CC BY
128
УДК 57.083.132
И. В. Павленко, А. Я. Самуйленко, В. И. Еремец, А. А. Нежута, З. А. Канарская, А. В. Канарский
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА СИМБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ПРОЛИЗЭР
НА ОСНОВЕ Escherichia coli VL-613. ЧАСТЬ 1. ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Escherichia coli VL-613 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ
СИМБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ПРОЛИЗЭР
Ключевые слова: питательная среда, Escherichia coli VL-613, оптимизация культивирования.
Оптимизирован состав питательной среды и глубинное культивирование E.coli VL-613. Параметры оптимизации использованы при разработке технологии культивирования Escherichia coli VL-613 для получения сим-биотического препарата Пролизэр.
Keywords: growing medium, Escherichia coli VL-613, the optimization of culture.
Optimized composition of the nutrient medium and deep culturing E.coli VL-613. Optimization parameters used in the development of technology of cultivation Escherichia coli VL-613 for the preparation of the symbiotic Prolizer.
Актуальность. Одним из путей решения задач развития АПК поставленных перед наукой является разработка, производство и применение новых экологически безопасных эффективных препаратов, способных обеспечить нормальное развитие животных, что способствует получения от них качественной продукции [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8].
Этим требованиям соответствуют новые эко-биотехнологические препараты, такие как пробио-тики, пребиотики, синбиотики (эубиотики) и сим-биотики, которые применяют как в здравоохранении, так и в ветеринарии. Такие лечебно-профилактические и ростостимулирующие экологически чистые препараты физиологичны по своему действию, безвредны для животных, просты в наработке, дешевы, технологичны для группового применения, что особенно актуально для отечественного птицеводства и животноводства, занимающего передовые позиции в АПК [2, 3, 4, 6].
Симбиоз животных и микроорганизмов играет важную роль в нормальном функционировании организма животных и птицы, а так же реализации их генетического потенциала продуктивности [9].
При интенсивном ведении птицеводства и свиноводства в условиях промышленной технологии содержания животных биологически полноценное кормление является решающим фактором получения высокой продуктивности. При этом предусматривается обеспечение кормления птицы и свиней не только качественными белковыми и энергетическими компонентами, но и лимитирующими аминокислотами и другими жизненно необходимыми веществами для их роста [10, 11, 12].
Известно, что недостаток лимитирующих аминокислот нельзя восполнить за счет кормов животного происхождения, доля которых в комбикормах для птицы и свиней к тому же снижается, а цена на них растет. Для повышения полноценности кормов из растительных компонентов широко используют премиксы, добавки синтетических аминокислот и др.
Среди незаменимых аминокислот лизин занимает особое место. Он входит в состав структурных тканевых белков и белковых ферментов, способствует улучшению пищеварения, играет важную роль в формировании костяка, повышении продуктивности, оказывает благотворное влияние на воспроизводительные функции птицы и свиней.
В настоящее время во многих странах при кормлении продуктивных животных и птицы используют синтетический лизин (моногидрохлорид лизина). Замена синтетического лизина, который в основном импортного производства, на симбиоти-ческие препараты является основной причиной разработки технологии производства препаратов, которые будучи введенными в желудочно-кишечный тракт животных и птицы продуцируют одну из незаменимых аминокислот - лизин.
Альтернативным подходом к решению проблемы восполнения дефицита незаменимой аминокислоты в рационах кормления бройлеров высокопродуктивных кроссов является использование сим-биотических препаратов, которые в тонком отделе кишечника, вступают в симбиоз внутри организма, синтезируют достаточное количество необходимого для макроорганизма лизина [13, 14, 15, 16, 17,18].
Цель работы - разработка технологии промышленного производства симбиотического препарата Пролизэр на основе Escherichia coli VL-613 -продуцента незаменимой аминокислоты лизина.
В соответствии с поставленной целью решались задачи:
- оптимизации технологии культивирования Escherichia coli VL-613 для получения симбиотиче-ского препарата Пролизэр, основанная на оптимизации состава питательной среды и управляемого глубинного культивирования Escherichia coli VL-613;
- оптимизации условий сохранения жизнеспособности Escherichia coli VL-613 в симбиотиче-ском препарате Пролизэр, которая основывалась на определение влияния продолжительности хранения препарата перед концентрированием на сохранение
жизнеспособности Escherichia coli VL-613 и оптимизации состава защитной среды высушивания, используемой при изготовлении симбиотического препарат Пролизэр.
