CC BY
29
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2019
Золин П.П.1, Конвай В.Д.12, Мантрова А.И.1
ВЛИЯНИЕ РИБОЗЫ И ГЛУТАМИНА НА ВЫРАЖЕННОСТЬ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ В МОЗГЕ РЕАНИМИРОВАННЫХ КРЫС
1ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский университет», 644099, Омск; 2ФГБОУ ВО «Омский государственный аграрный университет им. П.А. Столыпина», 644008, Омск
Цель - выяснить, как изменяются уровни молекул средней массы в головном мозге в раннем постреанимационном периоде, а также проверить возможность влияния на нихрибозы и глута-мина у реанимированных и здоровых животных.
Материал и методы. Эксперименты были выполнены на 81 белой крысе-самце, которых подвергли 6,5-минутной механической асфиксии с последующей реанимацией. Крысы были подвергнуты эвтаназии через 30 мин после начала реанимации. Отдельным группам реанимированных животных и отдельным группам контрольных крыс внутривенно вводили раствор D-рибозы (50 мг/кг) или внутривенно вводили раствор L-глутамина (200 мг/кг) через 5 мин после начала реанимации. В головном мозге определяли уровни молекул средней массы через 30 мин после начала реанимации. Результаты и обсуждение. Среднее значение в группе реанимированных крыс могло изменяться из-за того, что изменялось содержание молекул средней массы у каждого отдельного животного, а также из-за того, что крысы с самой большой концентрацией молекул средней массы погибали, не дожив до забора мозга. Установлено, что через 30 мин после начала реанимации уровни молекул средней массы в головном мозге статистически значимо повышаются по сравнению с контрольной группой. Внутривенное введение D-рибозы (50 мг/кг) или внутривенное введение L-глутамина (200 мг/кг) сразу после реанимации не оказывало влияния на уровень молекул средней массы в мозге реанимированных крыс. Вследствие гибели части животных от изучаемой патологии возникают неслучайные пропуски цифровых значений в группах реанимированных животных. Авторы предполагают, что неслучайные пропуски искажают эффекты D-рибозы и L-глутамина и искажают действие D-рибозы и L-глутамина на уровне молекул средней массы в мозге. Заключение. В раннем постреанимационном периоде выраженность эндогенной интоксикации в мозге крыс увеличивается. Не обнаружено влияние D-рибозы и L-глутамина на это увеличение. Учет возможного влияния неслучайных пропусков позволяет более корректно интерпретировать полученные результаты.
Ключевые слова: реанимация; головной мозг; молекулы средней массы; рибоза; глута-мин; эндотоксикоз; неслучайные пропуски; постреанимационный период; крысы.
Для цитирования Золин П.П., Конвай В.Д., Мантрова А.И. Влияние рибозы и глутамина на выраженность эндогенной интоксикации в мозге реанимированных крыс. Медицина экстремальных ситуаций. 2019; 21(1): 82-91.
Для корреспонденции: Золин Петр Петрович, канд. мед. наук, доцент, ст. преподаватель ФГБУ ВО «Омский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра биохимии, 644008, Омск. E-mail: zolin_petr@mail.ru
Zolin P.P.1, Konvay V.D.12, Mantrova A.I.1
EFFECT OF RIBOSE AND GLUTAMINE ON THE EXPRESSION OF ENDOGENOUS INTOXICATION IN THE BRAIN OF REANIMATED RATS
!Omsk State Medical University, Omsk, 644099, Russian Federation; 2P.A. Stolypin Omsk State Agrarian University, Omsk, 644008, Russian Federation
The aim of this work is to find out how the levels of molecules of average mass in the brain change in the early post-resuscitation period, as well as to check whether ribose and glutamine can affect them in resuscitated and healthy animals.
Material and methods. The experiments were performed on 81 white male rats, subjected to 6.5-min-ute mechanical asphyxia, followed by resuscitation. Rats were euthanized 30 minutes after the onset
MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES
of resuscitation. D-ribose solution (50 mg/kg) was administered intravenously to separate groups of reanimated animals and separate groups of control rats, or L-glutamine solution (200 mg/kg) was intravenously administered 5 minutes after the start of reanimation. In the brain, the levels of molecules of average weight were determined 30 minutes after the start of resuscitation.
Results and discussion. The average value in the group of reanimated rats could alter due to the fact that the content of molecules of average weight in each individual animal changed, as well as due to the fact that rats with the highest concentration of molecules of average weight perished before their brain was taken. 30 minutes after the beginning of resuscitation, the levels of average-weight molecules in the brain were established to increase statistically significant if compared with the control group. Intravenous administration of D-ribose (50 mg/kg) or intravenous administration of L-glutamine (200 mg/kg) immediately after resuscitation did not affect the level of molecules of average weight in the brain of reanimated rats. Due to the death of a part of animals from the pathology under study, there are occurred non-random elisions of digital values in groups of reanimated animals. The authors suggest non-random elisions to mutilate the effect of D-ribose and L-glutamine on the levels of average-weight molecules in the brain
Conclusion. In the early post-resuscitation period, the severity of endogenous intoxication in the rat brain increases. No effect of D-ribose and L-glutamine on this increase was found. Accounting for the possible impact of non-random passes allows interpreting results more correctly.
Keywords: resuscitation; brain; medium weight molecules; ribose; glutamine; endotoxicosis; non-random elisions; postresuscitation period; rats.
For citation: Zolin P.P., Konvay V.D., Mantrova A.I. Effect of ribose and glutamine on the expression of endogenous intoxication in the brain of reanimated rats. Meditsina ekstremal'nykh situatsiy (Medicine of Extreme Situations) 2019; 21(1): 82-91. (In Russ.).
