государственная медицинская академия
Введение. В 90-ых годах было установлено, что эпителий дыхательных путей ряда животных продуцирует фактор, снижающий способность ацетилхолина активировать миоциты трахеи и бронхов [17]. Такой фактор, выделенный из слизистой дыхательных путей телят, имел олигопептидную природу [17]. Но еще раньше в опытах с изолированным сердцем лягушки было установлено [6], что 5-кратные разведения сыворотки крови лягушки, крысы и кролика препятствует проявлению отрицательного инотропного и хронотропного эффектов ацетилхолина, т.е. проявляют М-холиноблокирующее действие. В последующем было показано, что фактором, обладающим М-холинолитической активностью, вероятнее всего, является лизофосфатидилхолин [11], так как в экспериментах с изолированным сердцем лягушки это вещество в концентрациях 1-25мкМ оказывало такой же М-холиноблокирующий эффект, как и сыворотка крови. На другом объекте, в частности, на продольных полосках рога матки небеременных крыс в нашей лаборатории также было показано, что 50-, 100-и 500-кратные разведения сыворотки венозной крови мужчин и женщин [9,18,19], сыворотки пуповинной крови новорожденных, 10-и 50-кратные разведения ликвора мужчин и женщин, а также 5-, 10-, 50-кратные разведения мочи 7-8-летних детей [17,18] способны блокировать стимулирующее влияние ацетилхолина, т.е. проявляют М-холиноблокирующую активность. Кроме того, 100-кратные разведения сыворотки пуповинной крови блокировали стимулирующее влияние ацетилхолина в опытах с продольными полосками трахеи коровы и коронарной артерии свиньи [14,20]. Все эти факты объясняются [9,14,18,19,20] наличием в крови эндогенного блокатора М-холинорецепторов (ЭБМХР), основным компонентом которого, возможно, является лизофосфатидилхолин. Вопрос о влиянии сыворотки крови человека на М-холинореактивность сердечной мышцы до настоящего времени не изучался, хотя это представляет большой интерес, так как при гипертонической болезни, ишемической болезни сердца, инфаркте миокарда и сердечной недостаточности, которые являются на сегодня самыми распространенными заболеваниями человека [21], имеет место снижение эффективности холинергических воздействий на сердце [8], что, возможно, обусловлено чрезмерным содержанием в крови лизофосфатидилхолина [9]. Перспективность разработки этого вопроса демонстрируют результаты [9], свидетельствующие о том, что при инфаркте миокарда М-холиноблокирующая активность 100-, 500- и 1000-кратных разведений сыворотки крови увеличена (возможно, вследствие интенсивного образования ЛФХ при перекисном окислении), а на этапе реабилитации при использовании физических нагрузок параллельно с улучшением состояния больных эта активность снижается. Таким образом, это исследование впервые показало, что содержание ЭБМХР в крови у больных может существенно меняться и тем самым может меняться эффективность М-холинергических влияний на сердце. Вся сказанное послужило основной для постановки цели данной работы - изучить влияние 100-кратного разведения сыворотки пуповинной крови новорожденных на М-холинореактивность изолированного сердца лягушки при ее оценке с помощью трех концентраций ацетилхолина (10-7, 10-6 и 10-5г/мл).
МЕТОДИКА
Опыты проведены на изолированных сердцах 31 озерной лягушки (Rana ridibunda). Регистрацию их сократительной активности проводили по модифицированной методике Циркина В.И. и соавт. [18] на «Миоцитографе», состоящем из рабочей камеры (объемом в 1мл), механотрона типа 6МХ1С, предусилителя, самопишущего прибора типа Н-3020 и шприцевого дозатора. На изолированное сердце накладывали две лигатуры. Первую - в область венозного синуса (для подавления пейсмекерной активности); ее присоединяли к специальному держателю, на котором сердце укреплялось в рабочей камере. Вторую - на верхушку сердца; ее присоединяли к механотрону, фиксированному на микроманипуляторе, с помощью которого создавали исходное натяжение сердца, равное 4,9мН (500 мг). Во всех опытах сокращения сердца вызывали стимулами от электростимулятора типа ЭСЛ-1 (для этого один из электродов укрепляли на держателе, второй - погружали в рабочую камеру). Их наносили периодически в виде двух 30-секундных пачек (1-я и 2-я электростимуляции; в каждой - частота генерации импульсов - 1Гц, их длительность - 5мс, а амплитуда - 5-10В, интервал между пачками - 4-5 минут). Сердце перфузировали при 16-22оС со скоростью 0,7мл/мин раствором Рингера для холоднокровных (pH=7,4), содержащим (в мМ): NaCl - 114,4; KCl - 1,6; CaCl2-1,8; NaHCO3 - 2,4. После врабатывания препарата, т.е. через 15-20 мин от начала перфузии, на фоне полного отсутствия спонтанных сокращений исследовали характер вызванной сократительной активности при различных условиях, в том числе при воздействии ацетилхолина в концентрации 10-7 (серия 1), 10-6 (серия 2) и 10-5г/мл (серия 3) до, во время и после воздействия 100-кратного разведения сыворотки пуповинной крови. При этом использовали следующую схему опытов (рис.1): раствор Рингера ^ ацетилхолин (в одной из исследуемых концентраций) ^ раствор Рингера ^ сыворотка (1:100) ^ сыворотка + ацетилхолин ^ раствор Рингера ^ ацетилхолин (наличие двух электростимуляций на каждом из семи 10-минутных этапов опытов позволяло оценить динамику сократимости на протяжении каждого этапа). По механограммам рассчитывали абсолютные (в мН) и относительные (в %) значения амплитуды минимального (т.е. 1-го вызванного) и максимального сокращения, а также длительность
(с, %) достижения максимальной амплитуды, т.е. период между минимальным и максимальным сокращениями.
Сыворотку получали путем 15-минутного центрифугирования (2000 об/мин) пуповинной крови; ее разводили раствором Рингера. Кровь исследовали спустя 2-24 часа от момента ее забора. По большинству из клинических показателей серии 1, 2 и 3 не отличались между собой. При этом все женщины имели осложненное течение беременности и родов. Результаты исследования подвергнуты статистической обработке. Достоверность различия оценивали по критерию Стьюдента и по критерию Уилкоксона, считая их достоверными при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
На 1-м этапе экспериментов, т.е. в условиях перфузии сердца раствором Рингера во всех трех сериях опытов показано (табл., рис.1), что при 1-й и 2-й электростимуляции на каждый стимул возникало сокращение. При этом амплитуда первого из 30 сокращений всегда была минимальной. В серии 1 при 1-й и 2-й электростимуляции она составила соответственно 4,94мН и 4,77мН, в серии 2 - 5,49мН и 5,24мН, а в серии 3 -2,35мН и 3,82мН (для 1-й электростимуляции Рз_1,2,<0,05). Амплитуда последующих сокращений возрастала и достигала максимальных значений (в сериях 1, 2 и 3 при 1-й электростимуляции соответственно через 14с, 15с и 13с от начала стимуляции, а при 2-й электростимуляции - соответственно через 11с, 12с и 9с), которые в серии 1 при 1-й и 2-й электростимуляциях составили соответственно 12,70мН и 13,14мН, в серии 2 - 13,82мН и 14,16мН, а в серии 3 - 10,14мН и 12,05мН. Таким образом, судя по минимальной и максимальной амплитуде сокращений при 1-й и 2-й электростимуляциях, в серии 3 исходная сократимость миокарда была ниже, чем в серии 1 и 2. В то же время в каждой серии различия между соответствующими показателями, регистрируемые при 1-й и 2-й электростимуляции, носили недостоверный характер (р>0,5), что свидетельствует о стабильности сократимости сердечной мышцы на 10-минутном отрезке эксперимента, т.е. при перфузии раствором Рингера.