Материалы и методы
При исследовании основных технологических процессов промышленного производства сим-биотического препарата использовали E. coli VL-613.
E. coli VL-613, регистрационный номер коллекции - В - 3423, уровень синтеза лизина до 6 мкг/мл, способен размножаться в пищеварительном тракте сельскохозяйственных животных и птиц, штамм не патогенен.
Культивирование эшерихий проводили на питательных средах, основой которых являлся перевар Хоттингера.
Культуру эшерихий выращивали в пробирках и флаконах на шуттель-аппарате, а также в лабораторных установках АНКУМ-2М емкостью 10 литров, которые оснащены системами автоматического контроля и регулирования основных параметров культивирования:
- температура;
- рН;
- парциальное давление растворенного кислорода ( рО2);
- окислительно-восстановительный потенциал (еН);
- расход воздуха на аэрацию;
- скорость вращения мешалки;
- оптическая плотность бактериальной суспензии.
Содержание рН в культуральной жидкости определяли потенциометрически, уровень растворенного кислорода рО2 - датчиками изготовленными в СКБ БП (г. Пущино), еН - потенциометрически с использованием электродов с ионной проводимостью типа ЭО - 01.
Оптическую плотность культуры E. coli VL-613 измеряли на фотоколориметрах ФЭК - 56, ФЭК - 60, КФК - 2 и блоке оптической плотности аппарата АНКУМ - 2М.
Морфологию E. coli VL-613 определяли путем микроскопирования мазков, окрашенных по Граму. Культуральные свойства - путем высева культуры на мясо-пептонный агар (МПА) и мясо-пептонный бульон (МПБ). Жизнеспособность E. coli VL-613 определяли методом последовательного десятичного титрования на чашках Петри с мясопеп-тонным агаром.
Для определения длительности фаз роста E. rnli VL-613, максимальной удельной скорости, минимальной продолжительности удвоения (генерации) использовали графический метод.
Замораживание готового препарата производили в холодильных установках ЛСШ-28, а потом высушивали в сублиматоре ТГ-50. Процесс сублимационного высушивания препарата проводили в ранее отработанном режиме по «Методике расчета режимных параметров сублимационной сушки биопрепаратов».
Экспериментальные образцы симбиотического препарата испытывали на безвредность на белых мышах и цыплятах.
Препарат считают безвредным, если цыплята опытной и контрольной групп остаются живыми и клинически здоровыми при наблюдении за ними в течение 10 суток.
Для оптимизации технологических этапов производства препаратов использовали методы математического планирования: метод Гаусса - Зайде-ля, дробный или полный факторный эксперимент (ДФЭ или ПФЭ) типа 2 п и метод «крутого» восхождения, где n - число факторов.
Оптимизация состава питательной среды для управляемого процесса культивирования E. coli VL-613. На начальном этапе разработки питательной среды для глубинного управляемого культивирования E. coli VL-613 за математическую модель была выбрана среда для выращивания сальмонелл разработанная ГНУ «ВНИТИБП» РАСХН, патент РФ № 2129016 «Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных».
Питательную среду (математическая модель) готовили по прописи, масс. %;
- перевар Хоттингера - 18,0 - 22,0;
- пептон - 0,4 - 0,6;
- натрий фосфорнокислый двузамещенный -0,3 - 0,6;
- хлористый натрий - 0,7 - 0,9;
- вода дистиллированная - до 100,0.
Готовая стерильная питательная среда содержит 160 - 180 мг % аминного азота, рН 7,4 - 7,6.
При проведении культивирования в ферментере на данной питательной среде было небольшое накопление E. coli. VL-613, поэтому было принято решение по оптимизации данной питательной среды.
Предварительно работу по оптимизации питательной среды для выращивания E. coli проводили во флаконах с перемешиванием на шуттель-аппарате со скоростью 120 об/мин.
