CC BY
47
Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3
и ответа на лечение у больных ЛН. С целью изучения возможного прогностического значения АФЛА/ВА мы проанализировали продолжительность жизни у больных ЛН с антифосфолипидной активностью и без нее.
Материалы и методы. Объектом исследования были 55 больных со злокачественными процессами лимфоидной ткани - ЛН (38 мужчин и 17 женщин) в возрасте от 28 до 81 года. Среди них хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) диагностирован у 8 больных, злокачественные лимфомы (ЗЛ) - у 28, неходжкинская лимфома (НЛ) - у 24 больных, лимфома Ходжкина (ЛХ) - у 4, множественная миелома (ММ) - у 19. Продолжительность заболевания составляла от 1 до 70 мес. Клинико-лабораторные исследования включали клиническое обследование, гематологические, цитологические, биохимические и иммунологические анализы. Всем больным проводили скрининговые коагулологические исследования. ВА определяли коагулологическим методом согласно международным критериям. Влияние прогностического фактора (ВА) изучали путем оценки кривых выживаемости Каплана-Майера с определением значимого различия между группами с помощью F-критерия Кокса. Медиана срока наблюдения за выживаемостью составила 24 мес (от 1 до 70 мес).
Результаты и обсуждение. ВА был диагностирован у 18,2% обследованных больных. Распространенность ВА при отдельных нозологических формах ЛН составляла: при ХЛЛ - 12,5%, ЗЛ - 10,7%, ММ - 31,6%. При оценке продолжительности жизни 55 больных ЛН нами отмечена большая доля (70%) умерших среди больных ЛН с выявленной активностью ВА, чем у больных без ВА (15,6%) (х2 = 10,073; р < 0,05). При анализе выживаемости больных ЛН в течение 70 мес, в группах ВА-позитивных и ВА-негативных больных выявлено существенное различие в величинах долей умерших на различных сроках наблюдения. При сравнении кривых выживания ВА-позитивных и ВА-негативных больных выявлено, что общая продолжительность жизни на протяжении наблюдения была меньше (р = 0,001) у больных ЛН с ВА, чем у ВА-негативных больных.
Заключение. Установлено, что больные лимфоидными неоплазиями имеют повышенную склонность к образованию волчаночного антикоагулянта, что является дополнительным аутоиммунным осложнением при этой патологии. Показано, что наличие антифосфолипидных активности у этой категории больных может быть одним из неблагоприятных прогностических признаков течения болезни.
Морфологические особенности диагностики гемофагоцитарного синдрома при нейтропениях
у детей в московском регионе
Я.А. Круглова, Т.А. Астрелина, М.В. Яковлева, Е.В. Клеина, О.В. Селивестрова, Л.А. Дудина ГБУЗ Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения города Москвы
Введение. Нейтропении часто встречаются в виде синдрома или диагностируются как первичное заболевание ней-трофильных лейкоцитов и/или их предшественников. Внимание к вторичному гемофагоцитозу или гемофагоцитарному синдрому обусловлено тем, что он является одной из причин развития нейтропений и не является нозологической формой гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза. Гемофагоцитоз выявляется при диагностике злокачественных новообразований, воспалительных, инфекционных, аутоиммунных и др. заболеваний и требует дополнительное проведение иммуномодулирующей терапии к стандартной этиотропной терапии
Материалы и методы. В Банке стволовых клеток ДЗМ было проведено исследование 34 детям с предварительным диагнозом "нейтропения неясного генеза" из Детской городской клинической больницы №9 (Москва). Во всех случаях, при исследовании периферической крови определялась двухтрехростковая цитопения, а при морфологическом исследовании костного мозга определялись признаки гемофагоцитоза. Основным морфологическим признаком гемофагоцитоза было отсутствие атипии у пролиферирующих макрофагов; макрофаги с включениями в цитоплазме в виде клеточных фрагментов.