На 2-м этапе экспериментов, т.е. при 1-м тестировании ацетилхолином (10-7, 10-6 и 10-5г/мл) наблюдалось дозозависимое снижение амплитуды сокращений сердца. Так, в серии 1 минимальная и максимальная амплитуды сокращений при 1-й электростимуляции составили соответственно 65,6%* и 90,1% от исходного уровня (здесь и ниже * означает достоверное различие по сравнению с 1-м этапом эксперимента, р<0,05), в серии 2 - соответственно 52,7%* и 71,2%*, а в серии 3 - 45,2%* и 51,8%*. Во всех сериях различия между соответствующими показателями, регистрируемыми при 1-й и 2-й электростимуляции, были недостоверны (р>0,1), что указывает на устойчивость отрицательного инотропного эффекта ацетилхолина при его 10-минутном воздействии на сердце. Данные индивидуального анализа результатов исследования подтверждают зависимость эффекта ацетилхолина от его концентрации в среде: судя по изменению минимальной и максимальной амплитуды при 1-й электростимуляции в серии 1 ацетилхолин (10-7г/мл) снижал амплитуду сокращений соответственно в 81,8% и 63,6% опытов, не изменял ее в 18,2% и 9,1% опытов и повышал ее в 0,0% и 27,3% опытов, в серии 2 ацетилхолин (10-6г/мл) снижал амплитуду сокращений в 90,0% и 90,0% опытов, не изменял ее в 0,0% и 0,0% опытов и повышал соответственно в 10,0% и 10,0% опытов, а в серии 3 ацетилхолин (10-5г/мл) снижал амплитуду сокращений в 100,0% опытов.
На 3-м этапе экспериментов, т.е. после удаления ацетилхолина во всех сериях отмечено быстрое и относительно полное восстановление исходной сократимости. Действительно, в серии 1 минимальная и максимальная амплитуды при 1-ой электростимуляции составили соответственно 81,9,0% и 93,3% от 1-го этапа, в серии 2 - 76,3%* и 86,8%*, а в серии 3 - 93,2% и 99,5,%. При этом различия между соответствующими показателями, регистрируемыми при 1-й и 2-й электростимуляции, во всех трех сериях носили недостоверный характер (р>0,1), что указывает на быстрое восстановление исходной сократимости после удаления ацетилхолина.
На 4-м этапе экспериментов, т.е. при воздействии на сердце 100-кратного разведения сыворотки крови в сериях 1 и 2 оно не влияло на сократимость сердца, а в серии 3 (при использовании ацетилхолина в концентрации 10-5г/мл) - наблюдалось некоторое повышение амплитуды сокращения, которое, однако, мы расцениваем как отражение процесса восстановления сократимости после удаления ацетилхолина. Действительно, в серии 1 минимальная и максимальная амплитуды при 1-й электростимуляции достигали 119,9% и 102,5% от фонового уровня, т.е. от 3-го этапа эксперимента, в серии 2 - 115,9% и 111,1%, а в серии 3 -118,6% и 144,2%**. При этом различия между соответствующими показателями, регистрируемые при 1-й и 2-й электростимуляции во всех сериях носили недостоверный характер. Результаты индивидуального анализа подтверждают вывод о том, что лишь в серии 3 имеет место повышение сократимости сердца в период воздействия 100-кратного разведения сыворотки, что, скорее всего, обусловлено восстановлением исходной сократимости после удаления высокой концентрации ацетилхолина. Так, судя по изменению минимальной и максимальной амплитуды при 1-й электростимуляции, 100-кратное разведение в серии 1 повышало амплитуду сокращений сердца соответственно в 45,5% и 45,5% опытов, не изменяла ее - в 27,3% и 36,4% опытов и уменьшала ее - в 27,3% и 18,2% опытов; в серии 2 оно повышало амплитуду сокращений соответственно в 30,0% и 40,0% опытов, не изменяло ее в 20,0% и 50,0% опытов и снижало ее в 50,0% и 10,0% опытов, а в серии 3 оно повышало амплитуду сокращений соответственно в 40,0% и 70,0% опытов; в остальных случаях оно либо не влияло на нее в 20,0% и 20,0% опытов, либо снижало в 40,0% и 10,0% опытов. В целом результаты всех трех серий опытов позволяют заключить, что, скорее всего, 100-кратное разведение не влияет на силу сердечных сокращений. Если бы 100-кратное разведение, действительно, обладало способностью изменять сократимость миокарда, то такая способность должна была бы проявиться во всех сериях экспериментов, что противоречит нашим данным. Кроме того, результаты опытов с адреналином [16] также подтверждает вывод о том, что 100-кратное разведение сыворотки пуповинной крови не оказывает существенного влияния на сократимость
миокарда лягушки.
На 5-м этапе экспериментов, т.е. при воздействии ацетилхолина на фоне 100-кратного разведения сыворотки крови (2-е тестирование адреналином) выявлено, что это разведение во всех случаях, особенно при использовании высоких (10-5г/мл) концентраций ацетилхолина снижает способность ацетилхолина оказывать отрицательный инотропный эффект, Так, в серии 1 при 1-й электростимуляции минимальная и максимальная амплитуды сокращений достигали соответственно 96,1% и 99,9% от фонового уровня, т.е. от 3-го этапа, в серии 2 - 129,8%а и 90,5%а&, а в серии 3 - 130,0%**а и 105,8%**&а (а, **, & - означает, что различия с соответственно со
2-м, 3-м и 4-м этапами эксперимента носят достоверный характер, р<0,05). При этом различия между соответствующими показателями, регистрируемыми при 1-й и 2-й электростимуляции, во всех сериях носили недостоверный характер (р>0,1), что указывает на стабильность сократимости миокарда во время воздействия ацетилхолина.
