CC BY
38
МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (104) 2011
аорты / А. А. Крылов, В. И. Дмитриев // Тер. архив. — i98G. - № iG. - С. 39-43.
16. Iliescu VA, Dorobantu LF, Stiru O, Bubenek S, et al. Combined Cardiac-Neurosurgical Treatment of Acute Aortic Dissection, Stroke, and Coma. Tex Heart Inst J. 2GG8; 35(2): 2GG-2G2.
17. Maeda K, Yasaka M, Wakugawa Y, Ogata T, Okada Y. A case of brain infarction and thoracic aortic dissection without chest nor back pain diagnosed by carotid duplex ultrasonography. Rinsho Shinkeigaku. 2GG9 Feb-Mar; 49(2-3):iG4-8.
18. Estrera AL, Garami Z, Miller CC, Porat EE, Achouh PE, Dhareshwar J, et al. Acute type A aortic dissection complicated by stroke: can immediate repair be performed safely? J Thorac Cardiovasc Surg 2GG6; i32(6):i4G4-8.
19. Svensson LG, Nadolny EM, Kimmel WA. Multimodal protocol influence on stroke and neurocognitive deficit prevention after ascending/arch aortic operations. Ann Thorac Surg. 2GG2 Dec; 74(6):2G4G-6.
2G. Вуколов, Э. А. Основы статистического анализа. Практикум по статистическим методам и исследованию операций
с использованием пакетов STATISTICA и EXCEL : учебное пособие / Э.А. Вуколов. — 2-е изд., испр. и. доп. — М. : Форум, 2010. — 464 с.
СЕМЁНОВА Людмила Николаевна, заведующая кардиологическим отделением восстановительного лечения Областной клинической больницы. МОРОВА Наталья Александровна, доктор медицинских наук, профессор кафедры госпитальной терапии Омской государственной медицинской академии (ОГМА).
ЩЕРБАКОВ Денис Викторович, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры общественного здоровья и здравоохранения с курсами истории медицины и биомедицинской этики ОГМА.
Адрес для переписки: e-mail: Sledana@ rambler.ru
Статья поступила в редакцию 19.04.2011 г.
© Л. Н. Семёнова, Н. А. Морова, Д. В. Щербаков
УДК 616-QQ1.Q8-Q36.82-Q7:616 П. П. ЗОЛИН
В. Д. КОНВАЙ
Омский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина
ВЛИЯНИЕ РИБОЗЫ НА ВКЛЮЧЕНИЕ ГИПОКСАНТИНА В ГОЛОВНОЙ МОЗГ, ПЕЧЕНЬ И СЕРДЦЕ КРЫС
В ПОСТРЕАНИМАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ
Эксперименты проводились на крысах, которых подвергали 6,5-минутной асфиксии с последующей реанимацией. Крыс забивали через 30 минут после реанимации и сравнивали с контрольными животными. Обнаружено увеличение включения 14С-гипо-ксантина в мозг в раннем постреанимационном периоде. Внутривенная инъекция Р-ри-бозы (50 мг/кг) сразу после реанимации оказывала положительный эффект на включение 14С-гипоксантина в клетки крови и печени. Мы полагаем, что это связано с фос-форилированием рибозы и образованием фосфорибозилдифосфата. Последний способствует реутилизации гипоксантина и предотвращает его включение в ксантинокси-дазную реакцию.
Ключевые слова: гипоксантин, постреанимационные нарушения, рибоза, головной мозг, печень, сердце.
Как показали наши предыдущие исследования, гипоксантин (ГК), образующийся во время клинической смерти в результате катаболизма пуриннукле-отидов, может подвергаться дальнейшему катаболизму либо реутилизации, причем интенсивность этих процессов в разных органах неодинакова, и, кроме того, они в неодинаковой мере поддаются коррекции вводимыми препаратами, в частности рибо-зой [1, 2, 3]. Катаболизм ГК означает необратимую потерю пуринового гетероцикла организмом и способствует усиленной выработке в ксантиноксидаз-ной реакции активных форм кислорода, повреждающих биоструктуры. Реутилизация ГК предотвращает его вовлечение в ксантиноксидазную реакцию и способствует восполнению пула пуриновых мононуклеотидов. Помимо внутриклеточных превраще-
ний, ГК способен выходить из клеток в плазму, поэтому с восстановлением кровотока в ходе реанимации происходит межорганное перераспределение ГК, которое, наряду с процессами его катаболизма и реутилизации, играет важную роль в развитии острого нарушения пуринового обмена в организме [1].