For correspondence: Peter P. Zolin, MD, Ph.D., Associate Professor, Senior Lecturer, Department of Biochemistry of the Omsk State Medical University, Omsk, 644008, Russian Federation. E-mail zolin_petr@mail.ru
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. The study had no sponsorship. Received: December 21, 2018 Accepted: February 21, 2019
Введение
Для диагностики эндогенной интоксикации организма при различных патологических состояниях широко используется определение в биологических жидкостях и тканях содержаний веществ, которые называются в литературе фракцией средней молекулярной массы или веществами низкой и средней молекулярной массы или просто "средними молекулами" [1-6]. В последние годы для их обозначения чаще всего используется термин "молекулы средней массы" (МСМ) [7-9].
Имеются данные об увеличении концентраций МСМ в плазме крови и эритроцитах крыс в постреанимационном периоде после клинической смерти [3, 4]. Однако в доступной литературе мы не обнаружили сведений о постреанимационных изменениях уровней МСМ в головном мозге - органе, критически важном для реаниматологии.
Наши предыдущие исследования показали, что внутривенное введение крысам растворов рибозы или глутамина сразу после реанимации позволяет корригировать нарушения целого ряда физиологических и биохимических показателей [10, 11]. В продолжение этих работ целесообразно было проверить влияние рибозы и глутамина на один из интегральных показателей эндогенной интоксикации - МСМ.
Цель — выяснить, как изменяются уровни МСМ в головном мозге в раннем постреанимационном периоде, а также проверить возможность влияния на них рибозы и глутамина у реанимированных и здоровых животных.
Материал и методы
Дизайн исследования включал применение плана параллельных групп и простой рандомизации. Известно, что метод простой рандомизации в достаточной мере гарантирует случайность
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
разделения подопытных животных на группы, хотя и не обеспечивает равную численность групп [12]. Все эксперименты проводились с соблюдением ГОСТ Р 53434-2009 (п. 3.4).
Эксперименты были выполнены на неин-бредных белых крысах-самцах (п = 81), которые содержались в виварии на стандартном рационе и свободном доступе к воде. Из них 50 крыс подвергали наркозу диэтиловым эфиром, после чего у них вызывали клиническую смерть путем 6,5-минутной механической асфиксии. Модель асфиксии в значительной мере воспроизводит нередко встречающиеся в клинической практике состояния: попадание в бескислородную атмосферу, спазм дыхательных путей, утопление, внезапная остановка дыхания, аспирация рвотных масс, повешение, асфиксия новорожденных и т.д. Продолжительность асфиксии 6,5 мин обеспечивает у крыс достаточно высокую летальность, а также тяжесть постреанимационной болезни у выживших животных. Кроме того, на модели 6,5-минутной асфиксии выполнено большинство наших предыдущих исследований, и ее использование облегчает сопоставление новых результатов с ранее полученными данными.
Для моделирования клинической смерти крыс, находящихся под эфирным наркозом, их фиксировали на лабораторном столике в положении на спине и интубировали полиэтиленовой трубкой диаметром 2 мм при помощи осветителя с оптоволоконным световодом. Трубку фиксировали к верхней губе и полость рта тампонировали увлажненной салфеткой, чтобы доступ воздуха в легкие происходил только через трубку. После установления ритмичного дыхания трубку перекрывали на 6,5 мин, угасание дыхательных движений фиксировали визуально, прекращение сердцебиения - пальпаторно. Через 6,5 мин просвет трубки открывали и животных реанимировали путем непрямого массажа сердца средним пальцем руки и искусственного дыхания при помощи резиновой груши с клапанным механизмом. Сердечные сокращения у крыс появлялись в среднем через 89 ± 12 с (средняя арифметическая ± ошибка средней), первый акт самостоятельного дыхания - через 164 ± 12 с после начала оживления. Реанимационные мероприятия прекращали после появ-
ления у крыс устойчивого сердцебиения и самостоятельного дыхания. Реанимацию считали неудачной и прекращали, если в течение 5 мин после ее начала у крыс не появлялось сердечных сокращений и дыхания. Из 50 животных 17 нам не удалось оживить после 6,5-минутной асфиксии, а 33 успешно реанимированные особи разделили в случайном порядке на группы: "Реанимация", "Реанимация + Рибоза", "Реанимация + Глутамин". Деление на группы происходило через 5 мин после начала оживления при введении им соответствующих растворов.
Остальных животных (31 крыса) не подвергали асфиксии и реанимационным мероприятиям - непрямому массажу сердца и искусственному дыханию. Они были подвергнуты только контрольным манипуляциям: наркозу диэтило-вым эфиром, фиксации на лабораторном столике и интубации; этих крыс в случайном порядке разделили на группы "Контроль", "Рибоза" и "Глутамин".
Животных всех шести вышеназванных групп через 30 мин после начала реанимации (или контрольных манипуляций) под эфирным наркозом погружали головой в жидкий азот до полного замораживания, тем самым производилась эвтаназия животных. За 25 мин до эвтаназии всем крысам вводили в предварительно обнаженную бедренную вену 0,9% раствор NaCl, который брали из расчета 2,5 мл . кг-1 массы тела. Раствор, предназначенный для групп "Реанимация + Рибоза" и "Рибоза", содержал, кроме того, D-(-)-рибозу производства компании "Fluka AG, Buchs SG" (Швейцария) в дозе 50 мг х кг-1 массы тела. Раствор, предназначенный для групп "Реанимация + Глутамин" и "Глутамин", содержал L-глутамин производства компании "Reanal" (Венгрия) в дозе 200 мг х кг-1 массы тела. В настоящей работе мы использовали такие же дозы и время введения крысам D-(—)-рибозы и L-глутамина, какими они были в предыдущих исследованиях [10, 11], в которых было обнаружено корригирующее влияние этих двух веществ на метаболические и физиологические показатели крыс, реанимированных после 6,5-минутной асфиксии.