Индивидуальный анализ результатов исследования подтверждает вывод о том, что 100-кратное разведение сыворотки пуповинной крови снижает способность ацетилхолина оказывать отрицательный инотропный эффект. Так, судя по изменению минимальной и максимальной амплитуды при 1-й электростимуляции, в серии 1 ацетилхолин на фоне 100-кратного разведения уменьшал амплитуду сокращения соответственно в 45,5% и 45,5% опытов (т.е. реже, чем при 1-м тестировании, p>0,05), не изменял ее соответственно в 18,2% и 9,1% опытов и повышал ее в 36,4%а и 45,5% опытов; в серии 2 он снижал амплитуду сокращений сердца в 60,0% и 70,0% опытов (а - достоверно реже, чем при 1-м тестировании, р<0,05), не изменял ее соответственно в 10,0% и 10,0% опытов и повышал ее в 30,0% и 20,0% опытов, а в серии 3 ацетилхолин уменьшал амплитуду сокращений в 10,0%а и 10,0%а опытов (т.е. достоверно реже, чем при 1-м тестировании, р<0,05), в остальных случаях он либо не изменял ее в 20,0% и 20,0% опытов или даже повышал ее в 70,0%а и 70,0%а опытов. Другой вариант индивидуального анализа результатов исследования также подтверждает вывод о том, что 100-кратное разведение сыворотки крови препятствует проявлению отрицательного инотропного эффекта ацетилхолина. Так, судя по изменению минимальной и максимальной амплитуды сокращений при 1-й электростимуляции, в серии 1 100-кратное разведение уменьшало отрицательный инотропный эффект ацетилхолина, т.е. проявляло М-холиноблокирующую активность соответственно в 72,7% и 54,5% опытов; в 0,0% и 9,1% опытов оно не изменяло его, а в 27,3% и 36,4% опытов повышало его, т.е. проявляло М-холиносенсибилизирующую активность. В серии 2 М-холиноблокирующий эффект отмечен соответственно в 90,0% и 80,0% опытов, отсутствие влияния - в 0,0% и 10,0% опытов, а М-холиносенсибилизирующий эффект - в 10,% и 10,0% опытов. В серии 3 оно оказывало М-холиноблокирующий эффект в 100,0% опытов.
В целом результаты 5-го этапа исследования, независимо от способа их анализа, убедительно демонстрируют способность 100-кратного разведения сыворотки пуповинной крови (за счет наличия в нем ЭБМХР) оказывать М-холиноблокирующий эффект, что особенно проявляется при использовании ацетилхолина в средних (10-6г/мл) и высоких (10-5г/мл) концентрациях. При этом М-холиноблокирующий эффект может проявляться не только в снижении вероятности проявления отрицательного инотропного эффекта ацетилхолина, но и в снижении выраженности этого эффекта ацетилхолина. Кроме того, эти результаты показывают, что 100-кратное разведение сыворотки крови в отдельных случаях может оказывать и М-холиносенсибилизирующее влияние, которое преимущественно проявляется при использовании ацетилхолина в низких (10-7г/мл) концентрациях и объясняется, вероятно, наличием в крови ЭСМХР.
На 6-м этапе экспериментов, т.е. после удаления 100-кратного разведения сыворотки крови и ацетилхолина, сократимость миокарда не претерпевает существенных изменений, за исключением серии 3, в которой наблюдается некоторое ее повышение, которое можно рассматривать как следствие удаления высоких концентраций ацетилхолина. Так, на фоне перфузии раствора Рингера при 1-й электростимуляции минимальная и максимальная амплитуда в серии 1 достигала соответственно 105,7% и 118,5% от фонового значения, т.е. от
3-го этапа, в серии 2 - соответственно 114,7% и 111,4%; в серии 3 - соответственно 133,9%** и 129,6%**. Различия между соответствующими показателями, регистрируемыми при 1-й и 2-й электростимуляции во всех трех сериях носили недостоверный характер (р>0,1), что свидетельствует о стабильности сократимости на этом этапе эксперимента.
На 7-м этапе экспериментов показано, что при 3-м тестировании ацетилхолин (10-7, 10-6, 10-5г/мл) проявляет такое же действие, как и при 1-м тестировании, т.е. дозозависимо снижает амплитуду сокращений сердца. Так, минимальная и амплитуда сокращений при 1-й электростимуляции в серии 1 составила соответственно 75,6%*** и 79,2%*** от фонового уровня, т.е. от 6-го этапа, т.е. амплитуда сокращений была достоверно ниже, чем на 6-м (***) этапах эксперимента, при этом различия с 2-м этапом эксперимента, т.е. с 1-м тестированием носили недостоверный характер. В серии 2 эти показатели составили 64,3%*** и 69,6%***(:, т.е. ингибирующий эффект ацетилхолина был таким же, как при 1-м тестировании, но достоверно (с) больше, чем при 2-м тестировании, в серии 3 эти показатели составили 59,9%***с и 53,3%***(:, т.е. ацетилхолин оказывал такой же отрицательный инотропный эффект, как при 1-м тестировании, но достоверно (°) больше, чем при 2-м тестировании. Следовательно, ацетилхолин в концентрациях 10-6 и 10-5г/мл после удаления 100-кратного разведения сыворотки вновь оказывал выраженный отрицательный инотропный эффект, что указывает на быструю обратимость М-холиноблокирующего действия 100-кратного разведения сыворотки крови. Различия между соответствующими показателями, регистрируемые при 1-й и 2-й электростимуляции, во всех трех сериях носили недостоверный характер (р>0,1), что указывает на быструю обратимость эффектов
ацетилхолина.
Данные индивидуального анализа подтверждают этот вывод. Так, судя по изменению минимальной и максимальной амплитуды при 1-й электростимуляции, в серии 1 ацетилхолин (10-7г/мл) снижал амплитуду сокращений соответственно в 63,6% и 81,8% опытов (т.е. не реже, чем при 1-м тестировании), не изменял ее в 27,3% и 0,0% опытов и повышал ее в 9,1%, и 18,2% опытов. В серии 2 ацетилхолин (10-6г/мл) снижал амплитуду в 80,0% и 100,0% опытов, т.е. чаще, чем при 2-м тестировании, в остальных случаях он повышал ее в 20,0% и 0,0% опытов. В серии 3 ацетилхолин (10-5г/мл) уменьшал амплитуду сокращений в 70,0%с и 100,0%с опытов (т.е. с такой же частотой как при 1-м тестировании, но достоверно чаще, чем при 2-м тестировании; с), а в остальных случаях он не изменял амплитуду сокращений в 30,0% и 0,0% опытов. Таким образом, удаление 100-кратного разведения сыворотки пуповинной крови привело к тому, что ацетилхолин, особенно при его использовании в средних (10-6г/мл) и высоких (10-5г/мл) концентрациях вновь, как и при 1-м тестировании, оказывал отрицательный инотропный эффект.
Анализ частоты наблюдения М-холиномодулирующих эффектов 100-кратного разведения сыворотки крови, сохраняющихся после его удаления, показал, что, судя по изменению минимальной и максимальной амплитуды при 1-й электростимуляции, в серии 1 М-холиноблокирующий эффект сохранился соответственно в 27,3%а и 18,2% опытов (т.е. реже, чем при непосредственном воздействии), отсутствие влияния отмечено в 45,5%а и 45,5%а опытов, а М-холиносенсибилизирующий эффект соответственно в 27,3% и 36,4% опытов (т.е. так же часто, как при непосредственном воздействии сыворотки крови). В серии 2 М-холиноблокирующий эффект отмечен лишь в 20,0%а и 0,0%а опытов, т.е. достоверно реже (а), чем при непосредственном воздействии; отсутствие какого-либо влияния сыворотки на эффекты ацетилхолина отмечено соответственно в 60,0%а 80,0%а опытов (т.е. достоверно чаще, чем при 2-м тестировании), а М-холиносенсибилизирующий эффект - в 20,0% и 20,0% опытов (т.е. также редко, как и при 2-м тестировании). В серии 3 М-холиноблокирующий эффект отмечен лишь в 30,0%а - 0,0%а опытов, т.е. намного реже, чем при непосредственном воздействии (а); М-холиномодулирующая активность отсутствовала в 30,0%, и 100,0%а опытов (т.е. достоверно чаще, чем при 2-м тестировании); а М-холиносенсибилизирующая активность в 40,0%а и 0,0% опытов, т.е. несколько чаще, чем при 2-м тестировании. В целом, оба вида индивидуального анализа свидетельствуют о том, что после удаления 100-кратного разведения сыворотки крови М-холиноблокирующий эффект исчезает достаточно быстро, в то время как М-холиносенсибилизирующий эффект сохраняется сравнительно долго.
