CC BY
19
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
Заключение. Признанной стратегией фармакотерапии при пневмофиброзе является коррекция локальных проявлений оксидативного стресса (Walters D.M., Cho H.Y, 2014). Полученные нами результаты согласуются с данной стратегией, расширяя возможности для создания на основе Эхинохрома А официнального препарата для патогенетической и сопроводительной терапии в детской пульмонологической и онкологической практике.
ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ БИОПЛЕНКИ НА ФОРМИРОВАНИЕ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛОВУШЕК
Долгушин И.И., Шишкова Ю.С., Колесников О.Л., Пичугов С.М., Галагудин И.В.
ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет», Челябинск, Россия
Введение. Первой линией защиты от микроорганизмов выступает врожденная противоинфекционная система макроорганизма, самыми многочисленными клетками которой являются нейтрофилы. Нейтрофилы, выходя из периферической крови в ткани и на поверхность слизистых оболочек, участвуют в антимикробных и воспалительных реакциях. Известно, что бактерии сосуществуют в виде биопленки, обладая повышенной по сравнению с планктонными культурами устойчивостью к экстремальным физико-химическим условиям среды и биологическим факторам (неблагоприятной температуре, рН, концентрации соли, антимикробным веществам, фагоцитозу). Несмотря на многочисленные исследования антибиопленочных реакций врожденного иммунитета роль внеклеточного матрикса в формировании нейтро-фильных внеклеточных ловушек остается невыясненной.
Цель. Определить влияние бактериальной биопленки на формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек.
Задачи. 1) Оценить in vitro влияние планктонной культуры E. coli и ее биопленки на формирование нейтрофиль-ных внеклеточных ловушек. 2) Определить in vivo способность нейтрофильных гранулоцитов к формированию нейтрофильных внеклеточных ловушек до и после хирургической обработки инфицированной ожоговой раны.
Материалы и методы. Для решения первой задачи использовали взвесь суточной и 3-суточной культуры E. coli и нейтрофилы, выделенные из периферической крови условно-здоровых доноров на двойном градиенте фиколла-верографина. Исследование проводили в 5 повторах. Результаты взаимодействия изучали с помощью люминесцентной микроскопии при окраске акридиновым оранжевым. Для решения второй задачи было проведено цитологическое исследование препаратов раневого отделяемого, окрашенных по Романовскому—Гимзе, до и после выполнения хирургической обработки ожоговых ран 15 пациентов с помощью аэрозольной струи 0,05% раствора хлоргексидина биглюконата под давлением воздушного потока. В цитологических препаратах изучали содержание нейтрофильных гранулоцитов в поле зрения и определяли процентное содержание нейтрофильных внеклеточных ловушек от 100 просмотренных морфологических форм нейтрофилов с помощью световой микроскопии при увеличении 100x10x2. Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке.
Результаты. В результате проведенных исследований установили, что после 3-минутного взаимодействия су-
точной культуры E. coli со взвесью донорских нейтро-филов происходило формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек, через 30 минут совместного культивирования in vitro 95% нейтрофильных гранулоцитов экстрагировали свою ДНК. Иначе выглядела морфология нейтрофильных гранулоцитов при взаимодействии с 3-суточной культурой E. coli. В препаратах микроорганизмы были представлены плотно упакованными клетками, напоминающими кукурузные початки, а нейтрофилы сохраняли морфологию сегментоядерных гранулоцитов в течение 40 минут наблюдения и не формировали ней-трофильные внеклеточные ловушки.
При изучении цитологических препаратов раневого отделяемого до проведения хирургической обработки в поле зрения визуализировалось 9,01±1,38 нейтрофилов, после обработки 4,94±0,88 (р = 0,04). Процентное содержание нейтрофильных внеклеточных ловушек до обработки составляло 40,94±5,55%, а после - 59,91±5,70% (р = 0,01)
Заключение. Таким образом, при взаимодействии биопленки E. coli и нейтрофильных гранулоцитов в эксперименте in vitro показано отсутствие формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек. В то же время на примере использования хирургической обработки инфицированной ожоговой раны, при которой происходит механическое разрушение биопленки аэрозольной струей, высвобождение планктонных форм микроорганизмов и представление незащищенных бактериальных клеток тканевым нейтрофилам, было обнаружено интенсивное формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек.