Цель настоящей работы — изучение влияния клинической смерти и введения рибозы на включение ГК в жизненно важные органы: головной мозг, печень и сердце.
Материалы и методы исследования
Дизайн исследования включал применение плана параллельных групп и простой рандомизации. Известно, что метод простой рандомизации в достаточ-
ной мере обеспечивает случайность разделение животных на группы, хотя и не приводит к равной численности групп [4]. Эксперименты были выполнены в Центральной научно-исследовательской лаборатории Омской государственной медицинской академии на 57 беспородных белых крысах-самцах. 38 из них под эфирным наркозом подвергли клинической смерти путем 6,5-минутной механической асфиксии с последующей реанимацией. Из 38 подвергнутых асфиксии крыс 17 реанимировать не удалось, а 21 успешно реанимированное животное разделили на группы «Реанимация» и «Реанимация + Рибоза». Остальных 19 крыс подвергли не асфиксии, а лишь контрольным манипуляциям: наркозу, фиксации, интубации, после чего разделили на группы «Контроль» и «Рибоза». У животных всех четырех названных групп через 30 мин после вышеуказанных манипуляций под эфирным наркозом замораживали в жидком азоте пробы головного мозга, печени, сердца и крови, после чего крыс забивали. За 25 мин до забоя всем крысам вводили в бедренную вену 14С-ГК в дозе 740 кБк.кг-1 массы тела, растворенный в 0,9%-ном растворе ЫаС1, который брался из расчета 2,5 мл. кг-1 массы тела крыс. Раствор, предназначенный для групп «Реанимация + Рибоза» и «Рибоза», содержал, кроме того, Б-(-)-рибозу фирмы Бійка АС, БисИ8 БС (Швейцария) в дозе 50 мг.кг-1 массы тела.
Из замороженных тканей готовили хлорнокислый экстракт, как описано в работе [3] и определяли его радиоактивность в сцинтилляционной жидкости Брея на счетчике СБС-2.
Далее определяли включение 14С-ГК в соединения, являющиеся, согласно данным [5, 6], «хранилищем пуриновых мононуклеотидов». Методика обработки кислотонерастворимой фракции была взята нами из работ [5, 6] и включала следующие этапы. Осадок мозга, оставшийся после хлорнокислой экстракции, обрабатывали при 0-( + 4) °С охлажденными реактивами: 2 раза 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты в 20%-ном водном растворе метанола, эту смесь брали в 20-кратном объеме по отношению к сырой (исходной) массе мозга; 1 раз 8-кратным объемом ацетона и 2 раза 8-кратным объемом диэтило-вого эфира. Каждый цикл обработки включал в себя ресуспендирование осадка мозга в одной из перечисленных жидкостей, центрифугирование в рефрижераторной центрифуге и удаление супернатанта.
Полученный порошок сушили струей воздуха, заливали 30%-ным КОН, взятом в 10-кратном объеме по отношению к исходной массе мозга и, периодически перемешивая, инкубировали при 50 — 60 °С до полного растворения. Аликвоту полученного раствора нейтрализовали концентрированной уксусной кислотой, смешивали со сцинтиллятором Брея, солюбилизировали добавлением монометилового эфира этиленгликоля и измеряли на счетчике СБС-2. В фоновые флаконы добавляли раствор кислотонерастворимой фракции нерадиоактивного мозга, обработанной так же.