Анализ кривых «доза-эффект» (рис.2), построенных для четырех показателей (минимальная и максимальная амплитуды сокращений при 1-й и 2-й электростимуляции, в %) при трех воздействиях ацетилхолина, т.е. до, на фоне и после воздействия 100-кратного разведения сыворотки пуповинной крови, показывает, что это разведение существенно изменяет характер кривой «доза-эффект» (сдвигает ее вниз и вправо), так как на фоне 100-кратно разведенной сыворотки крови способность ацетилхолина проявлять отрицательный инотропный эффект полностью блокируется, что особенно заметно при исследовании ацетилхолина в концентрациях 10-6 и 10-5г/мл. Действительно, если при 1-м тестировании, т.е. до воздействия сыворотки все 4 показателя дозозависимо снижались под влиянием ацетилхолина (константа диссоциации для ацетилхолина варьировала от 39,81нг/мл до 549,54нг/мл, а в среднем она оставила 295,25нг/мл), то на фоне сыворотки при воздействии ацетилхолина ни один из этих показателей не снижался, а наоборот, даже возрастал. В этих условиях константа диссоциации ацетилхолина значительно возрастала до значений, превышающих 1000 нг/мл), что указывает на существенное (почти 5-кратное) снижение сродства рецепторов к ацетилхолину. При 3-м тестировании, т.е. после удаления сыворотки крови все 4 показателя дозозависимо снижались под влиянием ацетилхолина; при этом константа диссоциации для ацетилхолина варьировала от 199,53нг/мл до 1000нг/мл (в среднем она составила 535,30нг/мл). Эти данные указывают на то, что после воздействия сыворотки чувствительность к ацетилхолину достаточно быстро восстанавливается почти до исходного уровня. Таким образом, можно утверждать, что 100-кратное разведение сыворотки пуповинной крови за счет наличия в ней эндогенного блокатора М-холинорецептора почти в 5 раз снижает сродство М-холинорецепторов миокарда к ацетилхолину и одновременно уменьшает эффективность М-холинерегического воздействия на сердце, т. е. обратимо снижает М-холинореактивность изолированного сердца лягушки.
Наиболее ярко М-холиноблокирующий эффект 100-кратного разведения проявляется при исследовании ацетилхолина, используемого в концентрации 10-5г/мл (в сравнении с ацетилхолином, используемом в концентрации 10-6г/мл и, особенно, 10-7г/мл). В частности, нами установлено, что процент опытов, в которых 100-кратное разведение СПК оказывает М-холиноблокирующее действие, зависит от концентрации ацетилхолина: с повышением концентрации ацетилхолина процент таких опытов возрастает. Так, судя по минимальной и максимальной амплитуде при 1-й электростимуляции, при действии ацетилхолина в концентрациях 10-7, 10-6 и 10-5г/мл число таких опытов составляет соответственно 72,7%, 90,0% и 100,0% опытов и 54,5%, 80,0% и 100,0% опытов. В то же время процент опытов, в которых 100-кратное разведение СПК вызывает М-холиносенсибилизирующий эффект, наоборот, снижается с увеличением концентрации ацетилхолина: так, судя по минимальной и максимальной амплитуде при 1-й электростимуляции их число составляет соответственно 27,3%, 10,0% и 0,0% опытов и 36,4%, 10,0% и 0,0% опытов. Еще раз отметим, что М-холиноблокирующие эффекты при удалении 100-кратного разведения сыворотки исчезают значительно быстрее, чем М-холиносенсибилизирующие. В целом, представленные данные указывают на то, что в крови есть ЭБМХР и ЭСМХР. С повышением концентрации ацетилхолина вероятность выявления ЭБМХР возрастает,
а вероятность выявления ЭСМХР снижается. С методической точки зрения это означает, что для выявления ЭБМХР и ЭСМХР необходимо использовать оптимальные концентрации ацетилхолина. Очевидно, что применение ацетилхолина в низких концентрациях предпочтительнее при идентификации ЭСМХР, а использование его в высоких концентрациях - при выявлении ЭБМХР. Вероятно, что «средние» концентрации (например, 10-6г/мл) ацетилхолина позволяют одновременно идентифицировать и ЭБМХР и ЭСМХР.
Влияние ацетилхолина и 100-кратного разведения сыворотки крови на проявление хроно-инотропных отношений. Для каждого из 7 этапов каждой серии была проведена оценка времени достижения максимальной амплитуды. Этот показатель, как известно [5,7,23], косвенно отражает хроно-инотропные взаимоотношения, в основе которых лежит скорость накопления свободных ионов Са2+ в межфибриллярном пространстве. Установлено, что ацетилхолин, снижая амплитуду сокращений сердца (это особенно выражено при использовании его в концентрациях 10-6 и 10-7г/мл), не вызывал достоверного снижения времени достижения максимальной амплитуды. Это указывает на то, что ацетилхолин уменьшает хроно-инотропные отношения (наиболее заметно - при использовании его в средних и высоких концентрациях). 100-кратное разведение сыворотки крови, судя по результатам серии 1 и 2, не изменяло амплитуду сокращений сердца и не влияло на время достижения максимального сокращения, т. е. не влияло на хроно-инотропные взаимоотношения. В то же время, обратимо блокируя отрицательный инотропный эффект ацетилхолина (за счет наличия ЭБМХР), это разведение одновременно обратимо уменьшало способность ацетилхолина снижать хроно-инотропные отношения, но при условии, что он использовался в низких (10-7г/мл) или средних (10-6г/мл) концентрациях; высокие (10-5г/мл) концентрации ацетилхолина способны уменьшить хроно-инотропные отношения и на фоне 100-кратного разведения сыворотки крови.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Результаты наших исследований подтверждают данные литературы [5,7] о наличие у сердца лягушки лестницы Боудича, т.е. хроно-инотропных взаимоотношений, что проявляется в постепенном росте (до определенной величины) амплитуды вызванных электростимулами сокращений изолированного сердца, утратившего способность к автоматии.
Подтверждены также данные литературы [5,7,10] о способности ацетилхолина уменьшать силу сердечных сокращений, что принято объяснять его взаимодействием с М2-холинорецепторам [13], в результате которого с участием 01-белка, аденилатциклазы, гуанилатциклазы, цАМФ, цГМФ, КЮ-синтазы и других внутриклеточных посредников происходят изменения, приводящие к снижению концентрации свободных ионов Са2+ в межфибриллярном пространстве [13,15]. В литературе отмечено, что эффективность хроно-инотроных взаимоотношений может возрастать под влиянием катехоламинов [5,7,23], что принято объяснять повышением скорости накопления свободных ионов Са2+ внутри кардиомиоцита, возникающее вследствие повышения входящего тока ионов Са2+ и/или повышения скорости высвобождения ионов Са2+ из внутриклеточных депо [23]. Нами установлено, что отрицательный инотропный эффект ацетилхолина не сопровождался достоверным изменением времени достижения максимальной амплитуды. Это позволяет утверждать, что ацетилхолин снижает эффективность хроно-инотроных взаимоотношений.
