CC BY
59
Приложение
ных групп, видами моно-(ди-)сахаридов, входящих в состав молекулы полимера, числом и местом ответвлений (в случае нелинейного полисахарида) [P. Laurienzo, 2010; I. Pawlaczyk et al., 2011; A. Rek et al., 2009]. Цель работы - исследование влияния степени сульфатирования на АК активность сульфатов крахмала (СК) и сульфатов инулина (СИ).
Материалы и методы. СК получали с использованием раствора хлорсульфоновой кислоты в ДМФА; СИ - этерификацией инулина комплексом пиридин-SOj в ДМФА при 25оС. Молекулярную массу (ММ) СК и СИ определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Анализ антикоагулянтной (АК) активности образцов СК и СИ in vitro проводили с использованием бедной тромбоцитами плазмы человека. Для этого кровь от 8 доноров смешивали с 0,11 М раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 и центрифугировали 20 мин при 1400g и 4оС. Влияние СК и СИ на свертывание цитратной плазмы человека оценивали в тестах протромбинового времени (ПВ), активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) и с использованием набора РеаКлот - гепарин (аналог Heptest) НПО "Ренам". Время появления фибринового сгустка плазмы фиксировали на коагулометре Минилаб 701. Для оценки действия полученных соединений определяли концентрации 2ПВ, 2АЧТВ, 2РеаКлот - эффективные концентрации (ЭК), при которых время свертывания увеличивалось в 2 раза, в сравнении с контролем; для работы использовали наборы реактивов НПО "Ренам". Специфические АК активности СК и СИ в тестах АЧТВ и РеаКлот-гепарин определяли по описаниям в работах [T.Barrowcliffe, 1978; E. Yin et al., 1973], сравнивая показания с 5-м Международным стандартом НФГ. Влияние СК
и СИ в присутствии или без антитромбина (АТ, "Sigma"), на амидолитическую активность тромбина (Т, "Sigma") оценивали по методу A.Teien и et al, 1987. Статистическую значимость различий оценивали по критерию Колмогорова-Смирнова из пакета программ Stagraphics Plus 6.0.
Результаты и обсуждение. Средняя ММ СИ 70008000 Да, степень сульфатирования (СС) 0,6-1,6; средняя ММ СК 25 000-30 000 Да, СС 0,4-2,5). Добавление в плазму человека образцов СК (0,1-2000 мкг/мл плазмы) приводило к удлинению времени появления фибринового сгустка в тестах ПВ (диапазон ЭК СК составил 32,2 ± 2,1 - 311 ± 17 мкг/мл плазмы; СИ 1907 ± 79 мкг/мл), АЧТВ (ЭК СК =1,50 ± 0,14 - 7 ± 0,18 мкг/мл плазмы, ЭК СИ = 37,1 ± 10,6-126,4 ± 87,3 мкг/мл плазмы) и с использованием набора РеаКлот-гепарин (ЭК СК = 2,34 ± 0,45-20,89 ± 3,3 мкг/мл плазмы, ЭК СИ = 1-447 ± 41 и 1813 ± 365 мкг/мл плазмы). Без добавления антитромбина СК и СИ не ингибировали скорость гидролиза тромбином хромогенного субстрата.
Заключение. Сульфаты крахмала и инулина увеличивают время появления фибринового сгустка плазмы в коагулоло-гических тестах и опосредованно (через антитромбин) снижают скорость гидролиза тромбином хромогенного субстрата. Антитромбиновая (aIIa) активность сульфатов крахмала достигает 16,8-70 ЕД/мг, активность против фактора Ха (аХа активность) - 2,3 - 16,6 ЕД/мг; alia активность сульфатов инулина составляет 5,5-11,4 ЕД/мг, аХа активность - 0-1,4. С увеличением степени сульфатирования сульфатов крахмала антикоагулянтная активность возрастает. Для эффективного взаимодействия с антитромбином степень сульфатиро-вания крахмала и инулина должна составлять 1,0.