Описательная статистическая обработка результатов включала в себя вычисление для каждой группы средней арифметической и ошибки средней. Далее задача заключалась в сравнении двух попарно не связанных выборок по их средним тенденциям. Для этого мы использовали непараметрический критерий Вилкоксона —Манна —Уитни, для которого уровни значимости различий брали из таблиц [7].
Результаты и их обсуждение
Перераспределение ГК в постреанимационном периоде между органами и тканями зависит, во-первых, от изменения их кровоснабжение (в частности, от централизации кровообращения), а во-вторых — от проникновения данного метаболита через цитоплазматическую мембрану
Во время умирания и клинической смерти в клетках многих органов происходит катаболизм пуриновых нуклеотидов, образуется ГК, который по градиенту концентрации выходит из клеток в межклеточную жидкость и плазму. С началом восстановления кровотока в ходе реанимации начинается его меж-органное и межтканевое перераспределение. Поступление ГК в клетки в значительной мере зависит от интенсивности его использования в этих клетках, т.е. от суммы реутилизации и катаболизма [1].
Включение 14С-ГК в хлорнокислый экстракт головного мозга через 30 мин после начала реанимации на 49 % превышает уровень контроля (табл. 1), и этот сдвиг является статистически значимым. В группе «Реанимация + Рибоза» превышение показателя над контролем становится незначимым из-за возросшего внутригруппового разброса.
Таблица 1
Включение 14С-гипоксантина в хлорнокислый экстракт головного мозга, печени, сердца и цельной крови крыс на 30-й минуте постреанимационного периода без введения и после введения рибозы (однократно 50 мгкг-1 массы тела)
Показатели Группы животных
Контроль Реанимация Реанимация + Рибоза Рибоза
Головной мозг (имп.-с-1-г-1) 165+21 п=11 246+36 п = 7 Рк<0,05 279+74 п = 6 86+28 п=5 Рк<0,05
Печень (имп.-с-1-г-1) 3158+225 п = 13 2750+212 п = 9 4405+582 п= 6 Рк= 0,02 Рр<0,02 3009+491 п = 6
Сердце (имп.-с-1-г-1) 800+178 п= 4 571+113 п=5 923+178 п=4 620+40 п=5
Цельная кровь (имп.-с-1-г-1) 1164+111 п= 6 1412+167 п = 4 2704+145 п=4 Рк<0,001 Рр<0,002 1113+101 п=5
Примечания:
Результаты выражены в виде: средняя арифметическая ± ошибка средней; п — объем выборки;
Рк — значимость различий по сравнению с группой «Контроль»;
Рр — значимость различий по сравнению с группой «Реанимация»
ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (104) 2011 МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (104) 2011
Имеются достаточные основания говорить об увеличении поступления ГК в мозг реанимированных животных по сравнению с контролем. Во-первых, об этом свидетельствуют данные настоящего эксперимента о включении 14С-ГК в хлорнокислый экстракт цельного мозга (табл. 1). Во-вторых, по ранее полученным данным [2], во всех четырех отделах мозга, в которых нами изучалась общая радиоактивность тканей (таламусы, средний мозг, кора, в том числе отдельно сенсомоторная кора), происходило единообразное, отчетливое изменение показателя в сторону увеличения. Наличие устойчивой закономерности подтверждается именно сходством результатов двух серий опытов, проведенных в неодинаковых условиях (разные годы и времена года) и на разных партиях крыс, отличающихся по массе, динамике восстановления физиологических функций в ходе реанимации, структуре летальности. Таким образом, можно сделать вывод, что в раннем постреани-мационном периоде происходит своеобразный «прорыв» гематоэнцефалического барьера для экстра-церебрального ГК. Это чревато окислением последнего О-формой ксантиноксидазы, активность которой в ткани мозга весьма высока [8] и развитием свободнорадикальных повреждений церебральных структур.
