CC BY
16
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
честве солевой основы использовали среду Ледерберга. В качестве источника аминокислот применяли: амино-пептид, панкреатический пептон казеиновый, кислотный гидролизат казеина, а также соевый пептон. Глюкозу и минеральные соли стерилизовали при 1 атмосфере в течение 30 минут. Витамины стерилизовали фильтрованием. Культивирование штамма проводилось в бактериологических пробирках, содержащих по 30 мл питательной среды. В каждую пробирку засевали 0,2 мл посевной культуры. Выращивание осуществляли в течение 24 и 96 часов при температуре 37 °C в термостате с 5% подачей CO2. Посевные дозы составили 1,1 и 0,67 млрд/мл соответственно. Для определения динамики роста штамма и накопления им КПС проводили культивирование в ферментере объемом 10 л. Посевная доза составила 0,125 млрд/мл. Каждый час в течение 16 часов, а также спустя 24 часа проводили контроль оптической плотности и измерение pH. Накопление КПС оценивали при помощи ракетного иммуноэлектрофореза формалинизированных проб культуральной жидкости. В качестве референс-препарата использовали очищенный КПС.
Проведенные исследования показали, что наиболее высокий уровень КПС наблюдался при щелочном значении pH в тех питательных средах, в которых источниками являлись пептоны (среда с соевым пептоном — концентрация КПС от 20,1±2,5 до 28,0±4,3 мкг/мл; среда с казеиновым пептоном — от 16,8±2,1 до 26,4±5,3 мкг/мл) независимо от длительности культивирования. При выращивании в средах, содержащих другие источники белка, было выявлено незначительное накопление КПС (среда с кислотным гидролизатом казеина — от 2,4±0,8 до 7,8±1,5 мкг/мл; с аминопептидом — от 1,8±0,8 до 6,5±1,5 мкг/мл). Схожие данные были получены при выращивании в средах с пониженным значением pH. Вместе с тем выявлено, что выраженную продукцию КПС позволило получить использование в качестве источника аминокислот аминопептида (10,4±1,3 мкг/мл). Вероятно, наблюдавшееся спустя 96 часов снижение уровня КПС по сравнению с результатами через 24 часа произошло в результате действия ферментов S. pneumoniae, либо является следствием более низкой посевной дозы. При выращивании штамма в ферментере с использованием полусинтетической среды, содержащей соевый пептон, содержание КПС спустя 24 часа составило около 160 мкг/мл.
Таким образом, выращивание S. pneumoniae сер.3 в ферментере в течение 24 часов в полусинтетической питательной среде, содержащей соевый пептон, позволяет получить КПС в концентрации 22 мкг/мл.
вклад иммунной системы в регенераторное влияние продуцируемых мезенхимальными стромальными клетками микровезикулярных частиц
Белогородцев С.Н., Кащенко Э.А., Селедцова Г.В.
Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии, Новосибирск, Россия
Исследования последних лет показали, что цитопро-тективное действие мезенхимальных стромальных клеток (МСК) обусловлено не процессами их хоминга и диф-ференцировки, а стимуляцией эндогенной регенерации резидентных клеток. Одним из механизмов подобного действия, кроме секреции цитокинов и факторов роста,
могут быть микровезикулярные частицы (МВ), которые осуществляют транспорт мРНК, микроРНК и сигнальных белков.
Цель. Изучить прорегенераторные свойства МВ, продуцируемых МСК и возможное участие в этом иммунной системы.
МСК получали из костного мозга лабораторных мышей путем прилипания к культуральному пластику. Для получения МВ, МСК подвергали апоптозу путем культивирования в условиях депривации кислорода и в бессывороточной среде в течение 1 суток. МВ получали из культуральной среды апоптотических клеток после предварительного удаления клеточного дебриса и последущем центрифугировании при 100 000 g в течение 60 минут. Для стандартизации суспензии МВ определяли содержание белка по методу Брэдфорда.
Для исследования влияние МВ на регенерацию тубу-лярного почечного эпителия in vivo у линейных мышей путем внутримышечного введения 50% глицерола была индуцирована острая почечная недостаточнось (ОПН). МСК или МВ вводили в внтривенно через 24 часа после индуцирования ОПН. Животные были разделены на 3 группы: ОПН-контроль, ОПН+МСК, ОПН+МВ.