Замороженные головы крыс рассекали сагиттально пополам, быстро извлекали мозг и хранили его в жидком азоте. В замороженном
MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES
Таблица 1 Оптическая плотность (М ± т) в области 230-260 нм (А2зо-А26о) экстракта головного мозга крыс через 30 мин после реанимации. Влияние рибозы (50 мг • кг-1 массы тела) и глутамина (200 мг • кг-1 массы тела) на реанимированных и здоровых животных.
Группа крыс Длина волны, нм
А230 А240 А250 А260
Контроль, n = 17 1,03 ± 0,12 0,91 ± 0,12 0,45 ± 0,07 0,35 ± 0,05
Реанимация, n = 12 1,33 ± 0,05 Ркс < 0,1 1,29 ± 0,10 Pu = 0,05 Pr = 0,07 0,65 ± 0,07 Pu = 0,05 0,50 ± 0,05 Pu = 0,05
Реанимация + Рибоза, n = 6 1,34 ± 0,08 Ркс < 0,1 1,37 ± 0,12 Pu = 0,07 0,77 ± 0,09 Pu = 0,03 0,61 ± 0,08 Pu = 0,02 PKC < 0,1
Рибоза, n = 5 1,24 ± 0,13 1,29 ± 0,14 0,60 ± 0,06 0,47 ± 0,04
Реанимация + Глутамин, n = 5 1,37 ± 0,11 1,44 ± 0,16 Pu = 0,04 0,88 ± 0,24 Pu = 0,07 0,71 ± 0,22 Pu=0,05
Глутамин, n = 6 1,18 ± 0,28 Pr = 0,06 1,38 ± 0,24 Pu = 0,04 PKC < 0,05 0,72 ± 0,13 PKC < 0,1 0,55 ± 0,10 PKC < 0,1
Примечание. Здесь и в табл. 2: результаты выражены в единицах оптической плотности • г-1 сырой массы мозга. Статистическая значимость всех отличий указана по сравнению с группой "Контроль": Ри - по критерию Манна-Уитни; Ркс - по критерию Колмогорова-Смирнова; Рг - по критерию Вальда-Вольфовица.
состоянии гомогенизировали навеску мозга в холодной 6% хлорной кислоте (HClO4), взятой в соотношении 100 мг ткани на 0,4 мл HClO4. Известно, что применение хлорной кислоты для осаждения белков при определении МСМ имеет преимущество перед трихлоруксусной кислотой [13].
Хлорнокислый гомогенат центрифугировали в течение 5 мин при 1000 g и 0 °С. Полученный безбелковый супернатант сразу же нейтрализовали раствором КОН до pH 7, выдерживали 15 мин при 0°C и осадок KClO4 отделяли центрифугированием при вышеописанных условиях. Из хлорнокислого экстракта головного мозга удаляли органические фосфаты по методу [14], чтобы приблизить характеристики нашего экстракта к характеристикам биологических жидкостей, в которых обычно определяют МСМ: плазмы крови, сыворотки, ликвора, мочи, слюны [1, 6, 9, 15-17]. Затем при нейтральном рН снимали спектры поглощения полученного бесфосфатного экстракта в области 230-300 нм [14].
Статистическую обработку полученных цифровых данных выполняли при помощи статистического пакета "Statistica 6.0" (компания "Stat Soft Inc.", США). Вычисляли среднюю
арифметическую и ошибку средней для каждой группы животных. Затем проводили сравнение групп по их средним тенденциям при помощи непараметрических критериев Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова, а также сравнение формы распределения групп по непараметрическому критерию Вальда-Вольфовица. Различия считали статистически значимыми при уровне значимостир < 0,05, но, кроме того, фиксировали различия, близкие к значимым (р < 0,1).
Результаты и обсуждение
В литературе описано много модификаций определения уровня МСМ путем измерения оптической плотности в ближней ультрафиолетовой области: при длинах волн 260 и 280 нм [18], при 254 и 280 нм [9, 19, 20], при 254, 275 и 280 нм [7], через каждые 10 нм [17, 21], через каждые 4 нм [4, 6, 22]. Мы измеряли абсорбцию экстрактов мозга через каждые 10 нм [14]. Как показали полученные результаты, этого оказалось достаточно и более частые измерения не нужны, поскольку при всех длинах волн в области 230-300 нм оптическая плотность изменяется сходным образом во всех группах животных (табл. 1, 2).
85
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Таблица 2
Оптическая плотность в области 270-300 нм (А27о-А3оо) экстракта головного мозга крыс через 30 мин после реанимации. Влияние рибозы (50 мг • кг-1 массы тела) и глутамина (200 мг • кг-1 массы тела) на реанимированных и здоровых животных.
Группы крыс Длина волны, нм
А270 А280 А290 А300
Контроль, n = 17 0,35 ± 0,05 0,30 ± 0,05 0,17 ± 0,03 0,09 ± 0,01
Реанимация, n = 12 0,50 ± 0,05 Pu = 0,06 0,43 ± 0,04 Pu = 0,06 0,23 ± 0,03 0,12 ± 0,01 Pu = 0,07
Реанимация + Рибоза, n = 6 0,59 ± 0,08 Pu = 0,04 0,50 ± 0,08 Pu = 0,05 0,30 ± 0,06 Pu = 0,05 0,21 ± 0,05 Pu = 0,01 Pro < 0,05
Рибоза, n = 5 0,48 ± 0,05 0,4 1± 0,04 0,23 ± 0,02 0,12 ± 0,02
Реанимация + Глутамин, n = 5 0,75 ± 0,23 Pu = 0,05 0,68 ± 0,24 Pu = 0,07 0,41 ± 0,19 Pu = 0,08 0,23 ± 0,12
Глутамин, n = 6 0,59 ± 0,11 Ркс < 0,1 0,52 ± 0,10 Pu = 0,07 Prc < 0,05 0,27 ± 0,06 Pro < 0,1 0,12 ± 0,03
Через 30 мин после начала реанимации происходит увеличение оптических плотностей (А) экстрактов головного мозга крыс во всей исследованной области спектра (А230-А300), причем на многих длинах волн это увеличение является статистически значимым (см. табл. 1 и 2). Из-за большого количества веществ, которые имеют максимальное поглощение света при длинах волн 230-300 нм, эта зона была названа химиками "конкурентной" [6]. МСМ, поглощающие в данной области спектра, представляют собой гетерогенную группу различных по происхождению и химическому составу молекул с массой до 5000 дальтон [1, 5, 17].