Результаты и обсуждение. В подавляющем большинстве четко визуализировались клетки гранулоцитарного и/или эри-троидного ряда и/или тромбоциты. Отмечалось резкое увеличение количества макрофагов, которые встречались преимущественно в крупных скоплениях по 8-15 и более, регулярно в частых полях зрения встречались одиночные макрофаги, в единичных случаях их было на столько много, что их вносили в счет миелограммы. В миелограмме почти у всех пациентов были отмечены: раздражение моноритарного ростка; вакуолизация ядра и цитоплазмы, с прикраевой базофилией от умеренной до выраженной; омоложение ростка до промоноцитов; наличие моноцитов с признаками фагоцитоза (п = 3). В пун-ктате костного мозга лимфоидный росток был расширен, в 17 случаях (после перенесенной вирусной инфекции - инфекционный мононуклеоз, герпетическая инфекция), проводили
подсчет лимфограммы так как среди лимфоцитов встречались лимфоидные клетки более крупных размеров, с омоложенной структурой хроматина, как правило широкоцитоплазменные, и базофилией цитоплазмы (вирус ассоциированные лимфоциты, "атипичные мононуклеары"). Процентное содержание этих клеток было вариабельное от единичных клеток до 28% в лимфограмме, во всех случаях преобладали малые формы лимфоцитов (68-80%), а содержание больших гранулярных лимфоцитов не превышало 5%. Обращало внимание на себя наличие плазматических клеток, которые встречались даже в скоплениях по 2-3 клетки, часть из которых были отнесены к "пламенеющим", часть плазматических были 2-3 ядерные, единичные клетки содержали тельца Рассела. При оценке ми-елоидного ростка в отдельных случаях тоже было выявлены определенные морфологические признаки диспоэза: грубая обильная зернистость по типу токсогенной, вакуолизация цитоплазмы. Мегакариоцитарный росток в пунктате костного мозга был в пределах возрастной нормы, в 5 случаях отмечено расширение ростка от умеренного (30-50 мегакариоцитов в препарате) до выраженного (более 100 клеток). Раздражение мегакариоцитарного ростка наблюдалось тогда, когда в гемограмме была тромбоцитопения. и этих же случаях отмечалась корреляция с описанными миелограммами, в которых были описаны макрофаги, в цитоплазме которых были обнаружены тромбоцитарные пластинки. Выявленная неконтролируемая активация макрофагов, и обусловленный, нерегулируемый этим фагоцитоз клеток крови и их предшественников были отличительной особенностью гемофагоцитарного синдрома, практически всегда приводящего к нейтропении в гемограмме.
Заключение. Для дифференциальной диагностики ней-тропений необходимо исследование пунктата костного мозга, так как изменения в миелограмме определяются формой заболевания, и дальнейшая тактика выбора терапии зависит от скоординированного взаимодействия врачей различных специальностей (морфологов, лаборантов, педиатров, гематологов, иммунологов и др.).
Влияние степени сульфатирования на антикоагулянтную активность крахмала и инулина
А.А. Кужим1, Н.Н. Дрозд 1, М.А. Торлопов 2, В.А. Макаров 1
1 ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития России, Москва; 2 Институт химии Коми научного центра УрО РАН, Сыктывкар
Введение. Величина антикоагулянтной (АК) активности маннанов, каррагенанов, галактанов, целлюлозы, пектинов,
сульфатов полисахаридов растительного/животного проис- хитозана) модулируется молекулярной массой, количеством
хождения (гепарины, фукоиданы, а также сульфаты галакто- и расположением О-сульфатных или свободных карбоксиль-
118
Приложение
ных групп, видами моно-(ди-)сахаридов, входящих в состав молекулы полимера, числом и местом ответвлений (в случае нелинейного полисахарида) [P. Laurienzo, 2010; I. Pawlaczyk et al., 2011; A. Rek et al., 2009]. Цель работы - исследование влияния степени сульфатирования на АК активность сульфатов крахмала (СК) и сульфатов инулина (СИ).