Почечные эпителиоциты и спленоциты получали из гомогенатов соответствующих органов. Суспензию клеток почки пропускали через фильтр с диаметром пор 40 мкм, что позволяло избавиться от гломерул и клеточных агрегатов, и культивировали в течение 2-х недель, что позволяло получить гомогенную популяцию клеток.
После индукции ОПН, уровень мочевины плазмы крови повышался у мышей на 4-е сутки в контрольной группе в 2 раза (12,43 мкг/мл против 6,59 мкг/мл у ин-тактных мышей) и снижался к 8-м суткам до 9,64 мкг/мл. Использование МСК и МВ приводило практически к одинаковому результату: на 4-е сутки уровень мочевины составил 9,3 и 9,37 мкг/мл соответственно, что на 25% ниже, чем в глицерол-контроле. К 8-м суткам уровень мочевины составил 7,9 мкг/мл после введения МСК и 7,6 мкг/мл после введения МВ, что на 21% ниже, чем в глицерол-контроле.
Уровень пролиферации спленоцитов в тесте с Н3-ти-мидином составил 118 имп/мин, Кон А-стимулированная пролиферация составила 1208 им/мин. Культивирование в присутствии МВ в дозе 10 мкг/мл повышало пролиферативную способность спленоцитов почти в 3 раза (342 имп/мин — спонтанная, 3889 имп/мин — Кон А-стимулированная). Стимулирующий эффект на пролиферацию повышался, хоть и не пропорционально) с увеличение дозы МВ: 475 имп/мин — спонтанная и 4667 имп/мин — Кон А-стимулированная при добавлении МВ в дозе 30 мкг/мл; 492 имп/мин — спонтанная и 5012 имп/мин — Кон А-стимулированная при добавлении МВ в дозе 90 мкг/мл.
Аналогичный эффект наблюдался в отношении ПЭ. Добавление МВ в культуральную среду на 3 суток в дозе 10 мкг/мл повышало пролиферацию ПЭ в 4 раза (254 имп/мин против 65 имп/мин в контроле). Увеличение дозы МВ также повышало пролиферацию ПЭ: 337 имп/мин при дозе МВ 30 мкг/мл и 392 имп/мин при дозе МВ 90 мкг/мл.
Влияние МВ на апоптогенное действие доксируби-цина на спленоциты определяли в тесте с окраской про-пидум иодидом. При этом использовали спленоциты как от интактных мышей, так и от мышей с глицерол-инду-цированной ОПН. Интересно, что сама по себе индук-
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
ция ОПН вызывает уменьшение количества апотозных спленоцитов почти в 2 раза (16,3% против 29,17% у ин-тактных мышей). Добавление МВ вызывает снижение уровня апоптоза как у интактных мышей (21,73%), так и мышей с ОПН (13,28%). Соответственно, обратно пропорционально увеличивался процент клеток, находящихся в S/M фазе клеточного цикла.
Полученные в результате эксперимента in vivo разуль-таты показали, что внутривенное введение как МСК, так и МВ, продуцируемых МСК, в одинаковой степени приводит к более раннему восстановлению выделительной функции почек после глицерол-индуцированной ОПН. Это говорит о том, что про-регенераторное действие МСК в значительной степени, если не полностью, обусловлено продуцируемыми ими микровезикулярными частицами. Указанное действие МВ подтверждается результатами in vitro — продуцируемые МСК микровезикулярные частицы усиливали пролиферацию ПЭ, причем при увеличении дозы МВ это влияние усиливалось. Аналогичное действие МВ оказывают на клетки иммунной системы: in vitro отмечается дозозависимое усиление пролиферции спленоцитов и увеличение их устойчивости к влиянию апоптогенных факторов. Таким образом, продуцируемые МСК микровезикулярные частицы оказывают иммуностимулирующее действие. Этот результат противоречит литературным данным, что при ОПН, независимо от генеза, наблюдается активация иммунной системы, приводящая к усилению повреждения и про-регенераторное действие МСК обусловлено их иммуносупрессорным действием. Указанные результаты требуют дальнейших исследований о влиянии МВ на функции иммунной системы in vivo.