Учитывая патогенетическую значимость МСМ и увеличение их уровней в биологических жидкостях и тканях при гипоксических и реоксигенационных состояниях [1-4, 6, 18] представляется вполне закономерным повышение их концентраций в мозге по сравнению с контролем, обнаруженное нами в раннем постреанимационном периоде (см. табл. 1 и 2, группа "Реанимация"). В литературе мы нашли лишь одну публикацию, посвященную изучению МСМ в нервной ткани [7]. В этой работе было обнаружено статистически значимое повышение А280 в гомогенате нервной ткани при гипогликемическом шоке у крыс, вызванном подкожным введением инсулина. По нашим
данным, повышение А280 в группе "Реанимация" по сравнению с группой "Контроль" (см. табл. 2) было близким к статистически значимому (Pu = 0,06).
Содержание МСМ в головном мозге является результатом действия двух противоположно направленных процессов: 1) образования МСМ в тканях мозга, 2) элиминации данных веществ из мозга путем выведения их в ликвор и плазму крови, а также деградации МСМ in situ в тканях мозга. Судя по представленным в табл. 1 и 2 результатам, первый из названных процессов преобладает у реанимированных животных над вторым. Мы не изучали МСМ в плазме крови, но по данным Д.А. Еникеева и соавт. [3, 4], уровень МСМ в плазме крови крыс был статистически значимо выше контроля в течение всей первой недели постреанимационного периода после клинической смерти.
Известно, что главным звеном патогенеза при острой механической асфиксии является сильно выраженная гипоксия, которая, в частности приводит к истощению пула аденозин-трифосфата и других мононуклеотидов, вследствие чего развивается энергетический дефицит и острое нарушение пуринового обмена [11, 23, 24]. Восполнение пула пуриннуклеотидов может происходить путем биосинтеза пуринов de novo или путем реутилизации гипоксантина,
аденина и гуанина, образующихся в ходе катаболизма нуклеотидов. Нами было обнаружено, что синтез пуринов de novo в головном мозге крыс в первые 30 мин постреанимационного периода после 6,5-минутной асфиксии лимитируется концентрацией L-глутамина [10, 11], который участвует в ключевой реакции синтеза пуринов de novo, катализируемой амидофосфо-рибозилтрансферазой, а также в двух других реакциях синтеза пуринов, катализируемых фосфорибозилформилглицинамидин-синтета-зой и гуанозинмонофосфат-синтетазой. Экзогенная D-(-)-рибоза в организме фосфорили-руется до рибозо-5-фосфата, который может использоваться как энергетический субстрат, а также является предшественником синтеза фосфорибозилдифосфата - ключевого метаболита реутилизации пуриновых оснований и синтеза пуринов de novo [25-27]. Можно считать доказанным протекание этих процессов в мозге, поскольку установлено, что рибоза хорошо проходит через гемато-энцефалический барьер и сквозь клеточные мембраны [27, 28], а в клетках крысиного мозга рибоза под действием рибокиназы сначала превращается в рибозо-5-фосфат, а затем, под действием фосфорибозил-дифосфат-синтетазы - в фосфорибозилдифос-фат [27, 29]. Внутривенное введение крысам растворов рибозы и глутамина сразу после реанимации благоприятно влияет на показатели энергетического обмена, метаболизма пуринов, перекисного окисления липидов, а также на выживаемость и восстановление неврологического статуса реанимированных животных [10, 11]. Таково патогенетическое обоснование применения рибозы и глутамина для экспериментальной коррекции постреанимационных нарушений.
Имеются не только наши собственные, но и литературные данные, суммированные в обобщающих публикациях [10, 11, 25], о благоприятном влиянии рибозы и глутамина на физиологические и биохимические процессы при различных патологических состояниях. Перед началом настоящего исследования эти сведения давали нам основания предполагать, что рибоза и глутамин будут оказывать корригирующее действие на выраженность эндогенной интоксикации в нашем эксперименте. Однако
MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES
по результатам проведенного исследования неожиданно для нас оказалось, что ни рибоза, ни глутамин не снижают концентрацию МСМ в мозге после оживления (см. табл. 1, 2). Но при этом они несколько улучшают выживаемость реанимированных животных. В группе "Реанимация" погибли 4 из 16 крыс, реанимация которых поначалу была успешной (25%). В группе "Реанимация + Глутамин" погибла 1 крыса из 7 реанимированных (14%). Эти погибшие особи не прожили 30 мин от начала реанимации, то есть не дожили до эвтаназии и забора мозга. В группе "Реанимация + Рибоза" за 30 мин не погибло ни одной крысы из 6 оживленных.
Для того, чтобы объяснить отсутствие снижения уровней МСМ в группах "Реанимация + Ри-боза" и "Реанимация + Глутамин" по сравнению с группой "Реанимация" (см. табл. 1, 2) мы выдвинули следующее предположение. На результаты исследований, подобных нашему, может влиять один фактор, который редко учитывается учеными-медиками. Этот фактор называется в статистике "неслучайные пропуски в данных", а конкретно в нашем и других аналогичных исследованиях - это пропуски цифровых значений в изучаемых группах, вызванные гибелью части животных от изучаемой патологии [30]. Поясним механизм действия этих пропусков.