Ранее в опытах с миометрием крысы было показано [12], что 100-кратное разведение сыворотки пуповинной крови женщин с неосложненным течением беременности и родов повышает (в 81,5% опытов) его сократительную активность, и это объяснялось наличием в крови эндогенного утеростимулятора, или эндогенного активатора сократимости миоцитов (ЭАСМ); при осложненном течение беременности или родов вероятность наблюдения этого эффекта снижена. Результаты серии 1 и 2 наших опытов, в которых изучалось влияние на миокард ацетилхолина, как и подобные серии экспериментов с адреналином [16], впервые показали, что 100-кратное разведение сыворотки крови, независимо от состояния матери или ребенка, не влияет на амплитуду сокращений изолированного сердца. Это означает, что эндогенный активатор сократимости миоцитов при его концентрации в 100-кратном разведении сыворотки пуповинной крови не влияет на сократимость миокарда лягушки.
Ранее в опытах с изолированным сердцем лягушки было показано [6,11], что невысокие (1:5) разведения сыворотки крови лягушки, крысы и кролика препятствуют проявлению отрицательного инотропного эффекта ацетилхолина, т.е. проявляют М-холиноблокирующее действие. Подобный эффект оказывает лизофосфатидилхолин [11]. В нашей лаборатории было установлено, что 50-, 100-, 500-кратные разведения сыворотки венозной крови мужчин и женщин за счет наличия в ней ЭБМХР снижают М-холинореактивность гладких мышц матки крысы [9,16,18,19], трахеи коровы и коронарной артерии свиньи [14,20]. В опытах с миометрием крысы было также показано [12], что 100-кратное разведение сыворотки пуповинной крови новорожденных, как правило, оказывает М-холиноблокирующее действие, а в отдельных опытах - и М-холиносенсибилизирующее действие, что объясняется наличием в крови соответственно ЭБМХР и ЭСМХР. Нами в опытах с изолированным сердцем лягушки впервые установлено, что 100-кратное разведение сыворотки пуповинной крови человека препятствует проявлению отрицательного инотропного эффекта ацетилхолина (10-7, 10-6, 10-5г/мл), сдвигая кривую «доза-эффект» вправо и вниз. При этом константа диссоциации или Кд для ацетилхолина возрастала с 295,25нг/мл до значений, превышающих 1000нг/мл, что указывает на почти 5-кратное снижение сродства М-холинорецепторов к ацетилхолину, а также на уменьшение выраженности М-холинергического воздействия на миокард. Все это объясняется наличием в крови ЭБМХР. При этом мы не исключаем, что ЭБМХР может также препятствовать проявлению других (хроно-, батмо- и дромотропного)
отрицательных эффектов ацетилхолина. В целом данные литературы и результаты наших исследований позволяют заключить, что содержащийся в крови человека и животных эндогенный блокатор М-холинорецепторов (ЭБМХР), представляет собой универсальный фактор, снижающий М-холинореактивность не только гладких мышц матки, сосудов, трахеи, но и сердечной мышцы.
Можно предположить, что в условиях целостного организма ЭБМХР снижет эффективность М-холинергических влияний на деятельность всех структур, которые содержат М-холинорецепторы (сердце, гладкие мышцы дыхательных путей, матки, сосуды половых органов, сосуды ротовой полости, миоциты и гландулоциты пищеварительного тракта, и пр). Это означает, что эффективность М-холинергических влияний на деятельность различных органов в условиях целостного организма зависит не только от интенсивности парасимпатических воздействий на сердце, но и от содержания в крови ЭБМХР.
Природа ЭБМХР до настоящего времени не установлена. С одной стороны, известно, что фосфорилирование М-холинорецепторов может препятствовать передачи сигнала «вниз по течению», т.е. от рецепторов к внутриклеточным эффекторам [15]. С другой стороны, имеются сведения о том, что отдельные вещества способны снижать М-холинореактивность различных клеток. Это - гуаниновые нуклеотиды [5,13], №этилмалеимид [13], катионы натрия и аммония [13], нейропептид У [29], перекись водорода, пентапептид мозга гиберенирующих сусликов [10], олигопептиды слизистой дыхательных путей телят [17], дипептид пролин-глицин [2], Ь-глутамин и Ь-аргинин [26], а также лизофосфатидилхолин [11]. По нашему мнению, основным компонентом ЭБМХР является лизофосфатидилхолин (ЛФХ). Действительно, из данных литературы известно [11], что ЛФХ или - 1-ацил^п-глицеро-3-фосфохолин образуется в результате метаболизма основного компонента фосфолипидов всех клеток организма человека и животных - фосфатидилхолина, который накапливается в организме при окислении липопротеинов низкой плотности. В образовании ЛФХ участвуют два фермента - фосфолипаза А2 и лецитин-холестерин-ацилтрансфераза (ключевой фермент метаболизма липопротеинов в плазме крови человека и животных, с участием которого происходит перенос жирнокислотного остатка от фосфатидилхолина на холестерин). В плазме крови человека и животных ЛФХ находится в связанном (альбумином и другими белками) и свободном состоянии [11]. Концентрация свободного ЛФХ, достигающая у здорового человека 20-80мкМ [11], возрастает при гиперлипидемии и атеросклерозе [10], инфаркте миокарда и в целом при стрессе и при активации перекисного окисления липидов [1]. При ишемической болезни сердца и инфаркте миокарда в тканях миокарда также повышается содержание ЛФХ [24]. Установлено, что ЛФХ в концентрациях 1-10 мкМ и ниже (этому соответствует 50-, 100- и даже 500-кратное разведение сыворотки крови) может оказывать различные эффекты: активирует перекисное окисление липидов [30], снижает способность фактора активации тромбоцитов, АДФ и тромбина повышать агрегационные свойства тромбоцитов [11], уменьшает (угнетая транспорт Ь-аргинина) продукцию N0 в эндотелиоцитах [27], блокирует эндотелийзависимое расслабление артерий, вызываемое тромбином, серотонином, ацетилхолин [22], непосредственно вызывает вазоконстрикцию [32], что способствует нарушению регуляции тонуса сосудов при атеросклерозе [11], а также оказывает прямое и опосредованное влияние на кардиомиоциты. В частности, он снижает их М-холинореактивность [11], повышает проницаемость для ионов [31] и Са2+ [25], усиливает освобождение Са из внутриклеточных депо и тем самым повышает уровень свободных ионов Са2+ в межфибриллярном пространстве [11,25], повышает интенсивность натрий-кальциевого [25] и натрий-водородного [25] обменных механизмов, но уменьшает работу натрий-калиевого насоса [25]; все это может приводить к повышению силы и частоты сердечных сокращений [11], а также к развитию аритмии [11,24]. Кроме того, ЛФХ вызывает механические, ультраструктурные и биохимические повреждения миокардиоцитов [25], оказывает ишемическоподобный эффект [4,24], активирует фосфолипазу А2 миокарда и тем самым способствует дополнительному образованию ЛФХ в миокардиоцитах [24]. Считается, что все свои эффекты ЛФХ, в том числе М-холиноблокирующий, реализует за счет модуляции вторичных клеточных посредников, в том числе 01-белков [33] и протеинкиназы С [11,25,30,32]. Не исключается также, что М-холиноблокирующий эффект ЛФХ обусловлен изменением состояния М-холинорецепторов на поверхностной мембране, в том числе за счет их агрегации, в результате чего снижается сродство этих рецепторов к агонистам [11]. По мнению Мальчиковой С.