CC BY
23
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
глаз 0,2 мл 4*10-6 М раствора эндотелина-1фосфатном буфере (0,05 М, рН = 7,4 по ранее предложенному нами методу. Животных, которым моделировали одностороннюю И/Р, разделили на две группы: I-ю группу составили 5 крыс (10 глаз), II-ю — 5 животных (10 глаз), получавших ресве-ратрол с питьевой водой (сут. доза — 20 мг/кг) в течение 30 дней. III-я — контрольная группа включала 5 грызунов (10 глаз). Материалом иммунологического исследования служили образцы сыворотки крови (СК; n = 20) и тканевые гомогенаты комплекса сетчатка-хориоидея (ТК; n = 20) крыс. Содержание глиального кислого фибриллярного белка (GFAP), моноцитарного хемоаттрактантного про-теина-1 (МСР-1) в тест — пробах определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) помощью тест-систем, разработанных Cloud-CloneCorp. (США), произведенных USCN Life Science Inc. (КНР) на спектрофотометре — ридере для микропланшет Labsystems Multiskan® PLUS (Финляндия) при длине волны 450 нм.
Результаты. Анализ GFAP и MCP-1 представлен в таблице. В группе животных на 3 сутки ИР наблюдалось статистически значимое повышение уровня МСР-1 в ТК и СК (р < 0,05) с максимальным усилением воспалительного ответа к 7 суткам (повышение содержания в ТК в 5,5 раз (р < 0,001) и незначительным снижением концентрации цитокина к 30 суткам И/Р. Динамика GFAP в системном кровотоке была аналогична таковой MCP-1 и свидетельствовала о повышении проницаемости гема-тоофтальмического барьера, а выявленные повышенные концентрации GFAP соответствовали данным исследований апоптоза, указывали на деструктивные процессы в нервной ткани. Применение ресвератрола в суточной дозе 20 мг/кг в течение во II группе грызунов способствовало снижению уровня маркёра воспаления МСР-1 в ТК и концентрации GFAP в СК в раннем и позднем пости-шемическом периоде (р < 0,05).
Выводы. Данные исследования динамики маркеров повреждения нервной ткани и воспаления GFAP и МСР-1 в раннем и позднем постишемическом периодах в ходе терапии ресвератролом демонстрируют защитные и противовоспалительные свойства антиоксиданта в отношении тканей глаза (ретинопротекторные, нейропотекторные) при моделировании И/Р в эксперименте у крыс.
ТАБЛИЦА. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДИНАМИКА GFAP И ПРИЕМА (I ГРУППА), НА ФОНЕ ПРИЕМА РЕСВЕРАТРОЛА (II (К ТЕЗИСАМ БАЛАЦКОЙ Н.В. И ДР.)
ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОМ СРЕДЫ НА СИНТЕЗ КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE 3 СЕРОТИПА
Барановская С.А., Токарская М.М., Елкина С.И.
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАН, Москва, Россия
Для профилактики пневмококковой инфекции применяют конъюгированные пневмококковые вакцины, созданные на основе капсульного полисахарида (КПС). Поскольку серотиповой пейзаж S. pneumoniae на различных территориях отличается, то при разработке современных иммунобиологических препаратов необходимо учитывать данные эпидемиологических исследований. Известно, что 3 серотип пневмококка был актуален для территории нашей страны с начала изучения серотипово-го пейзажа, и до сих пор его наиболее часто (до 18% случаев) высевают при острых средних отитах, самой распространенной форме пневмококковой инфекции у детей до 5 лет (Харит С.М. и соавт., 2011). Качество препаратов, на основе которых будут в дальнейшем созданы иммунобиологические препараты, является ключевым моментом, поскольку от него зависит протективный эффект вакцин. Так как КПС получают из культуральной жидкости, то необходимо, чтобы питательная среда обеспечивала максимальную скорость роста и высокий уровень синтеза КПС, а также не содержала продукты животного происхождения и высокомолекулярные соединения, которые осложняют очистку КПС. Поэтому целью данного исследования являлась оценка накопления КПС штаммом S. pneumoniae 3 серотипа при выращивании в полусинтетических питательных средах, различного состава. Для достижения данной цели поставлены был подобран состав питательной среды, обеспечивающий высокий выход КПС, определена динамика роста штамма и накопление им КПС.