Материалы и методы. СК получали с использованием раствора хлорсульфоновой кислоты в ДМФА; СИ - этерификацией инулина комплексом пиридин-SOj в ДМФА при 25оС. Молекулярную массу (ММ) СК и СИ определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Анализ антикоагулянтной (АК) активности образцов СК и СИ in vitro проводили с использованием бедной тромбоцитами плазмы человека. Для этого кровь от 8 доноров смешивали с 0,11 М раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 и центрифугировали 20 мин при 1400g и 4оС. Влияние СК и СИ на свертывание цитратной плазмы человека оценивали в тестах протромбинового времени (ПВ), активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) и с использованием набора РеаКлот - гепарин (аналог Heptest) НПО "Ренам". Время появления фибринового сгустка плазмы фиксировали на коагулометре Минилаб 701. Для оценки действия полученных соединений определяли концентрации 2ПВ, 2АЧТВ, 2РеаКлот - эффективные концентрации (ЭК), при которых время свертывания увеличивалось в 2 раза, в сравнении с контролем; для работы использовали наборы реактивов НПО "Ренам". Специфические АК активности СК и СИ в тестах АЧТВ и РеаКлот-гепарин определяли по описаниям в работах [T.Barrowcliffe, 1978; E. Yin et al., 1973], сравнивая показания с 5-м Международным стандартом НФГ. Влияние СК
и СИ в присутствии или без антитромбина (АТ, "Sigma"), на амидолитическую активность тромбина (Т, "Sigma") оценивали по методу A.Teien и et al, 1987. Статистическую значимость различий оценивали по критерию Колмогорова-Смирнова из пакета программ Stagraphics Plus 6.0.
Результаты и обсуждение. Средняя ММ СИ 70008000 Да, степень сульфатирования (СС) 0,6-1,6; средняя ММ СК 25 000-30 000 Да, СС 0,4-2,5). Добавление в плазму человека образцов СК (0,1-2000 мкг/мл плазмы) приводило к удлинению времени появления фибринового сгустка в тестах ПВ (диапазон ЭК СК составил 32,2 ± 2,1 - 311 ± 17 мкг/мл плазмы; СИ 1907 ± 79 мкг/мл), АЧТВ (ЭК СК =1,50 ± 0,14 - 7 ± 0,18 мкг/мл плазмы, ЭК СИ = 37,1 ± 10,6-126,4 ± 87,3 мкг/мл плазмы) и с использованием набора РеаКлот-гепарин (ЭК СК = 2,34 ± 0,45-20,89 ± 3,3 мкг/мл плазмы, ЭК СИ = 1-447 ± 41 и 1813 ± 365 мкг/мл плазмы). Без добавления антитромбина СК и СИ не ингибировали скорость гидролиза тромбином хромогенного субстрата.
Заключение. Сульфаты крахмала и инулина увеличивают время появления фибринового сгустка плазмы в коагулоло-гических тестах и опосредованно (через антитромбин) снижают скорость гидролиза тромбином хромогенного субстрата. Антитромбиновая (aIIa) активность сульфатов крахмала достигает 16,8-70 ЕД/мг, активность против фактора Ха (аХа активность) - 2,3 - 16,6 ЕД/мг; alia активность сульфатов инулина составляет 5,5-11,4 ЕД/мг, аХа активность - 0-1,4. С увеличением степени сульфатирования сульфатов крахмала антикоагулянтная активность возрастает. Для эффективного взаимодействия с антитромбином степень сульфатиро-вания крахмала и инулина должна составлять 1,0.