Также по результатам этих двух экспериментов можно заключить, что введение рибозы как реанимированным, так и здоровым крысам снижает поступление в мозг ГК и/или делает превышение над контролем статистически незначимым. Нормализующий эффект рибозы на общую радиоактивность тканей отчетливо присутствовал во всех четырех частях мозга, которые нами изучались в работе [2]. При изучении радиоактивности хлорнокислых экстрактов он был менее явным (табл. 1), но здесь на результат сравнения групп «Реанимация + Рибоза» и «Реанимация» могли повлиять различия по количеству неигнорируемых пропусков, вызванных гибелью части крыс от изучаемой патологии [9].
У здоровых животных наблюдалось почти двукратное статистически значимое снижение под действием рибозы радиоактивности хлорнокислого экстракта цельного мозга (табл. 1).
Известно, что в печени, являющейся главным органом пуринового обмена, метаболизируется не только гепатогенный ГК, но и поступающий с током крови из других органов [1]. Поскольку усиленное образование ГК в результате катаболизма пурин-нуклеотидов во всем организме начинается еще во время асфиксии, можно было ожидать, что с восстановлением кровообращения ГК станет усиленно поступать в печень для реутилизации. Это имело бы компенсаторное значение. Однако в первые 30 мин после начала реанимации общая радиоактивность хлорнокислого экстракта данного органа даже не превышает уровня контроля (табл. 1), так же как и в ранее проведенном эксперименте [2], в котором по общей радиоактивности тканей печени и по радиоактивности ее хлорнокислого экстракта различие групп «Реанимация» и «Контроль» статистически незначимо. В целом можно сделать вывод об отсутствии существенных изменений поступления ГК в печень в раннем постреанимационном периоде.
В группе «Реанимация + Рибоза» включение 14С-ГК в хлорнокислый экстракт печени в 1,4 раза превышает уровень группы «Контроль» (табл. 1), что, будучи статистически значимым, близко совпадает с результатами эксперимента [2], в котором изучались как общая радиоактивность печени, так и радиоактивность ее хлорнокислого экстракта.
В группе «Рибоза» включение 14С-ГК в хлорнокислый экстракт практически находится на контрольном уровне (табл. 1), что тоже хорошо согласуется с данными по общей радиоактивности тканей печени [2].
При изучении радиоактивности хлорнокислого экстракта сердца не было обнаружено статистически значимых отличий между исследовавшимися группами. В группе «Реанимация» включение 14С-ГК в хлорнокислый экстракт сердца составило 71 % от контрольного уровня, в группе «Реанимация + Рибоза» — 115 %, в группе «Рибоза» — 77 % (табл. 1). Эти результаты неплохо согласуются с результатами изучении общей радиоактивности данного органа, описанными в работе [2], а также с данными [10], согласно которым ишемия изолированных крысиных сердец, вызванная уменьшением перфузии на 65 — 73 %, не оказывала статистически значимого влияния на общую радиоактивность хлорнокислого экстракта сердца после добавления в перфузионный раствор 14С-ГК.
Включение 14С-ГК в хлорнокислый экстракт цельной крови через 30 мин после начала реанимации на 21% превышает уровень контроля (табл. 1), что, судя по данным, полученным ранее [2], происходит в большей мере за счет поступления метки в эритроциты, чем за счет радиоактивности плазмы. Известно, что в эритроцитах отсутствуют ферменты синтеза нуклеотидов de novo, поэтому поглощение извне и реутилизация оснований имеет для них особенно важное значение.
В группе «Реанимация + Рибоза» включение 14С-ГК в хлорнокислый экстракт цельной крови в 2,3 раза превышает уровень группы «Контроль» и в 1,9 раза — уровень группы «Реанимация», с высокой степенью статистической значимости отличаясь от обеих названных групп (табл. 1). Дополнительно было рассчитано по способу, описанному в работе [9], что с учетом влияния неигнорируемых пропусков, вызванных изучаемой патологией, группа «Реанимация + Рибоза» отличается от контрольной группы со статистической значимостью Р = 0,02, а от группы «Реанимация» — с Р = 0,03.
В группе «Рибоза» включение 14С-ГК в хлорнокислый экстракт цельной крови практически совпадает с контролем (табл. 1).