При проведение опыта во флаконах на контрольной питательной среде взятой за основу, как математическая модель, накопление эшерихий составило 1,8 - 2,2 млрд. м.к.
Зная, что питательная среда для эшерихий нуждается в витаминах группы В, в её состав необходимо ввести дрожжевой экстракт, который является хорошим источником витаминов этой группы.
Для оптимизации состава питательной среды использовали ПФЭ 23.
Критерием оптимизации (У) служило накопление жизнеспособных эшерихий в культуральной жидкости, так как для изготовления симбиотическо-го препарата используются живые клетки. В качестве основных факторов по оптимизации питательной среды исследовали следующие компоненты:
Х1 - концентрация пептона;
Х2 - концентрация фосфорнокислого двуза-мещенного натрия;
Х3 - концентрация дрожжевого экстракта.
В таблице 1 представлен план ПФЭ 23.
После реализации экспериментов по плану ПФЭ и статистической обработке данных получили уравнение регрессии (1), связывающее накопление жизнеспособных эшерихий в культуральной жидкости и концентрацию основных компонентов питательной среды, которое адекватно описывает экспериментальные данные (Ррас. = 2,25 < Бтеор. = 4,10).
У =2,477 + 0,240Х1 + 0,115Х2 +
+ 0,306Х3 + 0Д44Х1Х3 -- 0,065Х2Х3 + 0,073 Х^2Х3 (1).
Таблица 1 - План ПФЭ 23 в кодированной и натуральной размерностях и накопление жизнеспособных эшерихий в питательных средах при культивировании
Таблица 2 - План при «крутом» восхождении в кодированной и натуральной размерностях и накопление жизнеспособных эшерихий в питательных средах при культивировании
№ опыта Кодированная размерность факторов Натуральная размерность факторов Накопление эшерихий (Уср), млрд/см3
Х1 Х2 Х3 Концентрация пептона, % Концентрация натрия фосфорнокислого двуза-мещенного, % Концентрация дрожжевого экстракта, %
1 - - - 0,4 0,5 0,2 1,82
2 + - - 0,8 0,5 0,2 2,33
3 - + - 0,4 0,7 0,2 2,17
4 + + - 0,8 0,7 0,2 2,37
5 - - + 0,4 0,5 0,4 2,42
6 + - + 0,8 0,5 0,4 2,38
7 - + + 0,4 0,7 0,4 3,05
8 + + + 0,8 0,7 0,4 3,28
Х01 0,6 0,6 0,3
ДХ1 0,2 0,1 0,1
Исходные данные и результаты опытов по определению влияния компонентов питательной среды на рост эшерихий при «крутом» восхождении представлены в таблице 2.
На рисунке 1 представлены данные зависимости накопления E. coli VL-613 от состава компонентов питательной среды по плану ПФЭ и крутого восхождения.
Результаты опытов 9 - 13 (табл. 2) показали, что движение по градиенту эффективно, так как достигнутое в опытах 9 - 13 накопление жизнеспособных E. coli VL-613 (3,34 - 3,39 млрд/см3) равно или больше накопления в опыте № 8 (3,28 млрд/см3) - лучшего в матрице планирования ПФЭ 23 (табл. 1).
Культивирование E. coli VL-613 на оптимизированной питательной среде показало, что разработанная питательная среда имеет высокие ростовые свойства, накопление жизнеспособных эшери-хий на разработанной питательной среде составило 3,34 - 3,39 млрд/см3 по сравнению с контрольной, у которой накопление - не более 1,8 - 2,2 млрд/см3.
Х1 Х2 Х3 Концентрация пептона, % Концентрация натрия фосфорнокислого двуза-мещенного, % Концентрация дрожжевого экстракта, % Накопление эшерихий (Уср), млрд/см3
9 + + + 0,8 0,7 0,4 3,34
10 + + + 1,0 0,8 0,5 3,38
11 + + + 1,2 0,9 0,6 3,39
12 + + + 1,4 1,0 0,7 3,14
13 + + + 1,6 1,1 0,8 3,10
Х01 0,6 0,6 0,3
ДХ1 0,2 0,1 0,1
По результатам принято решение об окончании процесса поиска оптимальных концентраций основных компонентов ПС для культивирования E.
coli.