Как любой биохимический показатель, уровень МСМ в мозге имеет естественную вариабельность. Поэтому исходные значения МСМ среди крыс, взятых нами в эксперимент, неизбежно различались от особи к особи. Кроме того, различалось количество эндотоксинов, образующихся у каждой крысы вследствие асфиксии и реанимации. Многочисленными исследованиями доказано, что эндотоксины в организме играют патогенетическую, повреждающую роль, и что концентрация МСМ увеличивается при различных патологических состояниях, у которых гипоксия и реоксигенация имеют в патогенезе ведущее значение [1-4, 6, 18]. Отсюда логично предположить, что животные с высокими концентрациями МСМ в мозге при прочих равных условиях имели меньшую вероятность выжить, так как большие количества эндотоксинов вместе с другими патогенетическими факторами способствовали гибели животного. Следовательно, можно полагать,
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
что в нашем опыте погибали преимущественно крысы с высокими уровнями МСМ в мозге, а со средними и низкими уровнями - выживали.
Мы также предполагаем, что, улучшая выживаемость, препараты рибозы и глутамина сохраняют жизнь крысам с высокими концентрациями МСМ, которые бы без этих препаратов погибли. Тем самым в цифровые значения групп "Реанимация + Рибоза" и "Реанимация + Глутамин" оказываются включены высокие цифры МСМ, которых не было бы в этих группах, если бы рибоза и глутамин не приводили к доживанию дополнительных крыс до забора мозга. В результате средние арифметические МСМ в группах "Реанимация + Рибоза" и "Реанимация + Глутамин" увеличиваются.
Парадокс заключается в том, что, улучшая выживаемость, вводимый препарат может как раз именно из-за улучшения выживаемости ухудшать средние уровни биохимических показателей в органах. Это происходит потому, что в медицинских исследованиях сравнение производится между средними значениями групп. Статистика очень полезна для медицины, поскольку она дает усредненную, обобщенную картину для каждой группы особей и позволяет сравнить группы. Но при этом нужно помнить, что изменение среднегруппового значения биохимического показателя может произойти не только из-за изменения показателя в организме каждого члена группы, но и вследствие изменения состава группы.
Действие рибозы и глутамина на уровень МСМ имеет как сходные черты, так и свои особенности.
0-(-)-рибоза, введенная здоровым животным, не влияет на содержание МСМ в мозге. Об этом свидетельствуют результаты группы "Рибоза", где не было получено различий с контролем ни на одной длине волны (А230 - А300) даже при уровне значимости р<0,1. Но на средний уровень МСМ в группе оживленных крыс рибоза может влиять посредством изменения числа пропусков, вызванных гибелью животных. В группе "Реанимация + Рибоза" не погибло ни одной крысы и, следовательно, у всех крыс был взят мозг для измерения МСМ. А в группе "Реанимация" в течение первых 30 мин после начала оживления погибло 25% крыс, и
уровни МСМ в мозге погибших особей остались неизвестными. Есть основания предполагать (см. выше), что 25% погибших животных имели сравнительно высокие уровни МСМ. Рибоза, способствуя выживанию крыс (благодаря ее воздействию на энергетический обмен, метаболизм пуринов и т.д.), тем самым, вероятно, позволяет дожить до забора мозга особям с высокими концентрациями МСМ, что приводит к некоторому возрастанию среднего уровня МСМ в группе "Реанимация + Рибоза".
L-глутамин в дозе 200 мг х кг-1 массы тела увеличивает содержание МСМ в мозге здоровых животных по сравнению с контролем (см. табл. 1 и 2, группа "Глутамин"). Для объяснения этой находки можно предположить, что L-глутамин, который сам не является оптически активной молекулой в ближней ультрафиолетовой области [31], необходим для синтеза некоторых олигопептидов, входящих в состав МСМ и обладающих оптической активностью благодаря наличию циклических аминокислот и/или вследствие гиперхромных эффектов.
В группе "Реанимация + Глутамин" действия двух факторов - реанимации и глутами-на суммируются, что дает максимальное увеличение уровней МСМ (см. табл. 1 и 2). Еще одним, дополнительным, фактором следует считать влияние глутамина на пропуски в данных, вызванные изучаемой патологией. В группе "Реанимация + Глутамин" в течение первых 30 мин постреанимационного периода погибли, не дожив до забора мозга, 14% крыс. Это лучше, чем в группе "Реанимация", где за тот же срок погибло 25% животных. Мы предполагаем, что глутамин, воздействуя на какие-то иные, чем МСМ, патогенетические механизмы (в частности на биосинтез пуриннуклеотидов), способствует выживанию особей с высокими концентрациями эндотоксинов в мозге, что приводит к еще большему возрастанию среднего уровня МСМ в группе "Реанимация + Глутамин".
У крыс, которых не удалось оживить после 6,5-минутной асфиксии, а также у животных, погибших в постреанимационном периоде, мы не забирали для исследования мозг после их смерти, поскольку в составе МСМ есть очень разные вещества [2, 5-7], в том числе лабильные. Если бы вместо МСМ мы изучали какие-либо ста-
бильные вещества, количество которых в мозге не изменяется во время и после смерти, тогда бы имело смысл измерить их содержание в мозге у погибших особей и сравнить с выжившими, которых мы подвергли эвтаназии. В этом случае удалось бы не предположительно, а совершенно точно установить, какова количественная мера влияния на МСМ пропусков, вызванных гибелью животных от изучаемой патологии.