В. и соавт. [9], рост содержания ЛФХ в крови может быть одной из причин уменьшения М-холинореактивности сердца у человека, что снижает эффективность М-холинергического воздействия на сердце. Это представление согласуется с данными литературы [3] о том, что при ишемической болезни сердца и особенно при остром инфаркте миокарда существенно меняется характер вариабельности сердечного ритма, в частности, снижается мощность быстрых (НР-) волн, что свидетельствует о снижении эффективности влияния вагуса на сердце. По данным Мальчиковой С.В. и соавт. [8], при регулярных физических тренировках у больных, перенесших острый инфаркт миокарда, наряду с повышением функциональных возможностей организма достоверно снижается М-холиноблокирующая активность сыворотки крови, что объясняется снижением уровня ЛФХ в крови в условиях физической реабилитации. Это наблюдение согласуется с данными литературы [3], согласно которым систематические физические тренировки повышают у здоровых людей вариабельность сердечного ритма, т.е. эффективность вагусных влияний на сердце, в частности при этом увеличивается мощность быстрых (ИР-) волн и уменьшается мощность медленных (ЬР-) волн. В целом становится очевидным целесообразность определения в клинических условиях содержания в крови ЭБМХР и ЛФХ как наиболее вероятного его компонента. В частности, высокий уровень в крови ЭБМХР и ЛФХ может свидетельствовать о снижении эффективности М-холинергического влияния на сердце и служить поводом для назначения веществ, снижающих их содержание в крови (факторы, понижающие ПОЛ). В целом представленные данные указывают на важную физиологическую роль ЭБМХР в
организме человека и животных и о необходимости дальнейшего исследования этого вопроса.
Исследуя влияние сыворотки пуповинной крови на М-холинореактивность миометрия крысы, [12] предположила, что пуповинная кровь человека помимо ЭБМХР содержит также эндогенный сенсибилизатор М-холинорецепторов (ЭСМХР). В последующем в экспериментах с миометрием крысы были получены прямые доказательства наличия такого фактора в пуповинной крови плода и в венозной крови небеременных женщин (Сизова Е.Н. и соавт., 2003- в печати). Наши эксперименты со 100-кратным разведением сыворотки пуповинной крови в определенной степени подтверждают наличие ЭСМХР в крови и доказывают его способность повышать М-холинореактивность изолированного сердца лягушки. Закономерно встает вопрос о возможной природе этого фактора. В литературе отмечено, что эстрогены способны повышать М-холинореактивность у нейронов мозга и гладких мышц сосудов [13], затебрадин (как специфический блокатор тока, активируемого гиперполяризацией), в присутствии эзерина - у кардиомиоцитов кролика [28], а глицин и дипептид глицин-пролин - у кардиомиоцитов лягушки [2]. Дальнейшие исследования, вероятно, позволят более точно установить природу ЭСМХР.
В целом представленные в работе данные указывают на наличие в организме человека и животных эндогенных модуляторов М-холинореактивности прямого действия, в том числе ЭБМХР и ЭСМХР, которые, вероятно, играют важную роль в процессах регуляции деятельности внутренних органов, в том числе сердца. Все это указывает на перспективность дальнейшего изучения вопроса о природе, механизме действия и роли этих важных компонентов системы регуляции хемореактивности органов и тканей.
В методическом отношении результаты наших исследований позволяют заключить, что изолированное сердце лягушки можно применять для оценки относительного содержания эндогенных модуляторов М-холинореактивности, в частности, ЭБМХР и ЭСМХР. При этом наиболее целесообразно ацетилхолин использовать в средних концентрациях, т.е. 10-6 г/мл.
ВЫВОДЫ
1. Ацетилхолин в концентрациях 10-7, 10-6 и 10-5г/мл дозозависимо снижает сократимость миокарда лягушки, не изменяя при этом время достижения максимальной амплитуды сокращений, вызываемых повторными электростимулами, т.е. проявляет отрицательный инотропный эффект и одновременно снижает хроно-инотропные взаимоотношения.
2. 100-кратное разведение сыворотки пуповинной крови не влияет на амплитуду сокращений сердца лягушки и его хроно-интропные взаимоотношения, но (за счет наличия в ней эндогенного блокатора М-холинорецепторов, основным компонентом которого, возможно, является лизофосфатидилхолин) снижает М-холинореактивность миокарда, т.е. проявляет М-холиноблокирующую активность. В частности, оно сдвигает кривую «доза-эффект» вправо и вниз, повышая при этом Кд для ацетилхолина почти в 5 раз (т.е. уменьшает сродство ацетилхолина к М-холинорецепторам) и снижает эффективность М-холинергического воздействия на сердце. Оно также снижает способность ацетилхолина (10-7 и 10-6г/мл) уменьшать хроно-инотропные взаимоотношения. В отдельных случаях (за счет наличия эндогенного сенсибилизатора М-холинорецепторов) оно повышает отрицательный инотропный эффект ацетилхолина. Для М-холиноблокирующего эффекта сыворотки пуповинной крови вероятность его наблюдения возрастает с увеличением концентрации ацетилхолина в среде, а для М-холиносенсибилизирующего эффекта, наоборот, снижается.
Список литературы:
1. Атаджанов М.А., Баширова Н.С., Усманходжаева А.И. и др. Спектр фосфолипидов в органах- мишенях при стрессе //Патфизиология и экспер. терапия. - 1995. - №3. - С.46-48.
2. Бабская Н.Е., Ашмарин И.П., Действие дипептидов GLY-PRO, PRO-GLY, глицина и пролина на кардиотропные эффекты ацетилхолина. //Бюл. эксперим. биол. и мед.- 1998.- №8.- С.139-141.
3. Баевский Р.М. Анализ вариабельности сердечного ритма в космической медицине // Физиология человека.- 2002.- Т.28, № 2.- С.70-82.
4. Биленко М.В., Булгаков В.Г., Моргунов А.А. Отрицательный инотропный и вазоконстрикторный эффект окисленных фосфолипидов. //Кардиология.- 1989.- Т.29, №6.- С.88-93.
5. Ватанабе А., Линдеманн Дж. Механизмы адренергической и холинергической регуляции сократимости миокарда // Физиология и патофизиология сердца.- под ред. Розенштрауха Л.В.- М., Медицина.- 1990.-С.124-168.
6. Звездина Н.Д, Турпаев Т.М. Холинолитические свойства сыворотки крови. Физиол. журн. СССР.-1970.- Т.56, № 8.- С.500-506.