4
13,5
S 3 у5
X
о
И 2
О
£1,5 1
0,5 0
3, >8 3, 34 3, 38 3, 39
3, 14 3
N
2, 2, ¡7 2, '2 2, 7
1, 17 2,
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
номер питательной среды Рис. 1 - Зависимость накопления E. coli VL-613 от состава компонентов питательной среды по плану ПФЭ 23 и крутого восхождения.
Рекомендуемая питательная среда для культивирования E. coli VL-613 на основе перевара Хот-тингера, имеет следующий состав, мас, %:
- перевар Хоттингера - 18,0 - 22,0;
- пептон - 0,8 - 1,2;
- натрий фосфорнокислый двузамещенный -0,7 - 0,9;
- хлористый натрий - 0,7 - 0,9;
- глюкоза - 15 - 0,25;
- дрожжевой экстракт - 0,4 - 0,6;
- вода дистиллированная - до 100,0.
Во всех исследованных образцах E. coli штамма VL-613, полученных на оптимизированной питательной среде, морфология, культуральные и
биохимические свойства были типичными для этого штамма, выращенного как во флаконах, так и ферментерах.
Разработка управляемого процесса глубинного культивирования E. coli VL-613. Задача разработки управляемого процесса культивирования заключается в следующем: подбор оптимальных условий, использовали метод математического планирования Гаусса - Зайделя. обеспечивающих достижение максимально возможного результата в промышленном аппарате на основе данных, полученных на пилотной установке.
Предварительно работу по оптимизации основных параметров культивирования эшерихий проводили во флаконах с перемешиванием на шут-тель-аппарате и аппарате АНКУМ - 2М. Для определения оптимального значения параметров культивирования (рО2, рН, еН) провели эксперименты с использованием метода математического планирования Гаусса - Зайделя.
По результатам оптимизации параметров культивирования принят следующий алгоритм выращивания E. coli VL-613. В ферментер с оптимизированной питательной средой инокулируют 18 - 24-часовую матриксную культуру E. coli VL-613, выращенную в питательной среде по составу аналогичному со средой культивирования. Соотношении матриксной культуры 5 - 10 % от объема питательной среды в ферментере, и культивируют при 37 ± 1 °С в течение 4 - 6 часов.
После засева ферментера еН культуральной жидкости снижают до минус 100 - минус 80 мВ, путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до окончания процесса культивирования с помощью изменения расхода воздуха на аэрацию и скоростью вращения мешалки поддерживают рО2 в культу-ральной жидкости на уровне 20 ± 5 % от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют на уровне 7,2 - 7,4 подачей 10 % раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,1 - 0,2 % при лимитировании роста эшерихий глюкозой, характеризующемся резким повышением рО2 при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости.
Динамика основных параметров управляемого культивирования E. coli, штамма VL-613, на разработанной питательной среде приведена на рисунке 2.
Как показали результаты опытов, накопление жизнеспособных E. coli VL-613, составило 16,6 млрд/см3 через 4 - 6 часов культивирования. При этом фаза приспособления продолжалась 0,15 часа, а лог-фаза - 2,2 часа. Максимальная удельная скорость роста популяции E. coli VL-613 составила -1,64 час-1, а время удвоения - 0,42 часа.
Разработанная питательная среда и управляемый режим культивирования E. coli VL-613 вошли в патент RU № 2450051 от 18.08.2010 г. «Способ получения симбиотического препарата на основе Escherichia coli VL - 613».
Рис. 2 - Динамика основных параметров управляемого культивирования E. coli штамма VL-613 на разработанной питательной среде рО2 - парциальное давление растворенного кислорода; рН - концентрация водородных ионов; еН - окислительно-восстановительный потенциал; о/п - оптическая плотность; т - продолжительность культивирования; j - подача глюкозы
Литература
1. С. Гулюшин, Н. Садовникова, И. Рябчик. Актуальные проблемы биологии в животноводстве: материалы V Международной научной конференции. Боровск. С. 283-284 (2010).
2. В. И. Фисинин, Егоров И.А., Имангулова Ш.А. Использование пробиотиков, пребиотиков и симбиотиков в птицеводстве. Метод. реком. Сергиев Посад: ВНИТИП, 44 с. (2008).