Другой подход заключается в том, чтобы изучать не мозг, а кровь или иные биоматериалы, которые можно взять у животных (человека) неоднократно. В этом случае можно попытаться установить связь между МСМ и вероятностью различных исходов заболевания. Так, в работе М.А. Ступницького и соавторов [20] измерялись уровни МСМ в плазме крови пациентов в течение 6 сут после тяжелой сочетанной торакальной травмы. Пациенты были разделены на
2 группы: умершие к концу периода исследования, и выздоровевшие. Оказалось, что в группе травмированных людей, которые впоследствии выжили, средний уровень А280 через 3-6 сут после травмы не отличался от контроля (здоровых добровольцев). А в группе пациентов, которым предстояло умереть, средний уровень А280 статистически значимо превышал как уровень контроля, так и среднее значение группы выживших [20]. Однако аналогичное исследование пациентов с острыми отравлениями психотропными препаратами дало иной результат: уровни А280 и А254 в сыворотке крови в течение первых
3 сут после отравления не влияли на последующие шансы людей выжить или умереть [32]. Можно констатировать, что работы [20, 32] и подобные им имеют ограниченную ценность, поскольку они не позволяют понять процессы, происходящие во внутренних органах и приводящие в итоге к столь различным результатам исследования МСМ в крови.
Заметим, что во многих исследованиях, в том числе и в нашем, имеют место еще и случайные пропуски в данных, например, нечаянная утрата отдельных проб биоматериала. Но, чтобы такие пропуски были действительно случайными и не влияли на результаты исследования, следует проводить обработку материала не группа за группой, а вперемешку, в рандомизированном порядке, что мы и делали в нашей работе.
MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES
Заключение
Вследствие клинической смерти и реанимации в головном мозге крыс происходит увеличение концентрации МСМ, указывающее на усиление эндотоксикоза. Внутривенное введение крысам рибозы или глутамина сразу после реанимации не способствует нормализации уровня МСМ в раннем постреанимационном периоде. Из-за гибели части животных от изучаемой патологии возникают пропуски цифровых значений в группах реанимированных крыс. Учет возможного влияния этих пропусков позволяет более корректно интерпретировать полученные результаты.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аксенова В.М., Кузнецов В.Ф., Маслов Ю.Н. и др., Биохимические методы диагностики эндогенной интоксикации. Пермь: Издательство Пермской государственной медицинской академии, 2005. 48 с.
2. Богданов М.В., Воронцова Н.Л., Матвеева В.Г. и др. Динамика показателей окислительного стресса и эндогенной интоксикации в венечном синусе и периферической крови у пациентов с ИБС во время аорто-коронарного шунтирования. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2013; 4: 65-70.
3. Еникеев Д.А., Нургалеева Е.А., Самигуллина А.Ф., Баймурзина Ю.Л. Гипоксия и свободнорадикальное окисление у крыс в постреанимационном периоде. Медицинский вестник Башкортостана. 2007; 2(1): 82-6.
4. Еникеев Д.А., Нургалеева Е.А., Самигуллина А.Ф. и др. Влияние эндогенной интоксикации в постреанимационном периоде на процессы перекисного окисления липидов в эксперименте. Общая реаниматология. 2006; 2(5-6): 111-4.
5. Копытова Т.В., Добротина Н.А., Щелчкова Н.А. Особенности фракции средних молекул у больных тяжелыми хроническими дерматозами. Современные проблемы науки и образования. 2009; (5): 29-31.
6. Малахова М.Я. Лабораторная диагностика эндогенной интоксикации. Медицинские лабораторные технологии. Под ред. А.И. Карпищенко. СПб: Интермедика, 2002. 2. 571-600.
7. Никольская В.А., Лютослав И.С. Изменение уровня молекул средней массы в сыворотке крови и гомо-генате нервной ткани лабораторных животных при воздействии экспериментальной гиперинсулинемии. Ученые записки Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского. Серия: Биология. Химия. 2017; 3(3): 97-104.
8. Семененко М.П., Фомин О.А., Кононенко С.И., Кузь-минова Е.В. Гепатозащитная активность ликверола. Вестник Новосибирского государственного аграрного университета. 2017; 4(45): 116-23.
89
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
9. Шитов А.Ю. Молекулы средней массы как показатель «гипербарической интоксикации» у водолазов. Альманах клинической медицины. 2013; 28: 48-52.
10. Золин П.П. Постреанимационные нарушения обмена гипоксантина и их коррекция: Дис. канд. мед. наук. Омск, 2002. 250 с.
11. Золин П.П., Лебедев В.М., Конвай В.Д. Математическое моделирование биохимических процессов с применением регрессионного анализа: монография. Омск: Издательство Омского государственного университета, 2009. 344 с.
12. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. М.: ГЭО-ТАР-Медиа, 2006. 304 с.
13. Николайчик В.В., Моин В.М., Кирковский В.В. и др. Способ определения «средних молекул». Лабораторное дело. 1991; 10: 13-8.
14. Золин П.П., Конвай В.Д., Домрачев А.А. Фракционирование пуриновых производных в изучении энергетического обмена. Вестник Омского университета. 2017; 1: 65-70.
15. Безручко Н. В., Васильков В. Г., Рубцов Г. К. и др. Биохимическая оценка эндотоксикоза при холецистите по соотношению уровней составляющих пула молекул средней массы в крови и моче. Известия Пензенского государственного педагогического университета имени В.Г. Белинского. 2012; 29: 12-6.
16. Келина Н.Ю., Безручко Н.В., Рубцов Г.К. Параметры биохимической оценки экспозиционного воздействия токсикантов на организм человека. Вестник Московского государственного гуманитарного университета имени М.А. Шолохова. 2012; 2: 115-22.
17. Сычев С.Н., Гаврилина В.А. Применение комбинации «Высокоэффективная жидкостная хроматография - метод главных компонент» для распознавания синдрома эндогенной интоксикации. Часть I. Сорбционные и хроматографические процессы. 2012; 12(5): 814-21.
18. Гордиенко А.И., Химич Н.В., Белоглазов В.А. и др. Характеристика уровня эндогенной интоксикации у пациентов, страдающих метаболическим синдромом в сочетании с кардиоваскулярной патологией. Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. 2012; 2(1-2): 28-30.