Подводя итог вышеописанным результатам, можно сказать, что рибоза в раннем постреанимационном периоде усиливает поступление ГК в клетки крови и печени. Мы полагаем, что в основе этого эффекта рибозы лежат следующие механизмы. По литературным данным, суммированным в монографии [1], интенсивность поступления ГК в клетку зависит от его внутриклеточного использования. Известно также, что экзогенная рибоза способна внутрикле-точно фосфорилироваться в рибозо-5-фосфат с последующим образованием фосфорибозилдифос-фата — ключевого субстрата гипоксантин, гуанин-фосфорибозилтрансферазной реакции, которая лимитирует реутилизацию ГК. Активация этой реакции под действием экзогенной рибозы предотвращает включение ГК в ксантиноксидазную реакцию, приводящую к необратимой потере пуринового гетероцикла и усиленной выработке активных форм кислорода, повреждающих клеточные структуры [ 1]. При этом, надо полагать, общее потребление ГК клетками крови и печени возрастает, что является причиной усиленного включения в эти клетки ГК, содержащегося в плазме. Централизация кровообращения в раннем постреанимационном периоде
является способствующим фактором, но не причиной усиленного поступления ГК в органы, поскольку мы видим (табл. 1), что существенно не изменилось включение ГК в сердце, хотя этот орган, как известно, вовлекается в централизацию кровообращения.
Благоприятный эффект рибозы на организм в целом подтверждается тем, что в группе «Реанимация + Рибоза» за 30 минут постреанимационного периода не погибло ни одного животного, тогда как в группе «Реанимация» из 15 реанимированных крыс погибли 3.
Исследуя поступление 14С-ГК в кислоторастворимую фракцию тканей, мы, естественно, заинтересовались вопросом о возможной «утечке» части радиоактивности в кислотонерастворимую фракцию и о том, как изменяется размер этой части в разных экспериментальных группах. Имеются данные о том, что кислотонерастворимая фракция содержит соединения, являющиеся предполагаемым «хранилищем адениновых мононуклеотидов» [5, 6].
Для оценки возможного влияния кислотонерастворимых соединений на наши результаты в группах «Контроль», «Реанимация», «Реанимация + Рибоза», «Рибоза» мы сопоставили изменения общей радиоактивности тканей [2] и радиоактивности хлорнокислых экстрактов печени, сердца и крови (табл. 1). Результаты сопоставления данных по печени, сердцу и крови позволяют говорить о том, что либо метка 14С-ГК совсем не поступает в кислотонерастворимую фракцию либо поступает какая-то ее доля, но размер этой доли в группах «Контроль», «Реанимация», «Реанимация + Рибоза» и «Рибоза» существенно не различается. По данным литературы, доля кислотонерастворимого «хранилища пуриновых нуклеотидов» по отношению к кислоторастворимой фракции невелика. Так, авторы работы [6], исходя из того, что в их условиях данное соединение, по-видимому, достигает по своей удельной радиоактивности равновесия с кислоторастворимыми пуриновыми нуклеотидами, а содержание последних составляет около 4 мкмоль.г-1 сердца, получили расчетное содержание кислотонерастворимой субстанции, равное
0,4 мкмоль.г-1.
Сравнение с результатами работы [2] является корректным методическим приемом для оценки влияния кислотонерастворимой фракции печени, сердца и крови, но не мозга, поскольку для определения общего включения ГК в работе [2] брался не весь мозг, а только отдельные мозговые структуры (таламусы, сенсомоторная кора и т.д.). Полученные по ним результаты нельзя распространять на весь мозг и сопоставлять с включением ГК в хлорнокислый экстракт целого мозга (табл. 1).
При этом вопрос о кислотонерастворимом «хранилище пуринов» в мозге представляется актуальным. Как известно, головной мозг является для реаниматологии центральным органом. Кроме того, как показали наши исследования, в постреанимаци-онном периоде ГК усиленно включается в мозг. Поэтому мы провели прямое изучение кислотонерастворимой фракции мозга.