7. Изаков В.Я. Медиаторные механизмы симпатического контроля деятельности сердца. // Физиология кровообращения. Физиология сердца. В серии: «Руководство по физиологии». Л., «Наука», 1980. 598с.
8. Красникова Т.Л., Габрусенко С.А. ß-адренергические рецепторы сердца в норме и при сердечной недостаточности.//Успехи физиологических наук. -2000. -Т.31. -№2. -С.35-50.
9. Мальчикова С.В., Сизова Е.Н., Циркин В.И., Гуляева С.Ф., Трухин А.Н., Ведерников В.А. Содержание в сыворотке крови больных, перенесших острый коронарный инцидент, эндогенных факторов, изменяющих сократительную активность, ß-адрено- и М-холинореактивность гладких мышц, и влияние на него физических тренировок. // Вятский медицинский вестник.- 2002.- № 3.- С.42-54.
10. Покровский В.М., Осадчий О.Е., Шейх-заде Ю.Р. и др. Ваготропное действие пептидов, выделенных из мозга гибернирующих сусликов //Физиологический журн. СССР.- 1992.- Т.78 ,№ 4.- С.26-31
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
Проказова Н.В., Звездина Н.Д., Суслова И.В., Коротаева А.А., Турпаев Т.М. Влияние лизофосфатидилхолина на чувствительность сердца к ацетилхолину и параметры связывания хинуклидинилбензилата с мембранами миокарда // Рос. физиол. журн.- 1998.- Т.84, №10.- С.969-978. Сазанова М.Л. Влияние сыворотки пуповинной крови человека на гладкие мышцы матки и сосудов пуповины: Авфтореф.... дис. к.б.н. - Киров.- 2002.- 16с.
Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ: Монография. Волгоград, изд-во «Семь ветров».- 1999.- 640с.
Сизова Е.Н., Циркин В.И., Дворянский С.А. Изучение роли эндогенных модуляторов хемореактивности в регуляции коронарного кровотока // Рос. Физиол. журн. им. И.М. Сеченова.- 2002.- Т.88.- №7.-С.856-864.
Ткачук В. А. Гормональная регуляция транспорта Са2+ в клетках крови и сосудов // Рос. физиол. журн.-1998.- Т.84, №10.- С.1006-1018.
Трухин А.Н., Анисимова О.В., Циркин В.И., Дворянский С.А. Исследование способности эндогенного сенсибилизатора p-адренорецепторов изменять p-адренореактивность сердечной мышцы. //Адренергический механизм как компонент системы регуляции сократительной деятельности матки при беременности и в родах - физиологические и клинические аспекты: Сборник научных трудов, посвященных 10-летию кафедры акушерства и гинекологии КГМА - Киров, 2001.- С.80-85. Хавинсон В.Х., Кожемякин А.Л, Федин А.Н. и др. Релаксирующее действие олигопептидов, выделенных из слизистой трахеи и легочной паренхимы, на гладкую мускулатуру трахеи крыс. // Бюлл. эксп. биолог. и мед.- 1992.- Т. 113, № 5.- С.483-486.
Циркин В.И., Дворянский С.А., Осокина А.А. и др. Способность сыворотки крови человека ингибировать сократительную реакцию миометрия на ацетилхолин. // Лекарственное обозрение, 1996.-№4.- С. 49-54.
Циркин В.И., Дворянский С.А. Сократительная деятельность матки (механизмы регуляции).- Киров.-1997.- 270с.
Циркин В.И., Ноздрачев А.Д., Сизова Е.Н., Дворянский С.А., Сазанова М.Л. Система эндогенной модуляции, регулирующая деятельность периферических автономных нервных структур // Доклады РАН.- 2002.- Т.383, №5.- С.698-701.
Чазов Е.И, Меньшиков М.Ю., Ткачук В.А. Нарушения рецепции гормонов и внутриклеточной сигнализации при гипертонии.// Усп. физиол. наук.- 2000.- Т. 31, № 1, - С. 3-17.
Chen L., Liang B., Froese D. et al. Oxidative modification of low density lipoprotein in normal and hyperlipidemic patients: еffect of lysophosphatidylcholine composition on vascular relaxation // J. Lipid Res. -1997.- V.38, №3.- С.546-553.
Fischmeister R., Vandecasteele G., Abi-Gerges N., Verde I., Eschenhagen T., Mery P.F., Muscarinic regulation of the heart: NO news is bad news // Pap. Jt Meet. Physiol. Soc. (Gr. Brit.) with Czech Physiol. Soc., Prague, 22-24 June, 1998,.- J. Physiol. Proc.- 1998.- P.2-3.
Hashizume H., Hoque A., Magishi K. et al. A new approach to the development of antiischemic drugs. Substances that counteract the deleterious effect of lysophosphatidylcholine on the heart // Jpn. Heart. J.-1997.- №1.- Р.11-25.
Hoque A., Hoque N., Hashizume H. Abiko Y. // Jpn. J. Pharmacol.- 1994.- V.67.- Р.233-241.
Kawaguchi T., Koehler R.C., Brusilow S.W., Traystman R.J., Pial arteriolar dilation to acetylcholine is
inhibited by ammonia-induced increases in glutamine//FASEB Journal.- 1997.- №3.- P.486.
Kikuta K., Sawamura T., Miwa S. et al. High-affinity arginine transport of bovine aortic endothelial cells is
impaired by lysophosphatidylcholine // Circ. Res.- 1998.- №11. - P.1088-1096.
Kodama Itsuo, Suzuki Ryoko, Hohjo Haruo, Boyett Mark R., Toyama Junji, The effects of zatebradine (UL-FS 49) on the negative chronotropic effect of acetylcholine on the sinoatrial node // Environ. Med.- 1995.- №1.- P. 69-72.
Miura M., Belvisi M., Stretton C. et al. Role of K+ channels in the modulation of cholinergic neural responses
in guinea-pig and human airways // J. Physiol.- 1992.- V.455, №1.- P.1-15.
Ohara Y., Pеterson Т., Zheng В. et al.// Atherscler. Thromb.- 1994.- V.14.- Р.1007-1013.
Watson C., Gold M. Lysophosphatidylcholine modulates cardiac INa via multiple protein kinase pathways //
Circ. Res. - 1997. - №3. - P.387-395.
Yamakawa T., Eguchi S., Yamakawa Y., Motley E., Numaguchi K., Utsunomiya Н., Inagami T. Lysophosphatidylcholine stimulates MAP kinase activity in rat vascular smooth muscle cells // Pap. 51st Annu. Fall Conf. and Sci. Sess. Amer. Heart Assoc. Counc. High Blood Pressure Res., Washington, D.C., Sept. 16-19, 1997.- Hypertension.- 1998.- №1.- С.248-253.
Yuan Y., Schhoenwaelder S., Salem H., Jackson S. The bioactive phospholipid, lysophosphatidylcholine, induces cellular effects via G-protein-dependent activation of adenylyl cyclase. //J. Biol. Chem.- 1996.- V.271, №43.- Р.27090-27098.
Б
В
РИНГЕР АЦХ-6
Рис.1. Механограммы изолированного сердца лягушки, демонстрирующие М-холиноблокирующий эффект 100-кратно разведенной сыворотки пуповинной крови (СПК 1:100) на фоне 1-й и 2-й ритмических электростимуляций в серии с ацетилхолином в концентрации 10-6 г/мл (АЦХ-6).