ВЛИЯНИЕ САПОЗИНА D НА ФОРМИРОВАНИЕ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ
Евстифеев В.В., Шепелькова Г.С., Еремеев В.В.
ФГБНУ «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза», Москва, Россия
Сапозины (Sap) — подгруппа гликопротеинов большого семейства сапозин-подобных белков. Сапозины A, B, C и D образуются в кислых эндосомах путем расщепления просапозина (pSap). Сапозины участвуют в процессе презентации антигенов микобактерий на молекулах CD1. Ранее было показано, что макрофаги, полученные от мышей-нокаутов по гену pSAP, подавляли рост M. tuberculosis слабее, чем макрофаги мышей дикого типа. При добавлении к культуре клеток реком-бининтного человеческого сапозина D (Sap-D) наблюдалось полное восстановление функций макрофагов. При инкубации M. tuberculosis с рекомбинантными Sap наблюдалось подавление метаболизма бактерий, причем наибольшей активностью обладал Sap-D. Методами флуоресцентного мечения и электронной микроскопии было обнаружено повреждающее действие Sap-D на мембрану M. tuberculosis. Результаты экспериментов, проведенных в лаборатории, позволяют сделать вывод, что Sap-D является важным компонентом в формировании иммунного ответа к туберкулезу (ТБ). Однако неясно как влияет дефицит Sap-D на формирование противотуберкулезного иммунного ответа in vivo у мышей при экспериментальной туберкулезной инфекции.
Мышей C57BL/6 (B6) и B6.Sap-D-/- аэрозольно инфицировали вирулентным штаммом M. tuberculosis H37Rv. Через 3 и 5 недель после инфицирования исследовали степень поражения легочной ткани и рост микобактерий в легком.
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Было показано, что у B6.Sap-D-/- микобактериальная нагрузка легочной ткани и селезенки достоверно выше, чем у мышей В6 как через три, так и через пять недель после инфицирования. Анализ клеточного состава легочной ткани показал, что для «наивных» Sap-D-/- по сравнению с мышами дикого типа (В6) характерно меньшее количество макрофагов как в легочной ткани, так и в селезенке. Причем через три недели после инфицирования M. tuberculosis H37Rv содержание макрофагов у нокаутов по сапозину D и мышей дикого типа в легких выравнивается, а в селезенке различия сохраняются. Через пять недель после инфицирования количество макрофагов у мышей нокаутов достоверно выше, чем у В6. Также было показано, что через пять недель после заражения мыши B6.Sap-D-/-отличаются от мышей дикого типа большей инфильтрацией легочной ткани, большим количеством нейтрофилов. Исследование чувствительности к апоптозу клеток легочной ткани Sap-D мышей и мышей дикого типа показало, что содержание апоптотических клеток в легких мышей нокаутов по сапозину D через три и пять недель после инфицирования достоверно выше, чем у мышей линии В6.
Итак, дефицит Sap-D существенно усиливает воспаление при экспериментальной туберкулезной инфекции, а также влияет на предрасположенность к апоптозу.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 15-04-05519).
УРОВЕНЬ ЦИТОКИНЕМИИ ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ У КРЫС И ЕГО КОРРЕКЦИИ СОЕДИНЕНИЕМ РЯДА 1,3,4-ТИАДИАЗИНА
Емельянов В.В.1, Булавинцева Т.С.1, 2, Сидорова Л.П.1, Цейтлер Т.А.1, Чупахин О.Н.1, Черешнев ВА.1, 2
1ФГАОУ ВО «Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б.Н. Ельцина», Екатеринбург, Россия
2 ФГБУН«Институт иммунологии и физиологии УрО РАН», Екатеринбург, Россия
Введение. Метаболические нарушения при сахарном диабете (СД) в эксперименте и клинике существенно изменяют продукцию про- и антивоспалительных цитокинов клетками иммунной системы. Выявлена роль провоспали-тельных цитокинов в повреждении сосудистого эндотелия и развитии диабетических ангиопатий. Предшествующими исследованиями показана способность соединений ряда 1,3,4-тиадиазина корригировать метаболические нарушения при аллоксановом СД у крыс, а также изменять течение воспалительной реакции при экспериментальном панкреонекрозе и инфаркте миокарда.