В работе использовали штамм S. pneumoniae серотипа 3 (№ 10196), предоставленный лабораторией микробиологии НЦЗД МЗ РФ. В ранее проведенных исследованиях показано, что данный штамм является продуцентом КПС. Посевную культуру выращивали в течение 16 часов при 37 °C на плотной питательной среде с 5% CO2. В ка-
MCP-1 ТК И СК У КРЫС ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ И/Р: БЕЗ ГРУППА) И ГРУППЫ ИНТАКТНЫХ ЖИВОТНЫХ (М±т)
Группы Показатели Срок наблюдения
3 суток 7 суток 30 суток
I (И/Р; n = 5) MCP-1 (ng/mL) TK 0,317±0,005* 1,73±0,16* 0,75±0,09*
CK 0,404±0,06* 0,32±0,01 0,332±0,01
GFAP (pg/mL) ^ 334,12±190,4 810,9±269,3* 720,5±29,8*
II (И/Р + ресвератрол; n = 5) MCP-1 (ng/mL) TK 0,303±0,004** 0,31 ±0,02** 0,34±0,002**
CK 0,33±0,013** 0,31 ±0,04 0,339±0,005
GFAP (pg/mL) ^ 27,56±5,4** 112,6±28,4** 96,33±37,4**
III (контрольная; n = 10) MCP-1 ( TK ng/mL) 0,30±0,002
CK 0,31 ±0,005
GFAP (pg/mL) ^ 267,9±27,2
Примечание. п — количество тест-проб; *- достоверно относительно показателей контрольной группы; ** — достоверно относительно 1-й группы (* ** — р < 0,05).
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
честве солевой основы использовали среду Ледерберга. В качестве источника аминокислот применяли: амино-пептид, панкреатический пептон казеиновый, кислотный гидролизат казеина, а также соевый пептон. Глюкозу и минеральные соли стерилизовали при 1 атмосфере в течение 30 минут. Витамины стерилизовали фильтрованием. Культивирование штамма проводилось в бактериологических пробирках, содержащих по 30 мл питательной среды. В каждую пробирку засевали 0,2 мл посевной культуры. Выращивание осуществляли в течение 24 и 96 часов при температуре 37 °C в термостате с 5% подачей CO2. Посевные дозы составили 1,1 и 0,67 млрд/мл соответственно. Для определения динамики роста штамма и накопления им КПС проводили культивирование в ферментере объемом 10 л. Посевная доза составила 0,125 млрд/мл. Каждый час в течение 16 часов, а также спустя 24 часа проводили контроль оптической плотности и измерение pH. Накопление КПС оценивали при помощи ракетного иммуноэлектрофореза формалинизированных проб культуральной жидкости. В качестве референс-препарата использовали очищенный КПС.
Проведенные исследования показали, что наиболее высокий уровень КПС наблюдался при щелочном значении pH в тех питательных средах, в которых источниками являлись пептоны (среда с соевым пептоном — концентрация КПС от 20,1±2,5 до 28,0±4,3 мкг/мл; среда с казеиновым пептоном — от 16,8±2,1 до 26,4±5,3 мкг/мл) независимо от длительности культивирования. При выращивании в средах, содержащих другие источники белка, было выявлено незначительное накопление КПС (среда с кислотным гидролизатом казеина — от 2,4±0,8 до 7,8±1,5 мкг/мл; с аминопептидом — от 1,8±0,8 до 6,5±1,5 мкг/мл). Схожие данные были получены при выращивании в средах с пониженным значением pH. Вместе с тем выявлено, что выраженную продукцию КПС позволило получить использование в качестве источника аминокислот аминопептида (10,4±1,3 мкг/мл). Вероятно, наблюдавшееся спустя 96 часов снижение уровня КПС по сравнению с результатами через 24 часа произошло в результате действия ферментов S. pneumoniae, либо является следствием более низкой посевной дозы. При выращивании штамма в ферментере с использованием полусинтетической среды, содержащей соевый пептон, содержание КПС спустя 24 часа составило около 160 мкг/мл.
Таким образом, выращивание S. pneumoniae сер.3 в ферментере в течение 24 часов в полусинтетической питательной среде, содержащей соевый пептон, позволяет получить КПС в концентрации 22 мкг/мл.