В группах «Контроль», «Реанимация», «Реанимация + Рибоза» и «Рибоза» было изучено включение 14С-ГК в кислотонерастворимую фракцию цельного головного мозга. Однако полученные нами результаты оказались более чем скромными. Ни в одной из перечисленных экспериментальных групп не было найдено включения метки 14С-ГК в кислотонерастворимую фракцию, существенно превышающего фон.
Разумеется, наши данные не опровергают гипотезу о существовании кислотонерастворимого «хранилища пуринов» в мозге. Они лишь позволяют сделать вывод, что в условиях нашего эксперимента ГК не поступает в кислотонерастворимые соединения мозга, а метаболизируется исключительно в пределах кислоторастворимой фракции.
Выводы
1. В раннем постреанимационном периоде усиливается поступление ГК в головной мозг, вероятно, с последующим вовлечением в ксантиноксидазную реакцию.
2. Введение рибозы сразу после реанимации увеличивает поступление ГК в клетки крови и печени, но не влияет на уровень показателя в сердце. Эффект рибозы мы связываем с увеличением общего потребления ГК клетками крови и печени за счет усиления реутилизации ГК. В мозге рибоза вызывает, скорее всего, перераспределение ГК на двух путях метаболизма: усиление его реутилизации за счет уменьшения включения ГК в ксантиноксидазную реакцию.
3. Кислотонерастворимая фракция не оказывает существенного влияния на полученные нами результаты.
Библиографический список
1. Золин, П. П. Математическое моделирование биохимических процессов с применением регрессионного анализа : монография / П. П. Золин, В. М. Лебедев, В. Д. Конвай. — Омск : Изд-во Ом. гос. ун-та, 2009. — 344 с.
2. Золин, П. П. Постреанимационные нарушения обмена гипоксантина и их коррекция : дис. ... канд. мед. наук / П. П. Золин. — Омск, 2001. — 250 с.
3. Конвай В.Д. Нарушение обмена пуринов в печени реанимированных крыс и его коррекция / В. Д. Конвай, А. В. Лукошкин, В. С. Поспелов // Пат. физиол. — 1987. — № 5. — С. 57 —59.
4. Сергиенко, В. И. Математическая статистика в клинических исследованиях / В. И. Сергиенко, И. Б. Бондарева. — М. : ГЭОТАР-МЕД, 2001. - 256 с.
5. Fitt P.S., Korecky B., Sharma N. A possible adenine nucleotide storage form in normal and ischaemic rat heart // Biosci. Rep. - 1985. - V. 5, N 1. - P. 7-12.
6. Mowbray J., Hutchinson W.L., Tibbs G.R., Morris P.G. The discovery of a rapidly metabolized polymeric tetraphosphate derivative of adenosine in perfused rat heart // Biochem. J. -1984. - V. 223, N 3. - P. 627-632.
7. Гублер, Е.В. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях / Е. В Гублер, А. А.. Генкин. - Л. : Медицина, 1973. - 143 с.
8. Wajner M., Harkness R.A. Distribution of xanthine dehydrogenase and xanthine oxidase activities in human and rabbit tissues // Biochim. Biophys. Acta. - 1989. - V. 991. - P. 79-84.
9. Золин, П. П. Цензурированные данные и данные с пропусками в медицинских исследованиях // Пат. физиол. -2010. - № 4. - С. 49-52.
10. Harmsen E., de Tombe P.P., de Jong J.W., Achterberg P.W. Enhanced ATP and GTP synthesis from hypoxanthine or inosine after myocardial ischemia // Am. J. Physiol. - 1984. -V. 246 (Heart Circ. Physiol. - V. 15). - N.1. - P.H37-H.43.
ЗОЛИН Петр Петрович, кандидат медицинских наук, доцент кафедры химии.
Адрес для переписки: e-mail: zolin_petr@mail.ru КОНВАЙ Владимир Дмитриевич, доктор медицинских наук, профессор кафедры химии.
Статья поступила в редакцию 12.09.2011 г.
© П. П. Золин, В. Д. Конвай
ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (104) 2011 МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