Полиморфизм генов ферментов цитохрома P450 и глутатион S-трансферазы у пациентов с ХМЛ с отсутствием ответа или субоптимальным ответом на терапию иматинибом
Т. И. Кунгурова ', А. Соколова ', С. В. Морданов ', Ю.В. Шатохин ', С.И. Куцев 23
'ГБОУ ВПО Ростовский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России, Ростов-на-Дону;
2ФГБУ Медико-генетический научный центр РАМН; 3ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет
им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России, Москва
Введение. Ферменты цитохрома P450 играют важную роль в деградации фармакологических препаратов, снижая их активность и увеличивая их элиминацию. Также глутатион S-трансфераза, катализирующая конъюгацию многих веществ с восстановленным глутатионом, играет важную роль в процессах детоксикации веществ. Целью настоящей работы являлось исследование конверсий, делеций и изменений числа копий (Copy Number Variations, CNV) генов некоторых ферментов цитохрома P450 и ферментов глутатион S-трансферазы в группе пациентов с диагнозом хронический миелолейкоз (ХМЛ), не ответивших на терапию има-тиниба или достигших субоптимального ответа на терапию иматинибом
Материалы и методы. В исследование включены 63 больных ХМЛ и 20 здоровых лиц (контрольная группа). Диагноз ХМЛ был подтвержден цитогенетическим и молекулярным методами. Больные ХМЛ получали терапию иматинибом в дозе 400-600 мг/сут. В исследование включены больные ХМЛ с отсутствием ответа на терапию имати-нибом или субоптимальным ответом. Поиск мутаций осуществлялся методом MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) с помощью набора P128 Cytochrome P-450 (MRC Holland), содержащего зонды к генам цитохрома P450 и ферментов глутатион S-трансферазы: CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP1B1, CYP3A4, CYP3A5, CYP2E1, CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, GSTP1, GSTT1 и GSTM1. Набор содержал не менее 2 зондов к каждому гену, а также 12 референтных зондов к консервативным участкам генома.
Результаты и обсуждение. Анализ полученных данных показал, что в обеих группах с одинаковой частотой встречаются изменения электрофоретической подвижности фрагментов генов GSTT1, обусловленные делецией в гомозиготном состоянии. Делеции в экзонах 1 и 5, или только экзона 1 гена GSTT1 выявлены у 10 (15,9%) из 63 больных
ХМЛ. В контрольной группе отсутствие пика экзонов 1 и 5, или только экзона 1 гена GSTT1 выявлено у 3 (15%) из 20 человек. Анализ электрофоретической подвижности ампли-фицированных фрагментов гена GSTM1 показал отсутствие пика, обусловленное возможной делецией в гомозиготном состоянии в экзонах 3 и 5, у 26 (41,3%) из 63 больных ХМЛ и у 11 (55%) из 20 (контрольная группа). В группе больных ХМЛ обнаружены изменения электрофоретической подвижности амплифицированных фрагментов генов ферментов цитохрома P450, свидетельствующие о делеции в гомозиготном состоянии, у 10 (15,9%) больных. Выявлены делеции гена CYP2A6 (в основном - амплифицированного фрагмента экзона 1) у 6 человек, гена CYP2D6 - у 3 и гена CYP2C19 (экзон 2) - у 1. В группе контроля обнаружены электрофоретические изменения у 4 (20%) человек в следующих генах: CYP1A2 (экзон 7), CYP2A6 (экзон 1), CYP3A4 (экзон 4, а также, возможно, 2 и 6) и CYP3A5 (экзон 10).
Заключение. Полученные нами данные позволяют отметить, что группа больных ХМЛ практически не отличается от контрольной группы по частоте мутаций генов GSTT1 и GSTM1, кодирующих ферменты II фазы детоксикации ксенобиотиков. Частота изменений электрофоретической подвижности амплифицированных фрагментов генов, кодирующих ферменты цитохрома P450, также сопоставима, однако спектр отличается в группе больных ХМЛ и контрольной группе. Так, у 6 (9,5%) больных ХМЛ обнаружены мутации гена CYP2A6, а в контрольной группе - у 1 (5%). У 3 больных ХМЛ обнаружены мутации гена CYP2D6, которые не обнаружены в контрольной группе. Результаты данного пилотного исследования показали, что молекулярно-генетическое исследование генов цитохрома P450 методом MLPA перспективно для изучения фармакогенетики иматиниба с целью выявления возможных ассоциаций и предиктивного значения выявленных мутаций в терапии ХМЛ.
119