ВКЛАД ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В РЕГЕНЕРАТОРНОЕ ВЛИЯНИЕ ПРОДУЦИРУЕМЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫМИ СТРОМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ МИКРОВЕЗИКУЛЯРНЫХ ЧАСТИЦ
Белогородцев С.Н., Кащенко Э.А., Селедцова Г.В.
Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии, Новосибирск, Россия
Исследования последних лет показали, что цитопро-тективное действие мезенхимальных стромальных клеток (МСК) обусловлено не процессами их хоминга и диф-ференцировки, а стимуляцией эндогенной регенерации резидентных клеток. Одним из механизмов подобного действия, кроме секреции цитокинов и факторов роста,
могут быть микровезикулярные частицы (МВ), которые осуществляют транспорт мРНК, микроРНК и сигнальных белков.
Цель. Изучить прорегенераторные свойства МВ, продуцируемых МСК и возможное участие в этом иммунной системы.
МСК получали из костного мозга лабораторных мышей путем прилипания к культуральному пластику. Для получения МВ, МСК подвергали апоптозу путем культивирования в условиях депривации кислорода и в бессывороточной среде в течение 1 суток. МВ получали из культуральной среды апоптотических клеток после предварительного удаления клеточного дебриса и последущем центрифугировании при 100 000 g в течение 60 минут. Для стандартизации суспензии МВ определяли содержание белка по методу Брэдфорда.
Для исследования влияние МВ на регенерацию тубу-лярного почечного эпителия in vivo у линейных мышей путем внутримышечного введения 50% глицерола была индуцирована острая почечная недостаточнось (ОПН). МСК или МВ вводили в внтривенно через 24 часа после индуцирования ОПН. Животные были разделены на 3 группы: ОПН-контроль, ОПН+МСК, ОПН+МВ.
Почечные эпителиоциты и спленоциты получали из гомогенатов соответствующих органов. Суспензию клеток почки пропускали через фильтр с диаметром пор 40 мкм, что позволяло избавиться от гломерул и клеточных агрегатов, и культивировали в течение 2-х недель, что позволяло получить гомогенную популяцию клеток.
После индукции ОПН, уровень мочевины плазмы крови повышался у мышей на 4-е сутки в контрольной группе в 2 раза (12,43 мкг/мл против 6,59 мкг/мл у ин-тактных мышей) и снижался к 8-м суткам до 9,64 мкг/мл. Использование МСК и МВ приводило практически к одинаковому результату: на 4-е сутки уровень мочевины составил 9,3 и 9,37 мкг/мл соответственно, что на 25% ниже, чем в глицерол-контроле. К 8-м суткам уровень мочевины составил 7,9 мкг/мл после введения МСК и 7,6 мкг/мл после введения МВ, что на 21% ниже, чем в глицерол-контроле.
Уровень пролиферации спленоцитов в тесте с Н3-ти-мидином составил 118 имп/мин, Кон А-стимулированная пролиферация составила 1208 им/мин. Культивирование в присутствии МВ в дозе 10 мкг/мл повышало пролиферативную способность спленоцитов почти в 3 раза (342 имп/мин — спонтанная, 3889 имп/мин — Кон А-стимулированная). Стимулирующий эффект на пролиферацию повышался, хоть и не пропорционально) с увеличение дозы МВ: 475 имп/мин — спонтанная и 4667 имп/мин — Кон А-стимулированная при добавлении МВ в дозе 30 мкг/мл; 492 имп/мин — спонтанная и 5012 имп/мин — Кон А-стимулированная при добавлении МВ в дозе 90 мкг/мл.
Аналогичный эффект наблюдался в отношении ПЭ. Добавление МВ в культуральную среду на 3 суток в дозе 10 мкг/мл повышало пролиферацию ПЭ в 4 раза (254 имп/мин против 65 имп/мин в контроле). Увеличение дозы МВ также повышало пролиферацию ПЭ: 337 имп/мин при дозе МВ 30 мкг/мл и 392 имп/мин при дозе МВ 90 мкг/мл.
Влияние МВ на апоптогенное действие доксируби-цина на спленоциты определяли в тесте с окраской про-пидум иодидом. При этом использовали спленоциты как от интактных мышей, так и от мышей с глицерол-инду-цированной ОПН. Интересно, что сама по себе индук-