19. Бурова О.А., Исаев В.В., Блохин А.А. Эндогенная интоксикация при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят. Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. 2014; 2: 105-8.
20. Ступницький М.А., Жуков В.1., Горбач Т.В. и др. Динамта концентрацй молекул середньоi маси в пащэнпв iз тяжкою поэднаною торакальною травмою в гострому перiодi травматичноi хвороби. Травма. 2014; 15(4): 46-50.
21. Умеров Э. Э. Изменение маркеров эндотоксикоза у больных с трофическими язвами и гнойно-некротическими ранами различного генеза на фоне местной терапии. Актуальнг проблеми сучасно1 медици-ни: В1сник Украгнског медично1 стоматологичног академй. 2013; 13(4): 63-6.
22. Яцинюк Б.Б., Никонова Л.Г., Брусин К.М. Характер изменений веществ низкой и средней молекулярной массы при острых экспериментальных отравлени-
ях верапамилом. Уральский медицинский журнал. 2009; 6: 59-62.
23. Конвай В.Д., Золин П.П. Место острого нарушения пуринового обмена в нозологии. Патогенез и фар-макокоррекция экстремальных и терминальных состояний. Омск, 1995. 24.
24. Zolin P.P., Konvai VD. Disturbances of hypoxanthine metabolism in the liver of resuscitated rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 1997; 124(6): 1180-2.
25. Чигринский Е.А. Антиоксидантная система семенников при физических нагрузках. Saarbrücken: LAP Lambert, 2012. 152 с.
26. Henderson J.F., Paterson A.R.P. Nucleotide metabolism. An introduction. Burlington: Elsevier Science, 2014. 304 p.
27. zur Nedden S. Targeting the purine salvage pathway in in vitro models of cerebral ischemia. Diss. for the degree of doctor of philosophy at university of Warwick. Coventry, 2011. 268 p.
28. Sacerdote M.G., Szostak J.W. Semipermeable lipid bilayers exhibit diastereoselectivity favoring ribose. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005; 102(17): 6004-8.
29. Barsotti C., Ipata P.L. Pathways for alpha-D-ribose utilization for nucleobase salvage and 5-fluorouracil activation in rat brain. Biochem. Pharmacol. 2002; 63(2): 117-22.
30. Золин П.П. Цензурированнные данные и данные с пропусками в медицинских исследованиях. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2010; 4: 49-52.
31. Encyclopedia of spectroscopy and spectrometry. Eds. J.C. Lindon, G.E. Tranter, D.W. Koppenaal. 3rd ed. Amsterdam: Academic Press, 2017:3584.
32. Сыромятникова Е.Д., Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е., Ильяшенко К.К. Информативность альбуминового флуоресцентного теста в раннем реанимационном периоде в оценке прогноза острых отравлений психотропными препаратами. Токсикологический вестник. 2012; 5: 2-5.
REFERENCES
1. Aksenova VM., Kuznetsov V.F., Maslov Yu.N. et al. Biochemical methods for the diagnosis of endogenous intoxication [Biokhimicheskiye metody diagnostiki endogennoy intoksikatsii]. Perm': Izdatel'stvo Permskoy gosudarst-vennoy meditsinskoy akademii, 2005. 48 p. (in Russian)
2. Bogdanov M.V, Vorontsova N.L., Matveeva V.G. et al. Dynamics of indicators of oxidative stress and endogenous intoxication in the coronary sinus and peripheral blood in patients with coronary artery disease during coronary artery bypass surgery. Kompleksnyye proble-my serdechno-sosudistykh zabolevaniy. 2013; 4: 65-70. (in Russian)
3. Enikeev D.A., Nurgaleeva E.A., Samigullina A.F., Bay-murzina Yu.L. Hypoxia and free radical oxidation in rats in the post-resuscitation period. Meditsinskiy vestnik Bashkortostana. 2007; 2(1): 82-6. (in Russian)
4. Enikeev D.A., Nurgaleeva E.A., Samigullina A.F. et al. Influence of endogenous intoxication in the postresus-citation period on lipid peroxidation processes in the experiment. Obshchaya reanimatologiya. 2006; 2(5-6): 111-4. (in Russian)
5. Kopytova T.V, Dobrotina N.A., Schelchkova N.A. Features of the middle molecule fraction in patients with severe chronic dermatosis. Sovremennyye problemy nauki i obrazovaniya. 2009; (5): 29-31. (in Russian)
6. Malakhova M.Ya. Laboratory diagnosis of endogenous intoxication. Medical laboratory technology [Meditsinskiye laboratornyye tekhnologii]. Ed. A.I. Karpischenko. St. Petersburg: Intermedika, 2002. 2. 571-600. (in Russian)
7. Nikolskaya V.A., Lutoslav I.S. Changes in the level of molecules of average weight in serum and homogenate of nervous tissue of laboratory animals when exposed to experimental hyperinsulinemia. Uchenyye zapiski Krymskogo federal'nogo universiteta imeni V.I. Verna-dskogo. Seriya: Biologiya. Khimiya. 2017; 3(3): 97-104. (in Russian)
8. Semenenko MP, Fomin OA, Kononenko S.I., Kuzmino-va E.V. Hepatoprotective activity of liquerol. Vestnik No-vosibirskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2017; 4(45): 116-23. (in Russian)
9. Shitov A.Yu. Average weight molecules as an indicator of "hyperbaric intoxication" among divers. Al'manakh klinicheskoy meditsiny. 2013; 28: 48-52. (in Russian)
10. Zolin P.P. Post-resuscitation disorders of hypoxanthine metabolism and their correction [Postreanimatsionnyye narusheniya obmena gipoksantina i ikh korrektsiya]. Diss. for the degree of doctor of medical sciences. Omsk, 2002. 250 p. (in Russian)
11. Zolin P.P., Lebedev V.M., Konvai V.D. Mathematical modelling of the metabolic processes with the use of regression analysis: monograph [Matematicheskoye modelirovaniye biokhimicheskikh protsessov s primen-eniyem regressionnogo analiza: monografiya]. Omsk: Izdatel'stvo Omskogo gosudarstvennogo universiteta, 2009. 344 p. (in Russian).