Полиморфизм генов ферментов цитохрома P450 и глутатион S-трансферазы у пациентов с ХМЛ с отсутствием ответа или субоптимальным ответом на терапию иматинибом
Т. И. Кунгурова ', А. Соколова ', С. В. Морданов ', Ю.В. Шатохин ', С.И. Куцев 23
'ГБОУ ВПО Ростовский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России, Ростов-на-Дону;
2ФГБУ Медико-генетический научный центр РАМН; 3ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет
им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России, Москва
Введение. Ферменты цитохрома P450 играют важную роль в деградации фармакологических препаратов, снижая их активность и увеличивая их элиминацию. Также глутатион S-трансфераза, катализирующая конъюгацию многих веществ с восстановленным глутатионом, играет важную роль в процессах детоксикации веществ. Целью настоящей работы являлось исследование конверсий, делеций и изменений числа копий (Copy Number Variations, CNV) генов некоторых ферментов цитохрома P450 и ферментов глутатион S-трансферазы в группе пациентов с диагнозом хронический миелолейкоз (ХМЛ), не ответивших на терапию има-тиниба или достигших субоптимального ответа на терапию иматинибом
Материалы и методы. В исследование включены 63 больных ХМЛ и 20 здоровых лиц (контрольная группа). Диагноз ХМЛ был подтвержден цитогенетическим и молекулярным методами. Больные ХМЛ получали терапию иматинибом в дозе 400-600 мг/сут. В исследование включены больные ХМЛ с отсутствием ответа на терапию имати-нибом или субоптимальным ответом. Поиск мутаций осуществлялся методом MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) с помощью набора P128 Cytochrome P-450 (MRC Holland), содержащего зонды к генам цитохрома P450 и ферментов глутатион S-трансферазы: CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP1B1, CYP3A4, CYP3A5, CYP2E1, CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, GSTP1, GSTT1 и GSTM1. Набор содержал не менее 2 зондов к каждому гену, а также 12 референтных зондов к консервативным участкам генома.
Результаты и обсуждение. Анализ полученных данных показал, что в обеих группах с одинаковой частотой встречаются изменения электрофоретической подвижности фрагментов генов GSTT1, обусловленные делецией в гомозиготном состоянии. Делеции в экзонах 1 и 5, или только экзона 1 гена GSTT1 выявлены у 10 (15,9%) из 63 больных
ХМЛ. В контрольной группе отсутствие пика экзонов 1 и 5, или только экзона 1 гена GSTT1 выявлено у 3 (15%) из 20 человек. Анализ электрофоретической подвижности ампли-фицированных фрагментов гена GSTM1 показал отсутствие пика, обусловленное возможной делецией в гомозиготном состоянии в экзонах 3 и 5, у 26 (41,3%) из 63 больных ХМЛ и у 11 (55%) из 20 (контрольная группа). В группе больных ХМЛ обнаружены изменения электрофоретической подвижности амплифицированных фрагментов генов ферментов цитохрома P450, свидетельствующие о делеции в гомозиготном состоянии, у 10 (15,9%) больных. Выявлены делеции гена CYP2A6 (в основном - амплифицированного фрагмента экзона 1) у 6 человек, гена CYP2D6 - у 3 и гена CYP2C19 (экзон 2) - у 1. В группе контроля обнаружены электрофоретические изменения у 4 (20%) человек в следующих генах: CYP1A2 (экзон 7), CYP2A6 (экзон 1), CYP3A4 (экзон 4, а также, возможно, 2 и 6) и CYP3A5 (экзон 10).
Заключение. Полученные нами данные позволяют отметить, что группа больных ХМЛ практически не отличается от контрольной группы по частоте мутаций генов GSTT1 и GSTM1, кодирующих ферменты II фазы детоксикации ксенобиотиков. Частота изменений электрофоретической подвижности амплифицированных фрагментов генов, кодирующих ферменты цитохрома P450, также сопоставима, однако спектр отличается в группе больных ХМЛ и контрольной группе. Так, у 6 (9,5%) больных ХМЛ обнаружены мутации гена CYP2A6, а в контрольной группе - у 1 (5%). У 3 больных ХМЛ обнаружены мутации гена CYP2D6, которые не обнаружены в контрольной группе. Результаты данного пилотного исследования показали, что молекулярно-генетическое исследование генов цитохрома P450 методом MLPA перспективно для изучения фармакогенетики иматиниба с целью выявления возможных ассоциаций и предиктивного значения выявленных мутаций в терапии ХМЛ.
119