влияние nk-клеток на ангиогенез в присутствии фактора роста эндотелия сосудов
Белякова К.Л.1, Шевелева А.Р.1, Сельков С.А.1, Соколов Д.И.1' 2
1ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург, Россия 2 ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
Введение. Физиологическое функционирование органов и тканей организма невозможно без адекватного снабжения их кислородом, питательными веществами и удаления из них продуктов обмена, которое осуществляется при помощи разветвленной сети кровеносных сосудов. Формирование сосудов является важнейшим процессом, протекающим в организме человека, каждый этап которого зависит от характера взаимодействия эн-дотелиальных клеток (ЭК) с клетками микроокружения, а также от баланса между стимуляторами и ингибиторами ангиогенеза, основными источниками которых являются клетки иммунной системы. Естественные киллеры — важнейшая популяция клеток иммунной системы, обладающая цитотоксическими функциями и участвующая в защите организма от вирусов и трансформированных клеток. Помимо этого, естественные киллеры являются источниками различных цитокинов и факторов роста, которые могут оказывать влияние на ангиогенез. В связи с этим изучение взаимодействий эндотелиальных клеток
и естественных киллеров является актуальной задачей современной биологии и медицины.
Цель. Изучить влияния естественных киллеров на формирование капилляроподобных структур ЭК в присутствии фактора роста эндотелия сосудов.
Материалы и методы. В работе использовали ЭК линии ЕА.Ну926 и естественные киллеры линии NK-92mi. В лунки 24-луночного планшета с трехмерным матриксом Ма1^е1 (BD, США) вносили ЭК, к части лунок добавляли клетки линии NK-92mi либо непосредственно в лунку к ЭК (контактное культивирование), либо в поликарбонатную вставку с диаметром пор 0,1 мкм (дистантное культивирование), инкубировали в течение 24 часов. Для активации клеток использовали VEGF в различных концентрациях. При помощи микроскопа AxioObserver.Z1 и компьютерной системы анализа изображений оценивали длину и количество образованных капилляроподобых структур.
Результаты. Установлено, что при контактном и дистантном культивировании ЭК с NK-клетками как в присутствии VEGF, так и в его отсутствие наблюдали увеличение длины и снижение количества капилляроподобных структур по сравнению с монокультивированием ЭК. Количество тяжей снижалось при контактном культивировании ЭК с NK-клетками в присутствии VEGF в концентрации 100 нг/мл по сравнению с контактным культивированием ЭК с NK-клетками без VEGF. При дистантном культивировании ЭК с NK-клетками отмечали снижение длины капилляроподобных структур как в присутствии, так и в отсутствие VEGF по сравнению с контактным культивированием ЭК с NK-клетками. При дистантном культивировании ЭК с NK-клетками в присутствии VEGF в концентрации 1 нг/мл наблюдали снижение длины и увеличение количества клеточных тяжей по сравнению с контактным культивированием ЭК с NK-клетками в присутствии VEGF в той же концентрации. При дистантном культивировании ЭК с NK-клетками в присутствии VEGF наблюдали дозозависимое увеличение длины клеточных тяжей по сравнению с дистантным культивированием ЭК с NK-клетками без VEGF.
Вывод. Естественные киллеры за счет секреторной активности и контактного взаимодействия с ЭК влияют на формирование капилляроподобных структур эндоте-лиальными клетками.
модуляция функциональной активности комплемента антимикробными пептидами животных
Берлов М.Н.1' 2, Умнякова Е.С.1, Кокряков В.Н.1 2
1 ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
Введение. Неконтролируемая или избыточная активация системы комплемента вносит существенный вклад в патогенез многочисленных заболеваний. Отсутствие доступных терапевтических средств, направленных на регуляцию комплемента, представляет собой серьезную медицинскую проблему. В настоящее время в клиническую практику внедрены всего два ингибитора комплемента, относящихся к числу наиболее дорогих лекарстве в мире. В качестве возможного источника новых более дешевых лекарственных средств, модулирующих актив-