Панели А, Б и В - этапы эксперимента. Горизонтальные линии под механограммами отражают момент воздействия раствора Рингера, СПК 1:100 и АЦХ-6. Калибровка - 10мН, 15с.
Каждое сокращение соответствует одиночному электростимулу (5мс, 5В, 1Гц). На каждом из семи этапов эксперимента осуществляли последовательно 1-ю и 2-ю электростимуляции. В 5-минутных интервалах между ними и между этапами эксперимента регистрация механограмм не проводилась.
Рис 2. Зависимость инотропного эффекта ацетилхолина от его концентрации в среде, выявляемая до (А1), на фоне (А2) и после (А3) воздействия на изолированное сердце лягушки 100-кратно разведенной сыворотки пуповинной крови человека.
По оси абсцисс - отрицательный ^ концентрации ацетилхолина (1 - 10-7 г/мл; 2 - 10-6г/мл; 3 - 10-5г/мл). По оси ординат - величина инотропного эффекта ацетилхолина, т.е. амплитуда (в % фоновому уровню) минимальных (Мин-1, Мин-2) и максимальных (Макс-1, Макс-2) сокращений, вызванных соответственно при 1-й и 2-й электростимуляциях, под влиянием ацетилхолина.
Таблица.
Показатели вызванной сократительной активности изолированного сердца лягушки при воздействии ацетилхолина и 100-кратно разведенной сыворотки пуповинной крови (в процентах).
Показатели сократительной активности Этапы экспе римента
1 2 3 4 5 6 7
Раствор Рингера Ацетил-хо лин Раствор Рингера Сыворотка Сыворотка +ацетилхо лин Раствор Рингера Ацетилхолин
Серия 1. Ацетилхолин 10-7 г/мл (п=11)
Минимальная амплитуда (1-я стимуляция) 100 65,6+7,4 * 81,9+12,6 119,9 +17,3 96,1+14,0 105,7+16.0 75,6+6,7***
Максимальная амплитуда (1-я стимуляция) 100 90,1+8,2 93,3+14,0 102,5 +6,8 99,9+10,5 118,5+15,4 79,2+5,3 ***
Время достижения
максимальной амплитуды (1-я стимуляция ) 100 106,2+19,1 108,6+18,1 110,9 +10,2 103,0+5,0 126,5+18,9 96,1+8,1
Минимальная амплитуда (2-я 132,0
стимуляция) 100 98,4+14,8 125,3+18,8 +17,8 87,7+13,3 106,4+15,8 84,3+13,0
Максимальная амплитуда (2-я 113,3 86,3+6,3
стимуляция) 100 90,5+10,0 99,1+8,4 +8,0 **& 111,2+13,7 77,6+5,6 ***
Время достижения
максимальной амплитуды (2-я стимуляция) 100 120,7+15,4 106,2+16,3 97,2 +15,8 115,7+11,3 118,0+31,5 121,9+23,3
Серия 2. Ацетилхолин 10-6 г/мл (п=10)
Минимальная амплитуда (1-я 52,7+10,9 115,9 129,8+32,1
стимуляция ) 100 * 76,3+7,5 * +26,1 а 114,7+18,9 64,3+15,4***
Максимальная амплитуда (1-я 111,1 90,5
стимуляция ) 100 71,2+5,8 * 86,8+4,2 * +6,0 +7,7&а 111,4+8,5 69,6+4,1 ***с
Время достижения
максимальной амплитуды (1-я стимуляция ) 100 91,2+10,9 88,4+8,9 96,1 +7,7 130,7+34,0 117,1+23,9 94,1+11,8
Минимальная амплитуда (2-я 102,5 94,7+15,1
стимуляция) 100 55,4+6,8 * 118,5+22,2 +12,1 а 80,2+10,8 55,5+8,3*** с
Максимальная амплитуда (2-я 104,4
стимуляция) 100 67,7+6,9 * 92,6+5,2 +3,4 96,4+2,7 а 96,3+3,2 73,7+5,1 ***с
Время достижения
максимальной амплитуды (2-я стимуляция) 100 105,5+4,5 98,7+17,6 103,8 +4,8 91,7+7,5 119,6+30,7 93,4+22,2
Серия 3. Ацетилхолин 10-5 г/мл (п=10)
Минимальная амплитуда (1-я 118,6 130,0 133,9 59,9+10,0
стимуляция ) 100 45,2+3,0 * 93,2+14,8 +17,3 +10,2** а +15,7** ***с
Максимальная амплитуда (1-я 144,2
стимуляция ) +26,4 105,8+1,9 129,6
100 51,8+5,7 * 99,5+11,9 ** **&а +11,5** 53,3+4,2 ***с
Время достижения максимальной амплитуды (1-я стимуляция ) 100 87,9+12,8 118,9+21,2 106,7 +10,7 147,9 +32,0а 124,5+18,6 93,1+9,9
Минимальная амплитуда (2-я 144,4
стимуляция) +19,6 115,3+15,7 43,6+12,6
100 40,1+7,2 * 109,7+21,6 ** а 128,0+17,1 ***с
Максимальная амплитуда (2-я 137,6
стимуляция) +25,8 106,2+3,3
100 47,0+4,3 * 94,1+8,8 ** а 120,3+9,9 48,8+4,4 ***с
Время достижения максимальной амплитуды (2-я стимуляция) 100 94,3+14,5 98,1+11,5 120,3 +8,1** 157,5+34,0 163,2 +28,8** 105,0+17,9
Д по минимальной амплитуде Отсутст Р1-3 Отсутству Отсут Отсутству Отсутству Отсутствует
(1-я стимуляция ) вует ет ствует ет ет
Д по максимальной амплитуде Отсутст Р1-3 Р2-3 Отсутству Отсут Отсутству Отсутству Р1-3 Р2-3
(1-я стимуляция ) вует ет ствует ет ет
Д по времени достижения Отсутст Отсутству Отсутству Отсут Отсутству Отсутству Отсутствует
максимума (1-я стимуляция ) вует ет ет ствует ет ет
Д по минимальной амплитуде Отсутст Р1-2 Р2-3 Отсутству Отсут Отсутству Р2-3 Р1-2 Р1-3
(2-я стимуляция) вует ет ствует ет
Д по максимальной амплитуде (2-я стимуляция) Отсутст вует Р1-3 Р2-3 Отсутству ет Отсут ствует Р1-3 Р2-3 Р2-3 Р1-3 Р2-3
Д по времени достижения Отсутст- Отсутст-ву Отсутст-ву Отсут Отсутст-ву Отсутст-ву Отсутствует
максимума (2-я стимуляция) вует ет ет ствует ет ет
Примечания: Показатели этапов 2 и 3 выражены в % к показателям этапа 1; этапов 4, 5 и 6 - в % к этапу 3, а этапа 7 - в % к этапу 6. Символы указывают на достоверные различия (р<0,05) между 1 и 2, 3 этапами (*), 3 и 4,5 (**), 6 и 7 (***), 4 и 5 (&); 2 и 5 (а), 2 и 7 (Ь), 5 и 7 (с). Д -наличие достоверных различий (р<0,05) между сериями 1, 2 и 3..