3. А.Н. Панин, Н.И. Малик, Е.В. Малик . Материалы I Международного ветеринарного конгресса по птицеводству. М. С. 235-239 (2005).
4. Л.В. Римарева. Материалы V Межд. научно-практической конференции «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов». М. С. 3 - 7 (2012).
5. В.В. Смирнов, Н.К. Коваленко, В.С. Подгорский. Микробиология. Т. 64. №4. С. 62-80 (2002).
6. В.В. Субботин, Н.В. Данилевская. Материалы I Международного ветеринарного конгресса по птицеводству. М. С. 239-241 (2005).
7. R.J. Farrell, J.T. LaMont. Microbial factors in inflammatory bowel disease. Gastroenterol Clin North Am. Vol.3. Р. 41-62 (2002).
8. M.H. Floch, J.Hong-Curtiss. Probiotics and functional foods in gastrointestinal disorders. Curr. Gastroenterol. Rep. Vol. 3. Р. 343-350 (2001).
9. И.В. Павленко, А. Гринь, В. Меньшенин, И. Егоров, И. Салеева, А. Иванов, Д. Ефимов. Журнал «Птицеводство». Москва. № 6. С. 19-22 (2012).
10. В.И. Фисинин, И.А. Егоров, Т.М. Околелова, Ш.А. Имангулов. Кормление сельскохозяйственной птицы. Сергеев Посад: Издательство ВНИТИП, 360 с. (2002).
11. В.И. Фисинин, В.С. Лукашенко, И.П. Салеева. Технология производства мяса бройлеров. Сергиев Посад. 252 с. (2008).
12. А.Я. Самуйленко, И.В. Павленко, А.А. Раевский, С.А.
Гринь, И.А. Егоров, Е.Н. Андрианова. Вестник Росс. академии сельскохоз. наук. № 4. С. 64 - 66 (2012).
13. Л. Эрнст, А. Самуйленко, Е. Школьников, В. Меньше-нин, И. Павленко, А. Раевский, Е. Рахманина, И. Егоров, Е. Андрианова, И. Салеева. Птицеводство. М. № 4. С. 35-36 (2011).
14. А.Я. Самуйленко, И.В. Павленко, А.А. Раевский, С.А. Гринь, И.А. Егоров, Е.Н. Андрианова. Вестник Росс. академии сельскохоз. наук.. № 4. С. 64 - 66 (2012).
15. А.Я. Самуйленко, Е.Э. Школьников, А.А. Раевский, И.В. Павленко, В. В. Меньшенин. Свиноводство. М. № 1. С. 4243 (2012).
16. А.Я. Самуйленко, Л.К.. Эрнст, Е.Э. Школьников, А.А.Раевский, Л.К. Эрнст, Л.В. Анисимова, Л.А. Коротее-ва, И.В. Павленко, И.И. Чеботарев, С.А. Гринь, Н.А. Бондарева Патент Ш № 2450051, (2012).
17. Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Еремец Н.К., Провоторова О.В., Бобровская И.В., Малышева М.А., З.А. Канарская. Вестник Каз. технол. ун. Т. 15. № 4. с. 82 -87. (2012).
18. Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Титова Е.И., Прово-торова О.В., Еремец Н.К., Бобровская И.В., З.А. Канарская. Вестник Каз. технол. ун. Т. 15. № 4.с. 69 - 74. (2012).
© И. В. Павленко - канд. биол. наук, зав. экспериментально-производственной лаб. отдела бактерийных препаратов, ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, polt65@yandex.ru; А. Я. Самуйленко - д-р ветер. наук, проф., академик РАСХН, академик НААН Украины, директор ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, vnitibp@mail.ru; В. И. Еремец - д-р биол. наук, проф., зам. директора ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, Ь^_74@ mail.ru; А. А. Нежута - д-р биол. наук, зав. отделом сушки изготовления биопрепаратов, ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, vnitibp@mail.ru; З. А. Канарская - канд. тех. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, zosya_kanarskaya@mail.ru; А. В. Канарский - д-р техн. наук, проф. той же кафедры, alb46@mail.ru.