Цель и задачи. Оценить уровень цитокинемии при развитии аллоксанового СД у крыс и его коррекции соединением ряда 1,3,4-тиадиазина.
Материалы и методы. Эксперименты выполнены на 30 крысах-самцах линии Wlstar массой 210-250 г в соответствии с этическими нормами Директивы Совета ЕС 2010/63. СД моделировали введением аллоксана по ранее разработанной методике в течение 3 суток в суммарной дозе 300 мг/кг массы животного. Синтетическое соединение L-17 ряда 1,3,4-тиадиазина и вещество сравнения липоевую кислоту (ЛК, препарат «Октолипен», Россия) вводили внутримышечно в дозе 40 мг/кг массы животного 3 раза в неделю в течение 4 недель. На 30-е сутки эксперимента в крови крыс определяли содержание интерлей-кинов (Щ) ГЬ-1а, Ш-6 и ГЬ-10 методом ИФА наборами
фирмы «Thermo Scientific» на автоматическом анализаторе «LAZURITE AUTOMATED ELISA SYSTEM».
Результаты. Развитие СД у крыс приводило к статистически значимому повышению концентрации IL-1a, IL-6 и IL-10 от 1,1 до 3,6 раз по сравнению с интактными животными. Введение ЛК частично корригировало показатели цитокинемии, снижая концентрации IL-6 и IL-1a до уровня интактных животных, при этом концентрация IL-10 продолжала оставаться повышенной. Наиболее полной коррекции цитокинемии удалось достичь соединением IL-17, введение которого приводило к снижению концентраций всех исследованных цитокинов до уровня интактных крыс.
Заключение. Полученные результаты свидетельствуют об участии иммунологических механизмов в корригирующем действии соединения ряда 1,3,4-тиадиазина при аллоксановом СД у крыс.
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № проекта 16-15-00039.
ВЛИЯНИЕ АУТОПРОБИОТИКОВ НА ИММУНИТЕТ ПРИ КОРРЕКЦИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДИСБИОЗА
Ермоленко Е.И.1, 2, Котылева М.П.1, Кудрявцев И.В.1, Лавренова Н.С.1, Крамская Т.А.1, Леонтьева Г.Ф.1, Куляшова Л.Б.3, Суворов А.Н.1, 2
1 ФГБУН «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
3 Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург, Россия
Дисбиоз кишечника корректируется при помощи пробиотиков, полезных бактерий, как правило, выделенных из пищевых продуктов или организма здоровых людей и животных. Однако использование пробиотиков в ряде случаев бывает недостаточно эффективным и кратковременным. Индигенные, или собственные, бактерии (аутопробиотики) имеют ряд преимуществ, связанных с наличием по отношению к ним иммунологической толерантности и отсутствием у них выраженной антагонистической активности к облигатным представителям микробиоты. До сих пор методология создания аутопро-биотических препаратов окончательно не разработана. Во многом выбор состава аутопробиотиков связан с особенностями их влияния на иммунитет. Целью данного исследования явилось сравнение иммуномодулирующего эффекта различных по составу аутопробиотиков после введения крысам при дисбиозе кишечника.
В эксперименте использованы 5 групп крыс (самцы, Вистар). Индукция дисбиоза осуществлена введением ампициллина и метронидазола в течение трех дней. Затем животные в течение 5 дней получали индигенные бифидо-бактериии (группа Б), энтерококки (группа Е), консорциум аутопробиотических микроорганизмов, выращенных в анаэробных условиях (группа А) или фосфатный буфер (группа К1). Крысы из второй контрольной группы (К2) получали воду и фосфатный буфер. На 9-ый день эксперимента пробы крови и биоптаты селезенки исследованы при помощи проточной цитометриии клеток, окрашенных комбинацией флуоресцентно меченых моноклональных антител к CD3+, CD4+, CD8+, CD161+, FoxP3+ и CD45RA+ маркерам (Biolegend, США). Был использован проточный