12. Sergienko V.I., Bondareva I.B. Mathematical statistics in clinical researches [Matematicheskaya statistika v klinicheskikh issledovaniyakh]. Moscow: GEOTAR-Media, 2006. 304 p. (in Russian)
13. Nikolaychik VV., Moin VM., Kirkovsky V.V. et al. The method of determining the "middle molecules". Labora-tornoye delo. 1991; 10: 13-8. (in Russian)
14. Zolin P.P., Konvai VD., Domrachev A.A. Fractionating of the purine compounds for energy metabolism study. Vest-nik Omskogo Universiteta. 2017; (1): 65-70. (in Russian)
15. Bezruchko N.V., Vasilkov VG., Rubtsov G.K. et al. Biochemical assessment of endotoxicosis in cholecystitis by the ratio of the levels of the components of average weight molecules pool in blood and urine. Izvestiya Penzenskogo gosudarstvennogo pedagogicheskogo universiteta imeni V.G. Belinskogo. 2012; 29: 12-6. (in Russian)
16. Kelina N.Yu., Bezruchko N.V, Rubtsov G.K. Parameters of biochemical evaluation exposure to toxicants on the human body. Vestnik Moskovskogo gosudarstvennogo gumanitarnogo universiteta imeni M.A. Sholokhova. 2012; 2: 115-22. (in Russian)
17. Sychev S.N., Gavrilina VA. The use of the combination "High Performance Liquid Chromatography - Principal Components Method" for the recognition of endogenous syndrome intoxication. Part I. Sorbtsionnyye i khromato-graficheskiyeprotsessy. 2012; 12(5): 814-21. (in Russian)
18. Gordienko A.I., Khimich N.V., Beloglazov V.A. et al. Characteristics of the level of endogenous intoxication
MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES
in patients suffering from metabolic syndrome in combination with cardiovascular pathology. Krymskiy zhur-nal eksperimental'noy i klinicheskoy meditsiny. 2012; 2(1-2): 28-30. (in Russian)
19. Burova O.A., Isaev VV, Blokhin A.A. Endogenous intoxication in gastrointestinal diseases of newborn calves. Voprosy normativno-pravovogo regulirovaniya v veteri-narii. 2014; 2: 105-8. (in Russian)
20. Stupnitsky M.A., Zhukov VI., Gorbach T.V et al. Dynamics of concentration of average weight molecules in patients with severely associated thoracic trauma in the acute period of traumatic disease. Travma. 2014; 15(4): 46-50. (in Ukrainian)
21. Umerov E.E. Changes in endotoxicosis markers in patients with trophic ulcers and gnome-necrotic wounds of varying genesis in the context of local therapy. Aktual'ni problemy suchasnoi medytsyny: Visnyk Ukrainskoi me-dychnoi stomatolohychnoi akademii. 2013; 13(4): 63-6. (in Russian)
22. Yatsukiuk B.B., Nikonova L.G., Brusin K.M. The nature of changes in substances of low and medium molecular weight in acute experimental poisoning with verapamil. Ural'skiymeditsinskiyzhurnal. 2009; 6: 59-62. (in Russian)
23. Konvai VD., Zolin P.P. The place of acute disturbance of purine metabolism in nosology. Pathogenesis and pharmacocorrection of extreme and terminal states [Patogenez i farmakokorrektsiya ekstremal'nykh i terminal'nykh sostoyaniy]. Omsk, 1995. 24. (in Russian)
24. Zolin P.P., Konvai V.D. Disturbances of hypoxanthine metabolism in the liver of resuscitated rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 1997; 124(6): 1180-2.
25. Chigrinskiy E.A. Antioxidant System in Testes at Physical Exercise [Antioksidantnaya sistema semennikov pri fizicheskikh nagruzkakh]. Saarbrücken: LAP Lambert, 2012. 152 с. (in Russian)
26. Henderson J.F., Paterson A.R.P. Nucleotide metabolism. An introduction. Burlington: Elsevier Science, 2014. 304 p.
27. zur Nedden S. Targeting the purine salvage pathway in in vitro models of cerebral ischemia. Diss. for the degree of doctor of philosophy at university of Warwick. Coventry, 2011. 268 p.
28. Sacerdote M.G., Szostak J.W. Semipermeable lipid bi-layers exhibit diastereoselectivity favoring ribose. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005; 102(17): 6004-8.
29. Barsotti C., Ipata P.L. Pathways for alpha-D-ribose utilization for nucleobase salvage and 5-fluorouracil activation in rat brain. Biochem. Pharmacol. 2002; 63(2): 117-22.
30. Zolin P.P. Censored data and missing data in medical researches. Patologicheskaya fiziologiya i eksperimen-tal'naya terapiya. 2010; (4): 49-52. (in Russian)
31. Encyclopedia of spectroscopy and spectrometry. Eds. J.C. Lindon, G.E. Tranter, D.W. Koppenaal. 3rd ed. Amsterdam: Academic Press, 2017. 3584 p.
32. Syromyatnikova E.D., Gryzunov Yu.A., Dobretsov G.E., Ilyashenko K.K. Informativeness of the albumin fluorescent test in the early resuscitation period in the evaluation of the forecast of acute poisoning with psychotropic drugs. Toksikologicheskiy vestnik. 2012; 5: 2-5. (in Russian)
Поступила 21 декабря 2018 Принята в печать 21 февраля 2019
